Summary
Biz H1 bağlayıcı histonlarının ekspresyon düzeyleri analiz testleri bir dizi açıklar. H1 histon protein miktarının HPLC analizi ile elde edilir ise bireysel H1 genlerin mRNA kantitatif gerçek zamanlı PCR ile takip rastgele astar göre ters transkripsiyon ile ölçülür.
Abstract
Linker histon H1 yüksek mertebeden yapıya kromatin katlama kolaylaştırılması, nükleozom temel parçacık ve bağlayıcı DNA'ya bağlanır. H1 memeli gelişimi 1 için gereklidir ve in vivo 2-4 spesifik gen ekspresyonunu düzenler. Ölçüde korunmuş histon proteinler arasında, H1 bağlayıcı histonlarının ailesinin en heterojen bir gruptur. Ayirt geliştirme sırasında ve farklı hücre tipleri düzenlenmiştir memelilerde 11 H1 alt tipi vardır. Bunlar, H1 alt türleri 5 somatik H1S (H1A-e), değiştirilmesi H1 0, 4 mikrop hücre özel H1 alt türleri ve H1x 5 içerir. DNA bağlanma afinitesi ve kromatin sıkıştırma yeteneği 6-9 farklı birden fazla H1 alt tiplerinin varlığı kromatin fonksiyonu modülasyonu ek bir düzeyi sağlar. Böylece, mRNA ve protein hem bireysel H1 alt tiplerinin kantitatif ekspresyon analizi, yüksek düzenlenmesinde daha iyi anlaşılması için gerekli olansipariş kromatin yapısı ve fonksiyonu.
Burada tek tek H1 alt tiplerinin ifade seviyeleri (Şekil 1) analiz etmek için tasarlanmıştır deneyleri, bir dizi açıklanmaktadır. Çeşitli H1 varyantı genlerin ekspresyonunu daha doğru, hızlı ve Northern blot analizi alternatif bir yaklaşım ile karşılaştırıldığında çok daha az örnekleri gerektiren son derece hassas ve nicel ters transkripsiyon-PCR (QRT-PCR) deneyleri, bir dizi ile ölçülür. Diğer birçok hücresel mRNA mesajları aksine, H1 genlerin çoğu dahil olmak üzere en histon genler, mRNA'lar için uzun bir polyA sahip değildir, ama 3 'tercüme edilmemiş bölgesinin (UTR) 10 azından bir kök döngülü yapısını içermektedir. Bu nedenle, cDNAlann yerine oligo-dT primerlerin rastgele primerler kullanılarak, ters transkriptaz toplam RNA ile hazırlanır. Her H1 alt tipleri (Tablo 1) spesifik primerler Realtime PCR bireysel H1 alt mRNA düzeylerinin oldukça yüksek kantitatif ölçümü elde etmek için yapılırs. Housekeeping gen ekspresyonu normalleşmesi için kontrol olarak analiz edilir.
Her bir alt tipi H1 ve çekirdek histonlarının proteinlerin nispi bolluk 11-13 memeli hücreleri elde toplam histonlarının ters faz yüksek performanslı sıvı kromatografi (RP-HPLC) analizi ile elde edilir. HPLC yöntemi ve çıkma koşulları burada fare H1 alt optimum ayrımlarını verir nitelendirdi. HPLC profili miktarının, biz de hücrelerde nükleozom oranı H1 belirlemek olarak, H1, aile içinde bireysel H1 alt tiplerinin nispi hesaplayabilirsiniz.
Protocol
1. Numune Hazırlama ve RNA Ekstraksiyon
- RNA ekstraksiyonu önce, tüm çalışma yüzeyleri ve pipetler% 70 etanol ile silinmelidir ve bu RNaz Zap gibi RNaz dekontaminasyon solüsyonu ile muamele edilir. Bu uygulama RNaz kirlenme ve RNA bozulma şansını azaltır. Tüm prosedürler için eldiven giyin.
- Fare dokudan RNA elde etmek için, ötenazi fareden ilgi organı incelemek ve buzla soğutulmuş fosfat içinde doku yıkayıp (PBS: 0.13 M NaCl, 5 mM sodyum fosfat dibazik heptahidrat, 5 mM sodyum dihidrojen fosfat heptahidrat, pH 7.4) Tamponlu Salin . Adım 1.4 ekstraksiyon RNA hemen geçin. Taze doku RNA özütleme için işlenecek değilse, doku örneklerinin hemen sıvı azot içinde donmuş ek olmalıdır ve ° C daha sonra kullanım için -80 saklanabilir.
- RNA yapışık hücre kültürü elde edilmesi ise, medya, kültür aspire PBS yeterli miktarda ile yıkayın ve (İnvitro Trizol Reaktif ekleyintabağa gen) ve 1.4 adıma geçin. Süspansiyon yetiştirilen hücreleri için, hücreler santrifüjle ve pellet hücreler hasat. , Medya atın PBS ile kısaca pelet durulayın ve pelet santrifüj ile hücreler. Trizol Reaktif ekleyin ve 1.4 adıma geçin.
- Yeterli Trizol Reaktif yüksek kalitede RNA elde etmek için gereklidir. 100 mg doku, - 5 - 10 x 10 6 hücre (süspansiyon kültürleri için) veya 3.5 cm plaka başına (yapışık kültürler için) 50 RNA ayıklamak için 1 ml Trizol Reaktif kullanın. Polytron PT2100 homojenizatör (veya eşdeğer) ile Trizol Reaktif olarak doku homojenize edilir. Trizol Reaktif için üreticinin kılavuzu (Invitrogen) göre doku örnekleri veya hücre RNA ayıklamak geçin.
- RNA konsantrasyonu Nanodrop 1000 (Termo Scientific) ve RNA kalitesi jel elektroforezi ile analiz edilir kullanılarak ölçülür. Tipik verim 1 x 10 6 kültürlenmiş hücrelerde başına doku ya da RNA 5-15 ug mg başına RNA 1-10 mikrogram kadar değişmektedir. Ortadan kaldırmak içingenomik DNA az miktarda RNA potansiyel kontaminasyon, RNA örnekleri üreticinin talimatlarına göre RNaz ücretsiz DNaz (Sigma AMP-D1) ile tedavi edilir. Bu tedavi RNA hiçbir bozulma sağlamak için RNA konsantrasyonunun belirlenmesi ve jel elektroforez tekrarlayın. Mağaza -80 RNA ekstrakte ° C
* Not: RNA da kiti el kitabına göre RNAeasy kiti (Qiagen) kullanılarak elde edilebilir, ya da DNA ve RNA hem de arzu edilir ise DNA / RNA kiti (Qiagen) tarafından.
2. Kantitatif Ters Transkripsiyon PCR (QRT-PCR)
- RNA revers cDNA kullanarak Üstsimge III İlk iplikli Sentez Sistemi (Invitrogen) transkripsiyonu edilir. En H1 genlerin mRNA Poli-A kuyruklu-eksikliği olduğundan, cDNA sentezi için primerler olarak yerine oligo-dT rasgele heksamerler kullanımı için çok önemlidir. Bununla birlikte, rasgele heksamerleri ve oligo-dT shou düşük seviyelerde polyadenylated mesajları ile genlerin ifade analizi, aynı zamanda arzu edilirse, bir karışımıLD polyadenylated mRNA'ların ters transkripsiyon verimini artırmak için ters transkripsiyonu (RT) reaksiyonda kullanılabilir.
- Üreticinin kılavuzuna göre RT reaksiyonu gerçekleştirin. Kısaca,
- Bir 0.5 ml PCR tüp içinde, toplam RNA 5 ug, 50 ng / ul rastgele heksamerlerin 1 ul, 10 mM dNTP karışımı 1 ul birleştirmek, ve 10 ul olarak toplam reaksiyon hacmi yapmak DEPC işlenmiş-H2O ekleyin. İyice karıştırın ve 65 az 5 dakika inkübe ° buz üzerinde 1 dakika inkübasyonu takiben C,.
- CDNA sentezi Karışım 10 ul hazırlamak: 10xRT tamponu, 25 mM 4 ul'lik 2 ul MgCl2, 0.1 M DTT, RNaseOut 1 ul (40 U / ml), Üst Simge III RT (200 U / 1 ul 2 ul ul) ve / astar RNA karışımı ekleyin.
- 25 de 10 dakika inkübe 50 ° C'de 50 dakika izledi ve 5 dakika için 85 ° C'da, reaksiyon sona ° C,.
- Her bir reaksiyon genellikle 100-250 ng / ul cDNA ürün elde edilir. -20 CDNA ürünleri Mağaza° C veya gerçek zamanlı kantitatif PCR (qPCR) için hemen geçin.
- qPCR doğru, yüksek verimlilik ve tekrarlanabilirlik 14 ile hedef sırası kopya ölçmek olabilir. Biz qPCR çift sarmallı DNA (dsDNA) ile intercalates sadece floresan sinyal verir SYBR Green boya ile ölçülen seçin. Taqman deneyi 14 gibi spesifik olmamakla birlikte, bu yöntem daha maliyet etkin, kolay laboratuvarda kabul edilecek ve qPCR daha çok yönlülük sağlar. Bu nedenle, tepkime verimi ve spesifisite sağlamak için amplifikasyon plot (Şekil 2A) ve qPCR ürünün türevi erime eğrisi (Şekil 2B) incelemek için önemlidir.
| Histon alt | Fare histon isimlendirme | İnsan histon isimlendirme | ||
| Gene ad | Giriş No. | Gene adı | Giriş No. | |
| Histon H1A | Hist1h1a | NM_030609 | HIST1H1A (H1.1) | NM_005325 |
| Histon H1B | Hist1h1b | NM_020034 | HIST1H1B (H1.5) | NM_005322 |
| Histon H1c | Hist1h1c | NM_015786 | HIST1H1C (H1.2) | NM_005319 |
| Histon H1d | Hist1h1d | NM_145713 | HIST1H1D (H1.3) | NM_005320 |
| Histon H1e | Hist1h1e | NM_015787 | HIST1H1E (H1.4) | NM_005321 |
| Histon H1 ° | H1f0 | NM_008197 | H1F0 | NM_005318 |
| Histon H1oo | H1foo | NM_183811 | H1FOO | NM_153833 |
| Histon H1t | Hist1h1t | NM_010377 | HIST1H1T | NM_005323 |
| Histon H1t2 | H1fnt | NM_027304 | H1FNT | NM_181788 |
| Histon H1x | H1fx | NM_198622 | H1FX | NM_006026 |
| Histon Hils1 | Hils1 | NM_081792 | HILS1 | AY286318 |
Tablo 1. Fare ve insan Histon H1 alt isimlendirme.
- İleri tasarım ve her H1 geni (Tablo 1) özgü PCR primerleri ters. Özellikle, merkezi küresel etki alanına tekabül eden bölgede somatik H1S arasında yüksek sekansı benzerliği, nedeniyle, belli bir alt tipi H1 için tasarlanmış primerler o aynı hizada olmadığı sağlamak için kritiktirtermal H1 gen veya çapraz diğer H1 alt yükseltmek. Çoğu H1 gen intron içermez dikkat etmek de önemlidir. Böylece tipik genomik kirletmemesi için RT-PCR için kabul intron-spanning primerler kullanılamaz. Bunun yerine, RNA örnekleri genomik bulaşma eser miktarda ortadan kaldırmak için DNaz (1.5 bakınız) ile önceden tedavi edilmelidir. Buna ek olarak, RT (-)-qPCR cDNA örneklerinde genomik kirlenme eksikliği doğrulamak için paralel yapılmalıdır.
- İfade örnekleri arasında değişmez dahili referans genleri Ayrıca tasarım primerler. Genelde bu tür gliseraldehit-3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH) ve beta-aktin gen olarak housekeeping genlerin, referans genler olarak seçilmiştir. housekeeping genlerin qPCR normalleşme sinyalleri kontrol olarak hizmet vermektedir.
- 2x IQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) (dNTP içeren, 50 U / ml iTaq DNA polimeraz, 6 mM MgCl2, SYBR Green I ve 20 ul 12.5: Aşağıdaki gibi her PCR reaksiyonu (toplam hacim 25 ul) hazırlamaknM floresan), 10 nM ileri / geri astar karışımı 4, cDNA ul / ng 1.25 ul 2 ul ve GKD 2 O 9.25 ul ve Microseal 96-PCR plakasını iyice karıştırın. Plakası kapak plaka mühürlü olduğundan emin olmak için Microseal 'B' Yapıştırıcı Seals (Bio-rad) kullanın. Dokunun veya kısaca vorteks PCR plate ve kısa bir santrifüj tepkime aşağı spin. QPCR için MyIQ Tek Renk real-time PCR Algılama Sistemi (Bio-rad) 'in plakası yerleştirin.
- 30 saniye 95 ° C'de 3 dakika süreyle, 10 saniye 95 ° C'de 40 döngü izledi, 60 ° C'de 20 saniye süreyle, 72 ° C: bu, aşağıdaki koşullar qPCR kullanabilir. PCR verimliliği ve Ct (döngüsü Eşik) değerleri için amplifikasyon eğrileri (Şekil 2A) inceleyin. Eşik hattı otomatik IQ5 Optik Sistem Yazılımı Sürüm 2.0 ile ayarlanabilir.
- Gereken astar verimliliği ve optimal cDNA konsantrasyonu, bir standart eğriden deneyi ile test edilebilir olduğu genomik DNA'nın bir seri seyreltme iqPCR ve Ct değerleri için kullanılan lar DNA miktarının günlük karşı çizilmiştir. Yüksek özgüllük ve verimlilik primerler ile optimize edilmiş bir qPCR tahlil belirleme katsayısı (R 2)> 0.98 ile, doğrusal bir standart eğri verecektir. Yoksul amplifikasyon verimliliğini sahip olma eğilimi 200 bp, daha uzun amplikon süresini primerler kaçının.
- SYBR Green herhangi bir dsDNA algıladığı için, istenilen amplikon, ancak astar dimerleri veya kirleticiler, yükseltilir ve algılanmasını sağlamak için qPCR izleyen bir erime eğrisi vadede gerçekleştirmek için çok önemlidir. Erime eğrisi analizi, program için qPCR aleti ° C'ye 95 ° C de 0.5 ° C lik artışlarla veri toplama ile 55 arası örnekleri ısıtmak için. MyIQ (Bio-Rad) için erime eğrisi analizi varsayılan ayar, cihaz aşağıdaki gibidir: 95 ° C'de 1 dakika, 55 ° set 55 az 10 saniye 81 döngü izledi 1 dakika boyunca C, ° C, erime eğrisi + sıcaklık 0.5 ° C (kamera her bir döngüde veri toplar).
- Beri dsDNA bir erime sıcaklığına (Tm) amplikon uzunluğu ve içeriğini GC bağlıdır, farklı amplikonlar farklı Tm (s) sahip olacaktır. İstenen amplikonlarının belirli bir erime sıcaklığına yanı sıra gürültü amplikon zirveleri (Şekil 2B) eksikliği teyit etmek için qPCR ürünlerin türevi erime eğrisi inceleyin.
- İstatistiksel analiz için her bir deney için reaksiyon çoğaltmak veya üç hazırlayın. Böyle RT-PCR olarak QRT için negatif kontroller, içermektedir (-)-qPCR (ters transkripsiyon olmayan RNA ile şablon olarak qPCR) ve herhangi bir cDNA, RNA veya PCR mix eklendi DNA kaynağı ile qPCR. RT (-) (- Şekil 2 ve 3) RT ()-qPCR potansiyel genomik DNA kirlenme kontrolü olarak hizmet verebilir.
- IQ5 Optik Sistem Yazılımı Sürüm 2.0 (Bio-rad) ile qPCR verileri analiz. H1 genlerin bağıl ifade seviyelerinin elde etmek için temizlik genin (örneğin, GAPDH, beta-aktin, HPRT) ifadesi ile H1 izoform genlerin ifadesi değerleri normalize.
* Tüm işlemler buz üzerinde ya da 4 ° C de yapılmalıdır
- Fare doku inceleyin ve buz gibi soğuk PBS ile durulayın. (Hemen ekstraksiyon devam değilse, dondurma oturtun ve adım 1.2 'de açıklandığı gibi örnekleri saklar.) Jiletle parçalar halinde doku Kıyma. Bir Dounce homojenizatör (B havaneli) için kıyma aktarın. 10 ml Sükroz Tamponu (0,3 M sukroz, 15 mM NaCl, 10 mM HEPES [pH 7,9], 2 mM EDTA, 0.5 mM PMSF, komple Mini proteaz inhibitörü kokteyl Tablet, taze ilave) doku başına gram ekleyin. 10-15 vuruş ile doku homojenize edilir.
- 15 ml tüp, 30 saniye (santrifüj modeli: Eppendorf 5810R) için 500 rpm dönüş için homojenat aktarın; dikkatli 5 dakika 2000 rpm'de yeni bir tüp (pelet doku artıkları atmak) için süpernatan aktarabilir ve santrifüj, Pelet hücrelere. 3.4 adıma geçin.
- Histon ve kromatin monolayer yetiştirilen hücreler elde edilecekse, durulamaPBS ile, kültürü çanak PBS ekleyin ve santrifüj hücre kazıyıcı ve pelet hücreleri kullanılarak hücrelerin hasat. Santrifüj süspansiyon yetiştirilen hücreler için, pelet hücreler.
- % 0.5 NP-40 (gram doku miktarı veya 10 (8) başlayarak hücre başına düşen) ile desteklenmiş 10 mL kadar sakroz tampon çözeltisi içinde, hücre pelletini. Bir Dounce homojenizatör (B havaneli) için örnek aktarın ve 20 dakika inkübasyon içinde 10 vuruş Dounce. Bu noktada, çekirdekler elde edilir. Mikroskop altında çekirdeklerinin kalitesini inceleyin. 5 dakika 2000 rpm'de santrifüj Pelet çekirdekleri. Süpernatant atın.
- 1 doku g veya 10 (8) hücreleri başına - 3 ml yüksek tuz Tamponu (her kullanımdan önce taze ilave 0.35 M KCl, 10 mM Tris [pH 7,2], 5 mM MgCl2, 0.5 mM PMSF) içinde çekirdekler pelletini. Küçük bir Dounce homojenizatör (B havaneli) için örnek aktarın ve 5-10 darbeleri ile homojenize.
- Ardından 20 dakika süreyle buz üzerinde inkübe 3 Eppendorf tüpler (1 ml her biri), içine alikotu süspansiyonpelet kromatin için 10 dakika 14.000 rpm'de santrifüj. Süpernatant atın.
- Her kromatin pelet için 0.8 ml 0.2 NH 2 SO 4 ekleyin. Pelet tamamen ayrışmış kadar iyi pelet öğütmek için bir eppendorf tüp havaneli Dounce kullanın. 4 ° C'da gece boyunca dönen bir platform üzerinde örnekleri inkübe. Toplam histon asit tedavisi, bu basamak ile ekstre edilmiştir.
- 10 dakika için 14,000 rpm'de santrifüje. İki Eppendorf tüpleri (400 ul / tüp) içine supernatant (histon özleri) aktarın. Pelet atın. Her tüpe buz gibi soğuk etanol 2.5 hacim (1 ml) eklenir .. Örnekleri -20 ° C'da gece boyunca tutmak.
- Pelet toplam histon için 10 dakika 14.000 rpm'de santrifüj, süpernatant atın. % 70 EtOH ile pelet üç kez yıkayın, kuru havalandırmak için 20-30 dakika bankta bırakın. -80 ° C'de kurutulmuş proteinler saklayın veya GKD 2 O bunları eritmek ve hemen HPLC analizi geçin. Kurutulmuş proteinleri saklanabilir-80 ° C kadar 1 yıl için.
4. Linker histonlarının HPLC Analizi
- Ters-faz kolon ve HPLC aletinin kapasitesine bağlı olarak GKD 2 O önerilen hacim histon pelletini. Bu analiz için HPLC C18 ters faz kolonu 250 x 4.6 mm (Vydac) ve Äktapurifier UPC 900 aleti (GE sağlık) kullanabilir. Biz genellikle analiz için GKD 2 0 100 ul toplam histonlarının 50-100μg çözülür.
- Çözünmeyen artıkları çıkarmak için 5 dakika 14.000 rpm'de santrifüj. Bradford protein denemesi sütun üzerine enjekte edilecek protein miktarını belirlemek için kullanılır. HPLC sistemi üzerinde ters faz sütunu halinde toplam protein, 50-100 ug enjekte edilir. Proteinin yüklenmesi aşırı miktarda kolon tıkanmasını önlemek için kaçınılmalıdır.
- Damıtmak artan bir asetonitril gradyan ile bağlayıcı histonlar ve çekirdek histonlar olarak Tablo 2'de.
Tablo 2. Zamanla asetonitril degrade artırılması.
- Atık (figu 214 nm'de izlenir ve HPLC profilleri ediliryeniden 4) kaydedildi ve UNICORN 5.11 yazılımı (GE Healthcare) ile Äktapurifier UPC 900 (GE Healthcare) kullanılarak analiz edilmektedir. Daha fazla analiz için, örneğin SDS-PAGE ve kütle spektrometresi - protein fraksiyonları da kesir oto-toplayıcı (GE Frac-920) ile toplanabilir.
- Her H1 tip ve H2B piklerinin A 214 değerleri her gelen histon protein peptid bağı sayısına göre normalleştirilmiş. Bireysel H1 histon H1 ailesi içinde alt yanı sıra nükleozom çekirdek partiküller ile H1 alt tiplerinin oranının nispi (Şekil 5) A 214 değerleri normalize bu hesaplanabilir.
5.. Temsilcisi Sonuçlar
Memeli H1 alt türleri, toplam akış ve bireysel histon H1 genlerin ifade analizi için temsili sonuçlarının listesinde, sırasıyla Tablo 1, Şekil 1 ve Şekil 2-5 'de gösterilmiştir.Şekil 2A kullanılarak H1A qPCR reaksiyonlar tipik amplifikasyonu eğrilerini göstermektedir cDNA Şekil 2B, karşılık gelen amplikonlarının türevi erime eğrisi gösterir ise, fare karaciğer ve mESCs hazırlanır. Erime eğrisi 86 az erime sıcaklığına (Tm) tek bir karakteristik tepe ° H1A PCR amplikon C görüntüler, ve H1A qPCR assay of yüksek spesifite düşündüren, spesifik olmayan arka zirveleri yoksundur. Amplifikasyon arsa (Şekil 2A) değerlendirilmesi her numunenin üç nüsha qPCR reaksiyonlar yüksek tekrarlanabilirlik düşündüren, neredeyse aynı Ct değerleri ile tutarlı sinyalleri verdiğini gösterir. Build-up RT amplikonlarının eksikliği (-)-qPCR reaksiyonlar olduğunu genomik DNA kirlenme mevcut, ya da çok az değildi gösterir. Böyle GAPDH olarak H1 genleri ve temizlik genler, bir Ct değerleri kullanılarak, her H1 geninin nispi RNA ifade seviyeleri hesaplandı. H1 ° ve H1A genleri için hesaplanan sonuçlar örnekleri gösterilmektedir Mesc karşı yetişkin fare karaciğerinde H1A veya H1 ° ifade farkı da histon proteinlerin HPLC profilleri (Şekil 4) bellidir. H1 °, farklılaşma spesifik H1, yetişkin karaciğerde toplam H1 (Şekil 5A)% 27.2 'si için azını dokular büyük bir miktarı ile toplanır. Bunun aksine, H1 ° proteini andiferansiye mESCs (Şekil 4B) yaklaşık yoktur. Diğer taraftan, H1A yüksek mESCs (Şekil 3 ve 4B) içinde, mRNA transkriptlerin ve hem de protein, ifade edilir. HPLC profili H1 zirveleri ölçümü sayesinde, H1, aile içindeki her bireyin H1 alt göreli oranı (Şekil 5A) belirlenir. Dahası, tek tek H1 alt tipine değerleri (ya danükleozom başına toplam H1) H2B A değerleri 214 (Şekil 5B) normalleştirilmiş bir buçuk tekabül H1 alt tipi (ya da total H1 toplamı) ve normalleştirilmiş bir 214 tepe değeri olan oranı ile hesaplanır. 
Şekil 1. Memeli ilintileyici-histon alt ekspresyon analizi genel şeması. 
Şekil 2. H1A qPCR testinin Temsilcisi sonuçları. H1A qPCR testin (A) Amplifikasyon arsa. Eşik hattı ve IQ5 Optik Sistem Yazılım tarafından belirlenen Ct değerleri gösterilir. (B) qPCR ürün türevi erime eğrisi-(A) 'de gösterilmiştir. 
MESCs ve yetişkin m H1A ve H1 ° mRNA Şekil 3. QRT-PCR analiziKaraciğer Ouse. Y ekseni referans gen GAPDH o kadar H1 genlerin bağıl ifade seviyelerinin temsil eder. (-) RT ile qPCR numuneleri (ters transkripsiyon olmayan RNA) minimal veya hiç sinyalleri gösterir. 
Memeli hücrelerinde ekstrakte histonlarının Şekil 4. HPLC analizi. Yetişkin fare karaciğer (A) ve fare EKH (B) ekstrakte 100 mg toplam histon-Ters-faz HPLC analizi. X ekseni: elüsyon zaman. Y ekseni: MAU, Mili emiciliği birimleri. 
Şekil 5. Yetişkin fare karaciğerinde nükleozom oranları başına H1 alt yapısı ve H1. Her H1 izoform ve H2B için pik alanı 214 A değerleri UNICORN 5.11 yazılımı (GE Healthcare) kullanılarak hesaplanan, ve karşılık gelen histon proteini mevcut peptid bağı sayısına göre normalize edilir. Normalleştirilmiş bir toplamıTüm H1 alt tiplerinin 214 değerlerinin toplamı H1 için bir değer olarak elde edilir. Her bir alt tipi H1 için toplam H1 yüzdesi (A) gibi nükleozom üzere H1 oranı (H2B A 214 değerleri normalize yarısı ile temsil edilir) (B) yetişkin fare karaciğer gösterildiği HPLC profilden hesaplanır Şekil 4A'da.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tahlillerin seti memeli bağlayıcı histon alt tiplerinin ifade seviyelerinin kapsamlı analiz olanak sunuldu. Düzgün tasarlanmış QRT-PCR herhangi bir memeli H1 histon genleri RNA mesaj son derece hassas ve doğru ölçüm sağlar. Bağlayıcı histon alt genler için QRT-PCR testlerinin kritik parçası ters transkripsiyon dayalı rastgele astar kullanılarak cDNA hazırlıktır. En H1 genler dahil olmak üzere en histon genler, mRNA diğer hücre mRNA'lar sunulan uzun bir poli-A kuyruklu içermezler. Böylece oligo-dT primerler ile geleneksel bir ters transkripsiyon yöntemi verimli H1 cDNAlann üretmek değildir. Böyle H1 0 olarak poli-A kuyruğu içeren mRNA transkript ile birkaç H1 gen ekspresyon analizi, H1 RNA'lar yüksek bolluğu muhtemelen QRT-PCR tabanlı rastgele heksamerler (Şekil 3) ile aynı derecede etkilidir. Bununla birlikte, oligo-dT primerler ve RT reaksiyon için rasgele bir heksamerlerden oluşan bir karışımTION QRT-PCR ile analiz genlerinin daha geniş kapsama alanı sağlayan, düşük kopya numaraları vardır polyadenylated mRNA'ların RT verimliliği artırmak için kabul edilebilir. Bu tür temizlik geni GAPDH olarak iç referans genler, bir QRT-PCR farklı bir doku ya da hücre tipleri üzerinde belirli bir H1 genlerin bağıl ifade seviyesini (Şekil 3) mukayese edilebilir, böylece dahildir. Standart eğrisi analizi ile QRT-PCR birleştirerek, çeşitli örnekler (veriler gösterilmemiştir) H1 cDNAlann mutlak kopya sayıları elde etmek de mümkündür.
Burada da histon proteinlerin histon ekstraksiyonu ve HPLC analizi için protokol açıklanmaktadır. Bu yöntemin bir avantajı da tek tek başına nükleozom H1 alt tipi (ve toplam H1) oranını ölçmek üzere toplam H1 proteinlerin havuz için, her H1 alt nispi oranları belirleyebilir olmasıdır. Buna ek olarak, HPLC analizi pro blotting gibi Batı gibi diğer protein analiz yöntemleri ile karşılaştırıldığında,Tüm H1 alt tiplerinin daha nicel ve tekrarlanabilir ölçümler calismasini saglar. Hücrede H1 alt tiplerinin farklı düzeylerde ve kompozisyon yüksek mertebeden kromatin yapısı modüle. Nükleozom için H1 kromatin sıkıştırma oranı ile ilişkili olduğu gösterilmiştir ve kromatin 2 nükleozom tekrar uzunluğu için bir belirleyici değil. Bu nedenle, burada açıklanan yöntemlerden kromatin araştırma geniş bir uygulama olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH hibe GM085261 ve Gürcistan Kanseri Koalisyonu Seçkin Bilim Adamı Ödülü (YF için) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNase Zap | Applied Biosystems | AM9780 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-018 | |
| SuperScriptIII | Invitrogen | 18080-051 | |
| Absolute Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 | |
| IQ SYBR Green | Bio-Rad | 170-8880 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | AMP-D1 | |
| Microseal 96-well PCR plate | Bio-Rad | MSP-9605 | |
| Microseal ’B’ Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 | |
| Sucrose | Acros Organics | AC40594 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP332 | |
| Sodium chloride (NaCl) | American Bioanalytical | AB01915 | |
| Sodium dihydrogen phosphate heptahydrate (NaH2PO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP-330 | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| Complete Mini proteinase inhibitor cocktail tablet | Roche Group | 11836153001 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E-5134 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | American Bioanalytical | AB01620 | |
| Nonidet-40 (NP-40) | American Bioanalytical | AB01425 | |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366 | |
| Tris [hydroxymethyl aminomethane] | American Bioanalytical | AB02000 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) | VWR international | VW3648-3 | |
| Ammonium hydroxide (NH4OH) | Acros Organics | AC42330 | |
| Bradford Protein Assay | Bio-Rad | 500-0001 | |
| Acetonitrile | EMD Millipore | AX0145-1 | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | JT Baker | 9470-01 |
References
- Fan, Y. H1 linker histones are essential for mouse development and affect nucleosome spacing in vivo. Mol. Cell Biol. 23, 4559-4572 (2003).
- Woodcock, C. L., Skoultchi, A. I., Fan, Y. Role of linker histone in chromatin structure and function: H1 stoichiometry and nucleosome repeat length. Chromosome Res. 14, 17-25 (2006).
- Shen, X., Gorovsky, M. A. Linker histone H1 regulates specific gene expression but not global transcription in vivo. Cell. 86, 475-483 (1996).
- Alami, R. Mammalian linker-histone subtypes differentially affect gene expression in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 5920-5925 (2003).
- Happel, N., Doenecke, D. Histone H1 and its isoforms: contribution to chromatin structure and function. Gene. 431, 1-12 (2009).
- Clausell, J., Happel, N., Hale, T. K., Doenecke, D., Beato, M. Histone H1 subtypes differentially modulate chromatin condensation without preventing ATP-dependent remodeling by SWI/SNF or NURF. PLoS One. 4, 0007243-0007243 (2009).
- Khadake, J. R., Rao, M. R. DNA- chromatin-condensing properties of rat testes H1a and H1t compared to those of rat liver H1bdec; H1t is a poor condenser of chromatin. Biochemistry. 34, 15792-15801 (1995).
- Orrego, M. Differential affinity of mammalian histone H1 somatic subtypes for DNA and chromatin. BMC Biol. 5, 22-22 (2007).
- Th'ng, J. P., Sung, R., Ye, M., Hendzel, M. J. H1 family histones in the nucleus. Control of binding and localization by the C-terminal domain. J. Biol. Chem. 280, 27809-27814 (2005).
- Wang, Z. F., Sirotkin, A. M., Buchold, G. M., Skoultchi, A. I., Marzluff, W. F. The mouse histone H1 genes: gene organization and differential regulation. J. Mol. Biol. 271, 124-138 (1997).
- Brown, D. T., Sittman, D. B. Identification through overexpression and tagging of the variant type of the mouse H1e and H1c genes. J. Biol. Chem. 268, 713-718 (1993).
- Fan, Y., Sirotkin, A., Russell, R. G., Ayala, J., Skoultchi, A. I. Individual somatic H1 subtypes are dispensable for mouse development even in mice lacking the H1(0) replacement subtype. Mol. Cell. Biol. 21, 7933-7943 (2001).
- Fan, Y., Skoultchi, A. I. Genetic analysis of H1 linker histone subtypes and their functions in mice. Methods Enzymol. 377, 85-107 (2004).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M.
