Summary
Vi beskriver en uppsättning av analyser för att analysera expressionsnivåer av histoner H1 linker. mRNA av enskilda H1 gener kvantitativt mäts genom slumpmässig primer omvänd transkription följt av realtids-PCR, medan protein kvantifiering av H1 histoner uppnås genom HPLC-analys.
Abstract
Linker histon H1 binder till nukleosomen kärnan partikel-och linker-DNA, vilket underlättar vikning av kromatin i högre ordningens struktur. H1 är en förutsättning för däggdjurens utveckling 1 och reglerar genuttryck in vivo 2-4. Bland de högkonserverade histonproteiner är familjen H1 länkare histoner mest heterogen grupp. Det finns 11 H1 subtyper i däggdjur som är differentiellt reglerade under utveckling och i olika celltyper. Dessa H1 subtyper inkluderar 5 somatisk H1S (H1A-e), ersättning H1 0, 4 könsceller specifika subtyper H1 och H1x 5. Närvaron av flera H1 subtyper som skiljer i DNA bindningsaffinitet och kromatin packning förmåga 6-9 ger en extra nivå av modulering av kromatin funktion. Således är kvantitativt uttryck analys av enskilda H1 subtyper, både mRNA och proteiner, som är nödvändiga för bättre förståelse av regleringen av högreFör kromatin struktur och funktion.
Här beskriver vi en uppsättning av analyser utformade för att analysera de expressionsnivåer av individuella H1 subtyper (figur 1). mRNA uttryck av olika gener H1 variant mäts av en uppsättning av mycket känsliga och kvantitativ omvänd transkription-PCR (QRT-PCR) analyser, som är snabbare, mer exakt och kräver mycket mindre prover jämfört med den alternativa synsätt Northern blot analys. Skillnad från de flesta andra cellulära mRNA-meddelanden, mRNA för de flesta histon gener, inklusive de flesta H1 gener, saknar en lång polyA-svans, men innehåller en stam-slingstruktur vid 3 'otranslaterade regionen (UTR) 10. Därför cDNA framställdes från totalt RNA genom omvänd transkription med användning av slumpmässiga primrar istället för oligo-dT-primrar. Realtid PCR-analyser med primrar som är specifika för vardera H1 subtyper (tabell 1) utförs för att erhålla hög grad kvantitativ mätning av mRNA-nivåer av individuella H1 subtyps. Uttryck av housekeeping gener analyseras som kontroller för normalisering.
Den relativa förekomsten av proteiner av varje subtyp H1 och histoner centrala erhålles genom omvänd fas högpresterande vätskekromatografi (RP-HPLC)-analys av totala histoner extraherade från däggdjursceller 11-13. HPLC metod och elueringsbetingelser beskrivs här ger optimala separationer av subtyp mus H1. Genom att kvantifiera HPLC-profilen, beräknar vi den relativa andelen av enskilda H1 subtyper inom H1 familjen, samt bestämma H1 till nukleosomen förhållandet i cellerna.
Protocol
1. Provberedning och RNA Extraction
- Före RNA-extraktion, bör alla arbetsytor och pipetter torkas med 70% etanol och behandlades med RNas dekontamineringslösning, såsom RNase Zap. Denna praxis minskar risken för RNas kontaminering och RNA-nedbrytning. Använd handskar för alla förfaranden.
- Att extrahera RNA från mus vävnad, dissekera organ av intresse från avlivades musen och tvätta den vävnad i iskall fosfatbuffrad saltlösning (PBS: 0,13 M NaCl, 5 mM Dinatriumvätefosfatheptahydrat, 5 mM natriumdivätefosfat heptahydrat, pH 7,4) . Omedelbart gå till RNA extraktion i steg 1,4. Om färsk vävnad inte skall bearbetas för RNA-extraktion, bör de vävnadsprover vara snabbfrystes i flytande kväve omedelbart och lagras vid -80 ° C för senare användning.
- Om RNA skall extraheras från vidhäftande cellkultur, aspirera kultur media, skölj med tillräcklig mängd PBS och tillsätt Trizol Reagent (in vitrogen) på plattan och fortsätt till steg 1,4. För celler odlade i suspension, skörda cellerna och Pelletera celler genom centrifugering. Kassera medier, skölj pelleten försiktigt med PBS, och pelletera cellerna med centrifugering. Lägg Trizol Reagens och fortsätt till steg 1,4.
- Tillräckligt Trizol Reagens är nödvändigt för att uppnå hög kvalitet RNA. Använda 1 ml Trizol-reagens för att extrahera RNA från 50 till 100 mg vävnad, 5 - 10 x 10 6 celler (för suspensionsodlingar) eller per 3,5 cm platta (för adherenta kulturer). Homogenisera vävnaden i Trizol-reagens med Polytron PT2100 homogenisator (eller motsvarande). Fortsätt att utvinna RNA från vävnadsprover eller celler i enlighet med tillverkarens bruksanvisning för Trizol Reagent (Invitrogen).
- RNA-koncentrationen mäts med användning NanoDrop 1000 (Thermo Scientific) och RNA-kvaliteten analyseras med gelelektrofores. De typiska avkastningsintervaller från 1-10 ng RNA per mg vävnad eller 5-15 pg RNA per 1 x 10 6 odlade celler. För att eliminerapotentiell kontaminering av RNA från spårmängd av genomiskt DNA, är RNA-prover behandlades med RNas-fritt DNas (Sigma AMP-D1) enligt tillverkarens instruktioner. Upprepa RNA-koncentrationen beslutsamhet och gelelektrofores för att säkerställa att ingen nedbrytning av RNA från denna behandling. Lagra extraherades RNA vid -80 ° C.
* Not: RNA kan även extraheras med användning av RNAeasy kit (Qiagen) enligt kitet manuell, eller genom DNA / RNA-kitet (Qiagen) om både DNA och RNA är önskvärda.
2. Kvantitativ omvänd transkription-PCR (QRT-PCR)
- Totalt RNA transkriberades omvänt till cDNA med användning av Superscript III Första strängsyntes System (Invitrogen). Eftersom mRNA för de flesta H1 gener saknar poly-A-svansar, är det viktigt att använda slumpmässiga hexamerer i stället för oligo-dT som primer för cDNA-syntes. Om emellertid expressionsanalys av gener med polyadenylerade meddelanden vid låga nivåer är också önskvärt, en blandning av slumpmässiga hexamerer och oligo-dT-ShouLD användas i omvänd transkription (RT) reaktion för att förbättra den omvända transkriptionen effektivitet polyadenylerade mRNA.
- Utför RT-reaktionen enligt tillverkarens bruksanvisning. Kortfattat
- I en 0,5 ml PCR-rör, kombinera 5 ^ g totalt RNA, 1 pl av 50 ng / | il slumpmässiga hexamerer, 1 pl av 10 mM dNTP-blandning, och tillsätt DEPC-behandlat H2O till en total reaktionsvolym som 10 | il. Blanda väl och inkubera under 5 minuter vid 65 ° C, följt av 1 min inkubation på is.
- Framställ 10 pl av cDNA-syntes-blandning: 2 pl av 10xRT buffert, 4 fil av 25 mM MgCl2, 2 pl av 0,1 M DTT, 1 | il av RNaseOut (40 U / fil), 1 pl av SuperScript III RT (200 U / pl) och lägga till RNA / primer blandning.
- Inkubera under 10 minuter vid 25 ° C, följt av 50 minuter vid 50 ° C och avsluta reaktionen vid 85 ° C under 5 minuter.
- Varje reaktion ger typiskt 100-250 ng / | il av cDNA-produkten. Lagra cDNA-produkter vid -20° C eller omedelbart gå för real-time kvantitativ PCR (qPCR).
- qPCR kan exakt kvantifiera kopior målsekvensen med hög effektivitet och reproducerbarhet 14. Vi väljer qPCR mätt genom SYBR Green färgämne, vilket ger en fluorescerande signal, endast när det interkalerar med dubbelsträngat DNA (dsDNA). Även om inte lika specifik som Taqman analys 14, är denna metod mer kostnadseffektivt och enklare att antas i laboratoriet, och ger mer flexibilitet för att qPCR. Därför är det viktigt att undersöka amplifiering kurva (Fig. 2A) och de härledda kurvorna smältpunkterna för den qPCR produkten (figur 2B) för att säkerställa reaktionens effektivitet och specificitet.
| Histon-subtyper | Mus histon nomenklatur | Human histon nomenklatur | ||
| GEne namn | Accessionsnr. | Gen namn | Accessionsnr. | |
| Histon H1A | Hist1h1a | NM_030609 | HIST1H1A (H1.1) | NM_005325 |
| Histon H1B | Hist1h1b | NM_020034 | HIST1H1B (H1.5) | NM_005322 |
| Histon H1c | Hist1h1c | NM_015786 | HIST1H1C (H1.2) | NM_005319 |
| Histon H1d | Hist1h1d | NM_145713 | HIST1H1D (H1.3) | NM_005320 |
| Histon H1E | Hist1h1e | NM_015787 | HIST1H1E (H1.4) | NM_005321 |
| Histon H1 ° | H1f0 | NM_008197 | H1F0 | NM_005318 |
| Histon H1oo | H1foo | NM_183811 | H1FOO | NM_153833 |
| Histon H1t | Hist1h1t | NM_010377 | HIST1H1T | NM_005323 |
| Histon H1t2 | H1fnt | NM_027304 | H1FNT | NM_181788 |
| Histon H1x | H1fx | NM_198622 | H1FX | NM_006026 |
| Histon Hils1 | Hils1 | NM_081792 | HILS1 | AY286318 |
Tabell 1. Histon H1 subtyp nomenklatur mus och människa.
- Konstruktion framåt och bakåt PCR-primrar specifika för varje H1-genen (Tabell 1). Beroende på den höga sekvenslikhet mellan somatiska H1S, särskilt i regionen som motsvarar den centrala globulära domänen, är det kritiskt att säkerställa att de primrar som är utformade för en specifik subtyp H1 inte inriktas med ondra H1 gener, eller korsreferenser förstärker andra H1 subtyper. Det är också viktigt att notera att de flesta H1 gener inte innehåller introner. Således intron-spänner primers normalt antagits för RT-PCR för att undvika genomisk kontaminering inte är tillgängliga. I stället bör RNA-prover kan förbehandlas med DNas (se 1.5) för att eliminera eventuella spårmängder av genomiskt kontaminering. Dessutom, RT (-) bör-qPCR utföras parallellt för att verifiera att det saknas genomiskt kontaminering i de cDNA-prover.
- Även utformning primers för interna referens gener, vars uttryck ändras inte hos prover. Ofta housekeeping-gener, såsom glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas (GAPDH) och beta-aktingener, väljs som referens gener. qPCR signaler housekeeping gener fungerar som normalisering kontroller.
- Framställ varje PCR-reaktion (total volym 25 | il) enligt följande: 12,5 | il 2x IQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) (innehållande dNTP, 50 U / ml iTaq DNA-polymeras, 6 mM MgCl2, SYBR Green I och 20nM fluorescein), 2 pl av 4 ng / pl cDNA, 1,25 pl 10 nM framåt / bakåt primer, och 9,25 pl av Ddh 2 O och blanda väl i Microseal 96-brunnars PCR-platta. Använda Microseal "B" Adhesiva Tätningar (Bio-rad) för att säkerställa att plattan är förseglad till plattan. Knackar eller kort virvel PCR plattan och centrifugera ner reaktionsblandningarna genom en kort centrifugering. Placera plattan i MyIQ Single Color realtids-PCR Detection System (Bio-Rad) för qPCR.
- Vi använder följande qPCR betingelser: 95 ° C under 3 minuter, följt av 40 cykler av 95 ° C under 10 sekunder, 60 ° C under 20 sekunder, 72 ° C under 30 sekunder. Undersöka amplifieringskurvor (figur 2A) för PCR-effektivitet och Ct (tröskel av cykeln)-värden. Tröskeln linjen kan automatiskt av IQ5 Optiska systemprogramvaran version 2,0.
- Primern effektivitet och optimala cDNA-koncentration som behövs kan testas genom en standardkurva analys i vilket en serieutspädning av genomiskt DNA is används för qPCR och CT-värden plottas mot logaritmen av templat-DNA belopp. En optimerad qPCR analys med primers med hög specificitet och effektivitet kommer att ge en linjär standardkurva, med determinationskoefficienten (R 2)> 0,98. Undvika primrar med amplikon längd som är längre än 200 bp, som tenderar att ha dålig amplifieringseffektiviteten.
- Eftersom SYBR Green upptäcker dsDNA, är det viktigt att utföra en körning smältkurva efter qPCR att säkerställa att den önskade amplikon, men inte primerdimerer eller föroreningar, förstärks och detekteras. För smält-kurvan analys programmera qPCR instrumentet för att värma de prover från 55 ° C till 95 ° C i 0,5 ° C steg med datainsamling. Standardinställningen för smält-kurvan analys för MyIQ (Bio-Rad) instrument är följande: 95 ° C under 1 minut, 55 ° C under 1 minut, följt av 81 cykler av 10 sekunder vid börvärdet 55 ° C, smälta kurva, + temp 0,5 ° C (kamera samlar in data vid varje cykel).
- Eftersom smälttemperatur (Tm) av dsDNA är beroende av amplikon längd och GC-halt, kommer olika amplikoner har olika Tm (er). Undersök derivat smältkurvor av qPCR produkterna för att bekräfta den specifika smälttemperatur önskade amplikoner liksom avsaknaden av topparna buller amplicon (Figur 2B).
- Förbered dubbel eller tredubbel reaktioner för varje analys för statistisk analys. Innefattar negativa kontroller för QRT-PCR, såsom RT (-)-qPCR (qPCR med RNA som mall utan omvänd transkription) och qPCR utan cDNA, RNA eller DNA källa tillsattes i PCR-blandningen. RT (-)-qPCR kan tjäna som kontroll för potentiell genomisk DNA-kontaminering (RT (-) i fig. 2 och 3).
- Analysera qPCR data med IQ5 Optical System Software version 2,0 (Bio-Rad). Normalisera expressionsvärden för H1-isoformen gener med uttrycket av housekeeping-genen (t ex GAPDH, beta-aktin, HPRT) för att erhålla relativa expressionsnivåerna av H1 gener.
* Alla bör utföras på is eller vid 4 ° C.
- Dissekera musen vävnad och skölj den med iskall PBS. (Om inte fortsätter till extraktion omedelbart snäppa frysa och lagra proverna såsom beskrivs i steg 1.2.) Mal vävnaden i stycken med rakblad. Överföra mala till en Dounce-homogenisator (B mortelstöt). Tillsätt 10 ml Buffert Sackaros (0,3 M sackaros, 15 mM NaCl, 10 mM HEPES [pH 7,9], 2 mM EDTA, 0,5 mM PMSF, Complete mini proteasinhibitorcocktail Tablett, tillsätt färsk) per gram vävnad. Homogenisera vävnaden med 10-15 slag.
- Överföra homogenaten till en 15 ml tub, centrifugera vid 500 rpm under 30 sekunder centrifug modell: Eppendorf 5810R); noggrant överföra supernatanten till ett nytt rör (kassera pellet-vävnadsrester) och centrifugera vid 2000 rpm under 5 minuter, för att pelletera cellerna. Gå vidare till steg 3,4.
- Om histoner och kromatin ska extraheras från celler som odlas i monoskikt, sköljmed PBS, tillsätt PBS till odlingsskålen, och skörda cellerna med användning av cellskrapa och Pelletera celler genom centrifugering. För celler odlade i suspension, Pelletera celler genom centrifugering.
- Resuspendera cellpelleten i 10 ml sackaros-buffert kompletterad med 0,5% NP-40 (per gram vävnad börjar mängden eller 10 (8) celler). Överför provet till en Dounce homogeniseringsanordning (B stöt) och Dounce 10 slag inom 20 minuters inkubation. Vid denna punkt är kärnor erhålles. Undersök kärnorna kvalitet under ett mikroskop. Pelleten kärnorna genom centrifugering vid 2000 rpm under 5 minuter. Kasta bort supernatanten.
- Resuspendera pelleten kärnorna i 3 ml buffert med hög salthalt (0,35 M KCl, 10 mM Tris [pH 7,2], 5 mM MgCl2, 0,5 mM PMSF - tillsätt färsk före varje användning) per 1 g vävnad eller 10 (8)-celler. Överföra provet till en liten Dounce-homogenisator (B stöt) och homogenisera med 5-10 slag.
- Alikvot av suspensionen i 3 Eppendorf-rör (1 ml vardera), inkubera på is under 20 minuter, följt avcentrifugering vid 14.000 rpm under 10 minuter för att pelletera kromatin. Kasta bort supernatanten.
- Tillsätt 0,8 ml 0,2 NH 2 SO 4 till varje kromatin pellet. Använd en Eppendorf-rör mortelstöt Dounce att slipa pelleten väl tills pelleten är helt dissocierad. Inkubera proverna på en roterande plattform vid 4 ° C över natten. Totalt histoner extraheras med det här steget av syrabehandling.
- Centrifugera vid 14000 rpm under 10 minuter. Överför supernatanten (histon extrakt) i två Eppendorf-rör (400 | il / rör). Kasta pelleten. Tillsätt 2,5 volymer (1 ml) av iskall etanol till varje rör .. Hålla proverna vid -20 ° C över natten.
- Centrifugera vid 14000 rpm under 10 minuter för att pelletera de totala histoner, kasta supernatanten. Tvätta pellets tre gånger med 70% EtOH, lämna på bänken i 20-30 minuter lufttorka. Lagra de torkade proteiner vid -80 ° C eller lösas i ddHaO 2 O och fortsätt att HPLC-analys omedelbart. Torkade proteiner kan lagrasvid -80 ° C under upp till 1 år.
4. HPLC-analys av Linker Histoner
- Resuspendera pelleten histon i den rekommenderade mängden av Ddh 2 O beroende på kapaciteten av omvänd fas-kolonn och HPLC-instrument. Vi använder C18 omvänd fas kolonn 250 x 4,6 mm (Vydac) och Äktapurifier UPC 900 instrument (GE vård) för HPLC-analys. Vi upplösa typiskt 50-100 ^ g av total-histoner i 100 | il av Ddh 2 0 för analys.
- Centrifugera vid 14000 rpm under 5 minuter för att avlägsna olösliga rester. Bradford protein assay används för att bestämma mängden protein som skall injiceras i kolonnen. Injicera 50-100 pg av totalt protein i det omvända-fas-kolonn på HPLC-systemet. Lastning en överskottsmängd av proteinet bör undvikas för att förhindra igensättning av kolonnen.
- Fraktionera de länkande histonerna och histoner kärna med en ökande acetonitrilgradient listas i tabell 2.
Tabell 2. Ökande acetonitrilgradient över tiden.
- Effluenten övervakas vid 214 nm och HPLC-profiler (FIGURe 4) registreras och analyseras med hjälp Äktapurifier UPC 900 (GE Healthcare) med UNICORN 5,11 programvara (GE Healthcare). De proteinfraktioner kan också uppsamlas med fraktion automatisk kollektor (Frac-920 - GE) för ytterligare analys, t ex SDS-PAGE och masspektrometri.
- A 214 värden på topparna på varje H1 subtyp och H2B är normaliserade med antalet peptidbindningar för varje motsvarande histon-protein. Den relativa andelen av enskilda H1 histon subtyper inom H1 familjen, liksom förhållandet mellan H1 subtyper av nukleosomen kärnpartiklar kan beräknas från dessa normaliserade A 214 värden (Figur 5).
5. Representativa resultat
Listan av däggdjurs H1-subtyper, total flödesscheman och resultat är representativa för expression analys av individuella histon H1-gener visas i tabell 1, fig. 1 och fig. 2-5, respektive.Figur 2A visar typiska amplifieringskurvor av H1A qPCR reaktioner med användning av cDNA framställt från muslever, och mESCs, medan figur 2B visar de härledda smältkurvor för motsvarande amplikonema. Smält-kurvan visar en enda karakteristisk topp vid smälttemperaturen (Tm) vid 86 ° C för H1A PCR-amplikon, och saknar icke-specifik bakgrund toppar, vilket tyder på hög specificitet H1A qPCR analys. Utvärdering av amplifiering kurva (Fig. 2A) visar att de trefaldiga qPCR reaktioner för varje prov gav fortlöpande signaler med nästan identiska Ct-värden, vilket tyder på hög reproducerbarhet. Bristen på amplikoner bygga upp från RT (-)-qPCR reaktioner tyder på att DNA kontaminering inte var närvarande eller minimal. Att utnyttja de Ct-värdena H1 gener och gener housekeeping, såsom GAPDH, var de relativa RNA-expressionsnivåer av varje H1-genen beräknas. Exempel på de beräknade resultaten för H1 ° och H1A gener visas i Skillnaden i expression av H1A eller H1 ° i förhållande till Mesc vuxen muslever är också uppenbart från HPLC-profiler för histonproteiner (figur 4). H1 °, differentieringen specifika H1, ackumuleras till en stor mängd i mogna vävnader, står för 27,2% av den totala H1 i vuxen lever (Figur 5A). I motsats härtill är H1 ° proteinet nästan frånvarande i odifferentierade mESCs (figur 4B). Å andra sidan är H1A hög grad uttryckt i både mRNA-transkript och proteiner, i mESCs (figur 3 och 4B). Genom kvantifiering av H1 toppar i HPLC-profilen, den relativa andelen av varje enskild H1 subtyp inom H1 familjen bestäms (Figur 5A). Dessutom är värdena enskilda H1 subtyp (ellertotalt H1) per nukleosom kan beräknas genom förhållandet av den normaliserade A 214 toppvärde motsvarande H1 subtyper (eller summan av den totala H1) till hälften av den normaliserade A 214 värden för H2B (figur 5B). 
Figur 1. Systematiken uttryck analys av däggdjurs-länk-histon subtyper. 
Figur 2. Representativa resultat av H1A qPCR analys. (A) Amplifiering plot av H1A qPCR analys. Tröskeln linjen och Ct-värden som fastställts av IQ5 Optical System Software anges. (B) Derivat smälter-kurvor för qPCR produkter som visas i (A). 
Figur 3. QRT-PCR-analys av mRNA-nivåer av H1A och H1 ° i mESCs och vuxna mOuse levern. Y-axeln representerar relativa expressionsnivåerna för H1 gener med den för referens-genen GAPDH. qPCR med RT (-) prov (RNA utan omvänd transkription) visar minimala eller inga signaler. 
Figur 4. HPLC-analys av histoner extraherade från däggdjursceller. Omvänd fas HPLC-analys av 100 | ig total-histoner extraherade från vuxen muslever (A) och från mus ESC (B). X-axel: elueringstid. Y-axel: mAU, milli-absorberande enheter. 
Figur 5. H1 subtyp sammansättning och H1 per nukleosomen förhållanden i vuxen mus levern. A 214 värdena på toppytan för varje H1-isoformen och H2B beräknas med användning UNICORN 5,11 mjukvara (GE Healthcare) och normaliserades med antalet peptid-bindningar som föreligger i motsvarande histon-proteinet. Summan av normaliserade A214 värden för alla H1 subtyper erhålls som värdet för total H1. Andelen av den totala H1 för varje H1 subtyp (A) såväl som förhållandet mellan H1 till nukleosom (representerad av en halva av den normaliserade A 214 värden av H2B) (B) i vuxen mus levern är beräknade från den som visas HPLC-profilen i fig. 4A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Uppsättningen av analyser presenteras här medge detaljerade analyser av uttrycket nivåerna av däggdjur länkare histon subtyper. Rätt utformade QRT-PCR-analyser ger mycket känsliga och noggranna mätningar av RNA meddelanden från alla däggdjur histon H1 gener. Den kritiska delen av QRT-PCR-analyser för länkare histon subtyp gener är framställning av cDNA med slumpmässig primer baserad omvänd transkription. mRNA av de flesta histon gener, inklusive de flesta H1 gener, innehåller inte en lång poly-A svans som presenteras i andra cellulära mRNA. Således traditionella omvänd transkription metod med oligo-dT primers kommer inte att effektivt producera H1 cDNA. Expressionsanalys av de få H1-generna med mRNA-transkript som innehåller poly-A-svansar, såsom H1 0, är lika effektiv med slumpmässiga hexamerer baserat QRT-PCR (figur 3), förmodligen på grund av den höga förekomsten av H1-RNA. Icke desto mindre en blandning av oligo-dT-primers och de slumpmässiga hexamerer för RT reaktion kan vidtas för att öka RT effektivisera polyadenylerat mRNA som är av lågt antal kopior, vilket bredare täckning av gener analyserades med QRT-PCR. QRT-PCR av interna referens gener, såsom housekeeping gen GAPDH, ingår, så att den relativa expressionsnivån av specifika H1 gener i olika vävnader eller celltyper kan jämföras (figur 3). Genom att kombinera QRT-PCR med standardkurvan analys är det också möjligt att erhålla absoluta kopietal av H1 cDNA från olika prover (data ej visade).
Här beskriver vi också protokoll för histon extraktion och HPLC-analys av histonproteiner. Fördelen med denna metod är att man kan bestämma de relativa proportionerna av varje H1 subtyp inom poolen av totala H1 proteiner såväl som kvantifiera förhållandet individuella H1 subtyp (och den totala H1) per nukleosom. Dessutom, jämfört med andra metoder proteinanalys, såsom Western blotting, med HPLC-analys prohandahåller mer kvantitativa och reproducerbara mätningar av alla H1 subtyper. De olika nivåer och sammansättning H1 subtyper i cellen modulera högre struktur ordning kromatin. Förhållandet mellan H1 till nukleosomen har visat sig korrelera med kromatin komprimering och är en faktor för nukleosomen upprepa längd i kromatin 2. Därför bör de metoder vi beskrivit här har breda tillämpningar inom kromatin forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av NIH bidrag GM085261 och Georgia Cancer Coalition Distinguished Scholar Award (till YF).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNase Zap | Applied Biosystems | AM9780 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-018 | |
| SuperScriptIII | Invitrogen | 18080-051 | |
| Absolute Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 | |
| IQ SYBR Green | Bio-Rad | 170-8880 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | AMP-D1 | |
| Microseal 96-well PCR plate | Bio-Rad | MSP-9605 | |
| Microseal ’B’ Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| Sucrose | Acros Organics | AC40594 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP332 | |
| Sodium chloride (NaCl) | American Bioanalytical | AB01915 | |
| Sodium dihydrogen phosphate heptahydrate (NaH2PO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP-330 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| Complete Mini proteinase inhibitor cocktail tablet | Roche Group | 11836153001 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E-5134 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | American Bioanalytical | AB01620 | |
| Nonidet-40 (NP-40) | American Bioanalytical | AB01425 | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366 | |
| Tris [hydroxymethyl aminomethane] | American Bioanalytical | AB02000 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) | VWR international | VW3648-3 | |
| Ammonium hydroxide (NH4OH) | Acros Organics | AC42330 | |
| Bradford Protein Assay | Bio-Rad | 500-0001 | |
| Acetonitrile | EMD Millipore | AX0145-1 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | JT Baker | 9470-01 |
References
- Fan, Y. H1 linker histones are essential for mouse development and affect nucleosome spacing in vivo. Mol. Cell Biol. 23, 4559-4572 (2003).
- Woodcock, C. L., Skoultchi, A. I., Fan, Y. Role of linker histone in chromatin structure and function: H1 stoichiometry and nucleosome repeat length. Chromosome Res. 14, 17-25 (2006).
- Shen, X., Gorovsky, M. A. Linker histone H1 regulates specific gene expression but not global transcription in vivo. Cell. 86, 475-483 (1996).
- Alami, R. Mammalian linker-histone subtypes differentially affect gene expression in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 5920-5925 (2003).
- Happel, N., Doenecke, D. Histone H1 and its isoforms: contribution to chromatin structure and function. Gene. 431, 1-12 (2009).
- Clausell, J., Happel, N., Hale, T. K., Doenecke, D., Beato, M. Histone H1 subtypes differentially modulate chromatin condensation without preventing ATP-dependent remodeling by SWI/SNF or NURF. PLoS One. 4, 0007243-0007243 (2009).
- Khadake, J. R., Rao, M. R. DNA- chromatin-condensing properties of rat testes H1a and H1t compared to those of rat liver H1bdec; H1t is a poor condenser of chromatin. Biochemistry. 34, 15792-15801 (1995).
- Orrego, M. Differential affinity of mammalian histone H1 somatic subtypes for DNA and chromatin. BMC Biol. 5, 22-22 (2007).
- Th'ng, J. P., Sung, R., Ye, M., Hendzel, M. J. H1 family histones in the nucleus. Control of binding and localization by the C-terminal domain. J. Biol. Chem. 280, 27809-27814 (2005).
- Wang, Z. F., Sirotkin, A. M., Buchold, G. M., Skoultchi, A. I., Marzluff, W. F. The mouse histone H1 genes: gene organization and differential regulation. J. Mol. Biol. 271, 124-138 (1997).
- Brown, D. T., Sittman, D. B. Identification through overexpression and tagging of the variant type of the mouse H1e and H1c genes. J. Biol. Chem. 268, 713-718 (1993).
- Fan, Y., Sirotkin, A., Russell, R. G., Ayala, J., Skoultchi, A. I. Individual somatic H1 subtypes are dispensable for mouse development even in mice lacking the H1(0) replacement subtype. Mol. Cell. Biol. 21, 7933-7943 (2001).
- Fan, Y., Skoultchi, A. I. Genetic analysis of H1 linker histone subtypes and their functions in mice. Methods Enzymol. 377, 85-107 (2004).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M.
