Summary
一个3D系统培养人关节软骨在滑液的高层次描述。滑液反映关节软骨的最自然的微环境，并可以很容易地获得和存储。因此，该系统可用于软骨再生研究和筛选疗法治疗关节炎。
Abstract
软骨破坏的骨性关节炎的病理特征是中央在美国的事业，一个残疾的领先。在成人软骨没有非常有效的再生，在体内，因此，骨关节炎导致不可逆转的软骨丢失及伴有慢性疼痛和行动不便 1,2 。软骨组织工程提供了有希望的潜在的再生和恢复组织功能。这种技术通常涉及到播种天然或人工合成的支架和培养软骨细胞产生的三维构造过了一段时间，在一个平衡的介质中的工程目标的生物化学和生物力学成熟的组织 ，可以在体内3-6成缺损部位移植。软骨组织工程的成功实现，为软骨细胞的生长和外基质沉积的最佳条件是必不可少的。
在本机的关节腔，在北极的软骨ular表面的骨沐浴在滑液。这清晰和粘性流体股骨头关节软骨提供营养，并包含 7,8软骨细胞代谢的重要生长因子，细胞因子和酶。此外，滑液有利于低摩擦的软骨表面之间的运动，主要是通过分泌两个重要组成部分， 透明质酸和 lubricin 9 10。与此相反，组织工程化软骨是最常见的人工培养基培养。虽然这些媒体很可能能够为研究软骨细胞代谢提供更明确的条件，滑液最准确地反映关节软骨细胞，其中居住的自然环境
事实上，滑液容易获取和存储的优势，往往可以定期身体补充。一些团体补充滑液在培养基中的人类，牛，兔和狗的彗星hondrocytes，但主要用于滑液（低于20％）11-25只低的水平。虽然鸡，马和人类的软骨细胞已在滑液的百分比较高的中等培养，这些文化系统二维26-28。在这里，我们目前在3D系统培养人关节软骨细胞的方法，我们与滑液的高（可达100％）的比例超过21天的期限。这样做，我们克服了滑液的高粘度提出的一个主要障碍。该系统提供学习人体软骨在滑液在3D设置，可进一步与其他两个重要因素（氧张力和机械负荷）29,30，软骨构成的自然环境，模仿自然的环境相结合的可能性软骨生长。此外，该系统也可用于化验滑液对软骨细胞的活动，并为发展中国家提供了一个平台软骨再生技术和关节炎的治疗方案。
Protocol
一个培养人关节软骨细胞的三维系统在滑液
在这项工作中，我们人体关节软骨细胞封装在使用修改后的制造商建议的封装协议（ 龙沙 ，和31）的海藻酸钠珠。使用这些三维结构，我们已经发展为培养细胞中含有人体滑液的不同比例的中等文化制度和评估软骨基因表达的这些三维结构。
1。准备人关节软骨细胞三维（3D）封装（HAC）
- 解冻在37℃水浴1分钟的小瓶人类关节软骨细胞（HAC）（龙沙）（通道2）（1毫升）。
- 混合软骨细胞的生长介质（龙沙）在3000 RPM为3-5分钟，收集细胞离心1毫升。弃上清。
- 重悬细胞沉淀（龙沙）在软骨细胞的生长介质。
- 在组织一个10厘米的板细胞培养板（BD公司），和软骨细胞的生长介质（龙沙）培养，直至细胞融合。 HACS应使用一个通道数量不高于3或4（P3或P4）。
- 洗净板155MM氯化钠代替标准的PBS由trypsinzation收集细胞海藻酸钠珠封装，HACS。一旦细胞的分离，降速为5min 3000RPM的细胞。这些细胞是现在准备3D封装。
2。封装成3D珠HACS
重悬在1.2％的海藻酸钠溶液（Sigma公司）在8x10 的 5细胞/ ml密度HACS 。手机号码之前确定封装，使用标准的细胞计数。这是非常重要拌匀，以确保即使细胞分布在珠。
- 移液器的HAC /海藻酸钠溶液混合成12毫升注射器22号针头（泰科医疗公司）。
- 同时，准备与102米的50 mL烧杯中号氯化钙2卷5倍的HAC / aginate解决方案。烧杯内放置一个搅拌棒和102毫米氯化钙溶液慢慢搅拌（约150转）。
- 保持约6英寸以上的氯化钙溶液表面的注射器提示和氯化钙溶液逐滴添加到HAC /海藻酸钠混合物。在一般情况下，海藻酸钠珠2毫米直径约10 4细胞/珠的封装密度。注：高度的氯化钙溶液的注射器是很重要的。更短的距离将在泪珠形球面形珠，而不是结果，造成不均匀的机械完整性和细胞封装。
- 让珠搅拌的氯化钙 20-25分钟的解决方案。虽然其他海藻酸钠封装协议表明了10分钟的孵育时间要短得多，我们发现， 与氯化钙溶液培养时间较长的是增强了完整性广告。
- 除去氯化钙溶液，洗2-3次2-3卷氯化钠珠，然后一次在软骨细胞分化培养基（龙沙）。虽然其他褐藻胶珠封装协议涉及上述洗涤程序使用一个过滤器，我们发现，海藻酸钠珠往往成为被困在过滤器和干出来的，从而降低了封装效率。我们发现最有效的珠子解决之前丢弃到烧杯底部的解决方案。
- 使用一个标准的铲转移到培养皿的珠子。我们通常文化为软骨细胞的生长介质的2天3厘米的12％珠，让软骨调整他们在种植前开关滑液，软骨细胞的分化培养基（龙沙）中期封装过程。
3。滑液培养基培养软骨细胞
- 新鲜滑液可以得到一个Outpatient诊所（我们获得塔夫茨医学中心滑液）。滑液可以在15毫升猎鹰管转移到实验室，并立即为15分钟3000转速离心去除细胞碎片。分装细胞滑液到1.5 ml离心管，以避免重复冷冻解冻。上清可存放于-80 ° C，直到使用。
- 此前培养，在不同体积比混合滑液与软骨细胞的分化培养基（清洁发展机制，龙沙），一个100mm的抗坏血酸的恒定浓度和9 毫米氯化钙（氯化钙这种微量确保海藻酸钠的完整性珠）。
- 保持在37℃培养箱摇晃平台上板（摇摆频率：约75次/分），以帮助在海藻酸钠珠养分分布的影响，并减少珠聚集。这是我们这些软骨细胞培养一个较长时间（4周），特别是作为重要的。请注意虽然软骨细胞的生长和分化的媒体（龙沙）含有两种常用抗生素庆大霉素和两性霉素，我们并没有补充任何抗生素，当我们用滑液的软骨细胞培养的不同比例。曾观察到没有污染。
- 更改媒体混合物，每2-3天。滑液的粘度一直封装在褐藻胶珠培养软骨细胞，在长期的文化的一个主要障碍。我们发现，最有效的滑液培养基稀释102毫米氯化钙2（50％V / V），这也加强了海藻酸钠珠的完整性。这样，中期可以慢慢用吸管被删除，不损坏珠。
4。在褐藻胶珠的收获HACS基因表达分析
从基因表达分析海藻酸钠珠HACS收获时必须特别小心。
- 洗净海藻酸钠珠3 TIMES在102毫米氯化钙2，每次约5分钟。
- 检索在4-5倍的珠子量增加了55毫米NaCitrate的软骨细胞。重要的是，海藻酸钠珠完全沉浸在NaCitrate解决方案。 Shake或岩石为20-30分钟。
- 离心细胞，弃上清。
- RT - PCR分析，重悬细胞沉淀在细胞裂解液（QIAGEN RNA提取试剂盒），并着手RNA纯化。
5。修复组织学分析海藻酸钠珠HACS
特别注意将要采取的收获从组织学分析3D珠HACS。
- 洗海藻酸钠珠在102毫米氯化钙2 3次，每次约5分钟。为了彻底洗去粘稠滑液，我们发现最有效的软骨细胞的分化培养基（龙沙）冲洗过夜，在37℃培养箱（摇摆频率中摇晃：约75时间S /分钟）。软骨细胞的生长介质中使用，以确保在这场旷日持久的洗的软骨细胞的生存和允许的最大的固色剂的渗透。
- 珠固定在70％的乙醇过夜，并进行组织学分析。要执行DAPI染色，孵化用DAPI溶液（500ng/ml）的海藻酸钠珠温和的摇摆下1小时，3次用102毫米氯化钙 2每次15分钟。大埤图像，然后可以荧光显微镜下观察。珠子也可以阿尔辛蓝和H＆E染色切片。
6。代表性的成果
我们在滑液的高百分比的人软骨细胞的三维培养方法是描绘在图1所示的示意图。人类软骨细胞在海藻酸钠珠封装后，他们被允许在培养基中不同程度的滑液比增长。由于滑液的粘度，它是必不可少的文化的软骨细胞不断摇摆条件下，以防止软骨结构的聚集和确保的营养素的均匀分布。它也是必不可少的海藻酸钠珠洗前广泛检索的软骨细胞，所以，固定或裂解液可以穿透珠（图1）。明场（BF）的软骨细胞在褐藻胶珠图像如图2所示。 DAPI染色进行确认usniform分布在珠的细胞（图2）。在为期21天的文化时期的结束，QRT - PCR基因表达分析。参照基因GAPDH被用于所有PCR的正常化，因为它被确定为最可靠的参考基因的qPCR分析软骨细胞32。如图就是一个例子。 3，在这里我们从人类汇集从六个骨关节炎患者滑液关节软骨细胞培养的结果进行分析。符合事实，从软骨细胞龙沙已在2D文化的扩大，这将不可避免地导致脱分化 33，我们发现，0天软骨细胞软骨基质基因表达的最低水平（图3 ）。三维培养软骨细胞与软骨细胞分化培养基（龙沙）或滑液培养基显著增加软骨的胶原蛋白，蛋白聚糖和MMP13，这表明第21天（图）34的软骨细胞重新分化的基因表达。在媒体的百分比增加滑液导致软骨基质标志物Ⅱ型胶原和蛋白聚糖mRNA表达（图3A和3B）相媲美的水平。此外，在100％滑液培养软骨细胞软骨降解酶MMP13 mRNA表达减少甚至表现出比那些在培养中单（图3c）。有趣的是，细胞死亡指标caspase 3的表达水平逐渐下降与增加滑液的比率，表明即Synovial液培养，导致细胞凋亡水平下降（图3D）。因此，我们的结果表明，在一个3D的环境中滑液的高层次培养人关节软骨细胞是一种可行的技术。
表格和图表
图1。示意图文化在3D海藻酸钠珠滑液的高百分比的人关节软骨细胞的方法。首先，软骨细胞和海藻酸钠溶液混合。当应用于下降明智的氯化钙溶液中，软骨细胞固定内钙交联海藻酸钠水凝胶珠。这些三维结构，然后培养软骨细胞的分化培养基（龙沙）在不同的人体滑液比。摇摆条件下培养21天之后，含有细胞的海藻酸钠珠洗广泛的基因后，细胞检索表达分析。
图2。明场（BF）和人关节软骨细胞的DAPI 0％，30％，50％，70％和100％滑液封装的文化图像。软骨细胞在培养条件下，在所有形状的球形。明场（BF）和大埤图像叠加确认软骨细胞的位置和分布。 Insets的，放大的图像。箭镞，BF和DAPI染色图像的软骨细胞共定位。
图3。QRT - PCR封装人类关节软骨细胞的分析0天（D0）经过21天的培养基中培养（D21），辅以不同比率的滑液（SF）（0％，30％，50％ ，70 ％和100％）。 4个独立样本的结果如下所示。 GAPDH被用作内部参考所有PCR的。
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Discussion
在这份报告中，我们开发了一个人关节软骨细胞培养的方法，允许在一个中型的3D环境，它包含人体滑液的高浓度。滑液的主要成分构成的关节腔，关节软骨细胞所在的自然环境之一。然而，滑液的粘度一直是立体培养软骨细胞的长期的重大挑战。要克服的挑战，保持甚至养分分布在三维构造在粘稠的环境，并防止聚集，我们将不断的运动，温和的摇摆下的软骨结构。为了提高结构的软骨结构完整性，我们改装成珠形成和媒体变化的过程 31的时间长度的优化海藻酸钠水凝胶，包括传统的播种软骨细胞的过程。这种程序是必不可少的在长期培养的软骨结构处理中的粘稠滑液。
我们相信这种方法将使我们能够研究人类关节软骨细胞生物学在其自然milleu，滑液。一个潜在的问题是，试剂扩散可能不理想的封装在褐藻胶珠和一种粘稠的环境中生长的软骨细胞。因此，研究的某些试剂工程软骨的影响，更好地扩散可能实现减少海藻酸钠珠的大小，并使用灌注系统，以方便试剂分布在滑液。虽然我们的代表性的结果是从人类软骨细胞培养正常的骨关节炎患者的滑液，我们相信这种方法可以推断，使用从一个原本健康的人或其他健康脊椎动物滑液。因为滑液活动可以对比组合的活动流体中存在的许多生化因素的关系，在我们的系统中的软骨细胞基因表达的滑液的净效应可能与疾病的严重程度，并最终将帮助我们了解治疗前后关节内环境。此外，我们的方法也可能导致使用自体软骨细胞培养患者自身的滑液量身定制的关节软骨再生的可能性。为此，该系统可提供研究工程软骨滑液以及35的生物力学力量的见解。
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Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
我们想感谢提供帮助滑液存储和离心罗宾奈（塔夫茨医学中心），智也内村和Dana凯恩斯（塔夫茨大学）。这项工作是由NIH（1R01AR059106 - 01A1为LZ）
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table of specific reagents and equipment: | |||
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Alginate (Alginic Acid sodium salt) | Sigma-Aldrich | A2158-250G | 2.4% solution stored at 40°C |
| Calcium Chloride Dihydrate, Granular | JT Baker | A19339 | |
| Chondrogenic Growth media | Lonza Inc. | CC-3156 (base media) | |
| CC-4409 (supplement) | |||
| Chondrogenic Differentiation Media | Lonza Inc. | CC-3226 (base media) | |
| CC-4408 (supplement) | |||
| Human articular chondrocytes | Lonza Inc. | CC-2550 | |
| Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| RNeasy mini kit (for RNA extraction) | Qiagen | 74104 | |
| PCR reagents: SYBR-green | Quanta Biosciences | 95053-500 | |
| 12 ml syringe | Tyco Healthcare, Covidien | 512852 | |
| 22-Gague Hypodermic Needle | Tyco Healthcare, Covidien | 8881 | |
| Microscope | Olympus Corporation | IX71 | |
| Platform rocker | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Vari-mix | |
| Collagen IIa-forward | 5’-TTC ATC CCA CCC TCT CAC AGT-3’ | ||
| Collagen IIa-reverse | 5’-CCTCTGCCTTGACCCGAA-3’ | ||
| MMP13-forward | 5’-TGT GCC CTT CTT CAC ACA GAC ACT-3’ | ||
| MMP13-reverse | 5’-GAG AGC AGA CTT TGA GTC ATT GCC-3’ | ||
| Caspase 3-forward | 5’-TCA TTA TTC AGG CCT GCC GTG GTA-3’ | ||
| Caspase 3-reverse | 5’-TGG ATG AAC CAG GAG CCA TCC TTT -3’ | ||
References
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