Summary
Un sistema 3D di coltura di condrociti articolari umani in alti livelli di liquido sinoviale è descritto. Liquido sinoviale riflette il microambiente più naturale per la cartilagine articolare, e può essere facilmente ottenuti e memorizzati. Questo sistema quindi può essere utilizzato per studiare la rigenerazione della cartilagine e per terapie di screening per il trattamento di artrite.
Abstract
Distruzione della cartilagine è un elemento centrale patologica di osteoartrite, una delle principali cause di disabilità negli Stati Uniti. La cartilagine nell'adulto non si rigenera in modo molto efficiente in vivo, e, di conseguenza, l'artrosi conduce alla irreversibile perdita della cartilagine ed è accompagnata da dolore cronico e 1,2 immobilità. Ingegneria dei tessuti cartilagine offre un potenziale promettente per rigenerare e ripristinare la funzionalità dei tessuti. Questa tecnologia in genere implica condrociti semina in ponteggi naturale o sintetica e la coltura del 3D che dà luogo a costruire un mezzo equilibrato per un periodo di tempo con l'obiettivo di un tessuto di ingegneria biochimica e biomeccanica mature che possono essere trapiantate in un sito difetto in vivo 3-6 . Raggiungere una condizione ottimale per la crescita dei condrociti e la deposizione della matrice è essenziale per il successo di ingegneria dei tessuti cartilaginei.
Nella nativa comune cavità, cartilagine al articcolare superficie dell'osso è immersa nel liquido sinoviale. Questo liquido chiaro e viscoso fornisce sostanze nutritive per la cartilagine articolare avascolare e contiene fattori di crescita, citochine e gli enzimi che sono importanti per il metabolismo dei condrociti 7,8. Inoltre, il liquido sinoviale facilita il movimento a basso attrito tra le superfici cartilaginee che secernono principalmente attraverso due componenti chiave, acido ialuronico e lubricin 9 10. Al contrario, la cartilagine di ingegneria tessutale è spesso colto in mezzi artificiali. Mentre questi media sono probabilmente in grado di offrire condizioni più definite per lo studio del metabolismo dei condrociti, liquido sinoviale più accuratamente riflette l'ambiente naturale di cui condrociti articolari risiedono in
Infatti, il liquido sinoviale ha il vantaggio di essere facile da ottenere e conservare, e che spesso può essere regolarmente rifornito dal corpo. Diversi gruppi hanno completato il terreno di coltura con liquido sinoviale in crescita umano, bovino, coniglio e cane chondrocytes, ma soprattutto utilizzato solo bassi livelli di liquido sinoviale (inferiore al 20%) 11-25. Mentre condrociti pollo, cavallo e umani sono stati colti nel mezzo con una maggiore percentuale di liquido sinoviale, questi sistemi di coltura erano bidimensionali 26-28. Qui vi presentiamo il nostro metodo di coltura di condrociti articolari umani in un sistema 3D con un alta percentuale di liquido sinoviale (fino al 100%) per un periodo di 21 giorni. Nel fare ciò, abbiamo superato un grande ostacolo presentato dalla viscosità del liquido sinoviale. Questo sistema offre la possibilità di studiare condrociti umani nel liquido sinoviale in un ambiente 3D, che può essere ulteriormente raggruppati con altri due importanti fattori (tensione di ossigeno e carico meccanico), 29,30 che costituiscono l'ambiente naturale per la cartilagine di imitare l'ambiente naturale per cartilagine di crescita. Inoltre, questo sistema può essere utilizzato anche per saggiare l'attività del liquido sinoviale sui condrociti e fornire una piattaforma per lo sviluppotecnologie di rigenerazione della cartilagine e le opzioni terapeutiche per l'artrite.
Protocol
Un sistema 3D per condrociti articolari umani in coltura liquido sinoviale
In questo lavoro, abbiamo incapsulato condrociti articolari umani in perle di alginato utilizzando una versione modificata produzione-ha suggerito protocollo di incapsulamento (Lonza, e 31). Utilizzando questi costrutti 3D, abbiamo sviluppato un sistema per la coltura delle cellule in un terreno di coltura contenente varie percentuali di liquido sinoviale e umane hanno valutato questi costrutti 3D per l'espressione genica della cartilagine.
1. Preparare condrociti articolari umani (HAC) per tre dimensioni (3D) incapsulamento
- Scongelare una fiala (1 ml) di condrociti articolari umani (HAC) (Lonza) (Passaggio 2) a bagnomaria 37 ° C per 1 min.
- Mescolare con 1 ml di terreni di crescita dei condrociti (Lonza) e centrifugare a 3000 rpm per 3-5 minuti per raccogliere le cellule. Scartare il surnatante.
- Risospendere il pellet di cellule in terreno di coltura di condrociti (Lonza).
- Le cellule in un tessuto piatto 10 centimetripiastra di coltura (BD Biosciences), e la cultura in terreni di coltura di condrociti (Lonza) fino a quando le cellule sono confluenti. HACs deve essere utilizzato in un numero passaggio non superiore a 3 o 4 (P3 e P4).
- Lavare HACs sulla piastra con 155mm di NaCl al posto della PBS standard, seguita da trypsinzation per raccogliere le cellule per l'incapsulamento alginato tallone. Una volta che le cellule si staccano, centrifugare le cellule a 3000rpm per 5min. Le cellule sono ora pronti per l'incapsulamento 3D.
2. Incapsulare HACs in perline 3D
Risospendere il HACs alginato in soluzione 1,2% (Sigma) ad una densità di 8x10 5 cellule / ml. Numero di cellule è stato determinato prima di incapsulamento, utilizzando un contatore cella standard. E 'molto importante mescolare bene per assicurare una distribuzione uniforme delle celle in perline.
- Pipettare l'HAC / soluzione di alginato miscela in una siringa da 12 ml collegata ad un 22-gauge (Tyco Healthcare, Inc.).
- Nel frattempo, preparare un bicchiere da 50 ml con 102 mM CaCl 2 in un volume di 5 volte quella della soluzione HAC / aginate. Inserire una ancoretta all'interno del bicchiere e mescolare il 102 mm CaCl 2 soluzione lentamente (a circa 150 giri al minuto).
- Tenere la punta della siringa di circa 6 centimetri al di sopra della superficie della soluzione di CaCl 2 e aggiungere l'HAC / alginato composto nella soluzione di CaCl 2 goccia a goccia. In generale, le perle alginato risultanti sono 2 millimetri di diametro con una densità di incapsulamento di circa 10 4 cellule / tallone. Nota: L'altezza della siringa sulla soluzione di CaCl 2 è importante. Distanza più breve si tradurrà in lacrima a forma sferica, invece di perle a forma, causando irregolare integrità meccanica e l'incapsulamento delle celle.
- Lasciate che i grani mescolare nella soluzione di CaCl 2 per 20-25 min. Mentre altri protocolli di incapsulamento alginato di indicare un tempo di incubazione molto più breve di 10 minuti, abbiamo trovato che il tempo di incubazione più lungo con il CaCl 2 soluzione migliore l'integrità del essereannunci.
- Rimuovere la soluzione di CaCl 2, lavare le perle 2-3 volte in 2-3 volumi di NaCl, e poi una volta in media di differenziazione dei condrociti (Lonza). Mentre altri protocolli di incapsulamento alginato tallone comportano l'uso di un filtro per le suddette procedure di lavaggio, abbiamo scoperto che le perle alginato diventano spesso intrappolato nel filtro fuori e asciutto, riducendo così l'efficienza di incapsulamento. Abbiamo trovato più efficiente per consentire le perle di depositarsi sul fondo del bicchiere prima di scartare la soluzione.
- Utilizzare una spatola standard per trasferire le perline in piatti della cultura. Noi di solito la cultura 12 perle per ben 3 centimetri per 2 giorni nel terreno di coltura di condrociti condrociti per consentire di adeguarsi al processo di incapsulamento nel medio sono state coltivate a loro prima di passare alla media di differenziazione dei condrociti (Lonza) con liquido sinoviale.
3. Condrociti cultura nella coltura del liquido sinoviale medio
- Fresco liquido sinoviale può essere ottenuto da un outpatient clinica (Abbiamo ottenuto liquido sinoviale presso la Tufts Medical Center). Il liquido sinoviale può essere trasferito in tubi 15ml falco al laboratorio, e immediatamente centrifugato a 3000 rpm per 15 minuti per rimuovere i detriti cellulari. Aliquota cell-free liquido sinoviale in provette da 1,5 ml microcentrifuga, al fine di evitare ripetuti di congelamento-scongelamento. Surnatante può essere conservato a -80 ° C fino al momento dell'uso.
- Prima di coltura, mescolare il liquido sinoviale con il mezzo di differenziazione dei condrociti (CDM, Lonza) a diversi rapporti volumetrici, con una concentrazione costante di acido ascorbico 100mM e 9 mM CaCl 2 (tale importo traccia di CaCl 2 è quello di garantire l'integrità del alginato perline).
- Tenere la piastra su una piattaforma oscillante in un incubatore ° C 37 (frequenza a dondolo: circa 75 volte / min) per aiutare la distribuzione dei nutrienti all'interno della perline alginato, e per ridurre aggregazione delle perline. Ciò è particolarmente importante in quanto abbiamo la cultura di questi condrociti per un lungo periodo di tempo (fino a 4 settimane). Nota: Mentre la crescita dei condrociti e dei media differenziazione (Lonza) contengono due comuni antibiotici gentamicina e amfotericina, non abbiamo alcun supplemento antibiotici quando abbiamo usato diverse percentuali di liquido sinoviale per la coltura di condrociti. Nessuna contaminazione è stata mai osservata.
- Cambia miscele dei media ogni 2-3 giorni. La viscosità del liquido sinoviale è stato un grande ostacolo in condrociti coltura incapsulati in microsfere di alginato durante il lungo periodo culture. Abbiamo trovato più efficace per diluire il liquido sinoviale medio-integrato con 102mm CaCl 2 (50% v / v), che rafforza anche l'integrità delle perline alginato. In questo modo, il mezzo può essere rimosso lentamente con una pipetta, senza danneggiare le perline.
4. HACs raccolto in perle di alginato per l'analisi di espressione genica
Particolare cura deve essere presa durante la raccolta del HACs dalle perle alginato per l'analisi di espressione genica.
- Lavare le perline alginato 3 Times in 102 mM CaCl 2 per circa 5 minuti ogni volta.
- Recuperare i condrociti con l'aggiunta di 55 mM NaCitrate a un volume 4-5 volte quella delle perline. E 'importante che le perline alginato sono totalmente immerso nella soluzione NaCitrate. Agitare o roccia per 20-30 min.
- Spin giù le cellule ed eliminare il surnatante.
- Per RT-PCR, risospendere il pellet cellulare in un tampone di lisi cellulare (Qiagen RNA Kit di isolamento), e procedere con la purificazione di RNA.
5. Fix HACs in perline alginato per l'analisi istologica
Particolare cura deve essere presa per raccogliere il HACs dalle perle 3D per l'analisi istologica.
- Lavare le perline alginato 3 volte in 102 mM CaCl 2 per circa 5 minuti ogni volta. Per lavare via tutto il liquido viscoso sinoviale, abbiamo trovato più efficace di lavare con mezzo di differenziazione dei condrociti (Lonza) durante la notte, oscillando in un incubatore ° C 37 (frequenza a dondolo: circa 75s / min). Il terreno di coltura di condrociti è stato utilizzato per assicurare la sopravvivenza di condrociti in questo lavaggio prolungato e per consentire la massima penetrazione dell'agente di fissaggio.
- Fissare le perline in etanolo al 70% durante la notte, e procedere con l'analisi istologica. Per eseguire la colorazione DAPI, incubare perline alginato con DAPI soluzione (500ng/ml) per 1 ora in dolce dondolio, e lavare per 3 volte con 102 mm CaCl 2 per 15 minuti ogni volta. Dapi immagini possono poi essere visualizzate al microscopio a fluorescenza. Le sfere possono anche essere sezionate per alcian blu e colorazione H & E.
6. Rappresentante Risultati
Il nostro metodo di coltura 3D per condrociti umani in alte percentuali di liquido sinoviale è raffigurato nello schema elettrico mostrato in Fig.1. Dopo condrociti umani sono stati incapsulati in microsfere di alginato, sono stati lasciati crescere in media integrato con diversi rapporti di liquido sinoviale. A causa della viscosità del liquido sinoviale, è essenzialecondrociti cultura a dondolo in condizioni costanti per evitare l'accumulo dei costrutti cartilagine e per garantire un'equa distribuzione delle sostanze nutritive. E 'anche essenziale per lavare le sfere di alginato ampiamente prima di recuperare i condrociti, in modo che la fissazione o tampone di lisi può penetrare le perline (Fig.1). Luminoso campo (BF) immagini di condrociti nelle perline alginato sono mostrati in figura 2. Colorazione DAPI è stata eseguita per confermare usniform distribuzione delle cellule all'interno della sfere (Fig. 2). Al termine dei 21 giorni di cultura, analisi di espressione genica è stata effettuata da qRT-PCR. Il riferimento gene GAPDH è stato utilizzato per la normalizzazione di tutti PCR, come è stato determinato da uno dei geni di riferimento più affidabili per l'analisi qPCR sui condrociti 32. Un esempio è mostrato in fig. 3, dove abbiamo analizzato i risultati di condrociti articolari umani colti nel liquido sinoviale aggregati di sei pazienti con osteoartrosi. Coerente con il fatto che i condrociti daLonza sono stati estesi in culture 2D, che porterebbe inevitabilmente alla de-differenziazione 33, abbiamo scoperto che giorno 0 condrociti espresso livelli minimi di cartilagine geni della matrice (Fig. 3). 3D coltura di condrociti di media differenziazione dei condrociti (Lonza) o media integrato con liquido sinoviale significativo aumento di espressione genica cartilagine del collagene, aggrecano e MMP13, che indica condrociti ri-differenziazione per giorno 21 (Fig.3) 34. Aumentare la percentuale di liquido sinoviale nei media ha portato a livelli comparabili di matrice cartilaginea marcatori collagene II e l'espressione di mRNA aggrecano (Fig.3a e 3B). Inoltre, condrociti coltivati nel 100% del liquido sinoviale anche mostrato una diminuzione di enzimi degradanti cartilagine MMP13 espressione di mRNA rispetto a quelli coltivati in media solo (Fig.3C). È interessante notare che il livello di espressione di indicatore delle cellule morte caspasi 3 gradualmente diminuita con rapporti sempre maggiore di liquido sinoviale, suggerendo che scoltura del liquido ynovial ha portato a livelli di apoptosi diminuzione (Fig. 3D). Pertanto, i nostri risultati mostrano che condrociti articolari umani in coltura alti livelli di liquido sinoviale in un ambiente 3D è una tecnologia fattibile.
Tabelle e figure
Figura 1. Schema del metodo di condrociti articolari cultura umana in alte percentuali di liquido sinoviale in perle di alginato 3D. In primo luogo, condrociti e la soluzione di alginato si mescolano. Quando viene applicato goccia a goccia alla soluzione di CaCl 2, condrociti sono immobilizzati all'interno del reticolato di Ca-alginato di perline idrogel. Questi costrutti 3D vengono poi coltivate in mezzo differenziazione dei condrociti (Lonza) con diversi rapporti di umana liquido sinoviale. Dopo 21 giorni di coltura in una condizione a dondolo, perle di alginato contenenti le cellule sono lavate ampiamente trascorso il quale le cellule vengono recuperati per il geneanalisi di espressione.
Figura 2. Campo chiaro (BF) e le immagini DAPI di condrociti articolari umani culture incapsulato con lo 0%, 30%, 50%, 70% e il 100% del liquido sinoviale. Condrociti erano di forma sferica in tutte le condizioni di coltura. Immagini del campo chiaro (BF) e DAPI sono stati sovrapposti per confermare la posizione e la distribuzione dei condrociti. Inserti, le immagini ingrandite. Punte di freccia, colocalizzazione dei condrociti in BF e immagini colorazione DAPI.
Figura 3. QRT-PCR di incapsulato condrociti articolari umani al giorno 0 (D0) uno dopo 21 giorni di coltura (D21) in un mezzo integrato con rapporti variabili di liquido sinoviale (SF) (0%, 30%, 50%, 70 % e 100%). Risultati di quattro campioni indipendenti sono mostrati qui. GAPDH è stato utilizzato come riferimento interno per tutte le PCR.
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Discussion
In questo rapporto, abbiamo sviluppato un metodo che permette per la cultura dei condrociti articolari umani in un ambiente 3D in mezzo che contiene alte concentrazioni di liquido sinoviale umano. Liquido sinoviale è uno dei principali componenti che costituiscono l'ambiente naturale nella cavità articolare, dove risiedono condrociti articolari. Tuttavia, la viscosità del liquido sinoviale è stata una grande sfida per tridimensionali a lungo termine coltura di condrociti. Per superare la sfida di mantenere la distribuzione uniforme di nutrienti in una aggregazione di immagini 3D di costruire in un ambiente viscoso e di prevenire, abbiamo posizionato costruisce cartilagine sotto costante movimento a dondolo con gentile. Per migliorare l'integrità strutturale dei costrutti cartilagine, abbiamo modificato la tradizionale procedura di condrociti semina in un idrogel alginato tra cui l'ottimizzazione della lunghezza del tempo per la formazione di perline e dei media che cambia procedura 31. Tali procedure sono essenziali quandocostruisce la cartilagine sono trattati nel liquido sinoviale viscoso durante a lungo termine le culture.
Crediamo che questo metodo ci permetterà di studiare la biologia dei condrociti articolari umani nella loro naturale milleu, il liquido sinoviale. Un problema potenziale è che la diffusione dei reagenti non può essere ideale per condrociti incapsulato in perline di alginato e cresciuto in un ambiente viscoso. Quindi per studiare l'effetto di alcuni reagenti sulla cartilagine ingegnerizzati, una migliore diffusione può essere ottenuto riducendo la dimensione delle perline alginato, e utilizzando sistemi di perfusione per facilitare la distribuzione dei reagenti nel liquido sinoviale. Mentre il nostro rappresentante risultato è stato ottenuto da colture di condrociti umani normali nel liquido sinoviale derivati da pazienti con osteoartrite, riteniamo che questo metodo può essere estrapolata da usare liquido sinoviale da una persona in buona salute o altri animali vertebrati sano. Perché l'attività del liquido sinoviale può essere correlata alla attività combinatorialegami di molti fattori biochimici presenti nel fluido, l'effetto netto del liquido sinoviale sull'espressione genica condrociti nel nostro sistema può essere correlata con la gravità della malattia e alla fine ci aiutano a capire l'ambiente intra-articolari, prima e dopo i trattamenti. Inoltre, il nostro metodo può anche portare alla possibilità di utilizzare liquido sinoviale propria di un paziente per la coltura di condrociti autologhi per rigenerare la cartilagine articolare che è su misura. A tal fine, questo sistema può fornire intuizioni studiando le forze biomeccaniche che agiscono attraverso il liquido sinoviale sulla cartilagine progettato anche 35.
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Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Robin Nye (Tufts Medical Center), Tomoya Uchimura e Dana Cairns (Tufts University) per aver fornito aiuto di stoccaggio liquido sinoviale e centrifugazione. Questo lavoro è stato finanziato dal NIH (1R01AR059106-01A1) per LZ
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table of specific reagents and equipment: | |||
| Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Alginate (Alginic Acid sodium salt) | Sigma-Aldrich | A2158-250G | 2.4% solution stored at 40°C |
| Calcium Chloride Dihydrate, Granular | JT Baker | A19339 | |
| Chondrogenic Growth media | Lonza Inc. | CC-3156 (base media) | |
| CC-4409 (supplement) | |||
| Chondrogenic Differentiation Media | Lonza Inc. | CC-3226 (base media) | |
| CC-4408 (supplement) | |||
| Human articular chondrocytes | Lonza Inc. | CC-2550 | |
| Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| RNeasy mini kit (for RNA extraction) | Qiagen | 74104 | |
| PCR reagents: SYBR-green | Quanta Biosciences | 95053-500 | |
| 12 ml syringe | Tyco Healthcare, Covidien | 512852 | |
| 22-Gague Hypodermic Needle | Tyco Healthcare, Covidien | 8881 | |
| Microscope | Olympus Corporation | IX71 | |
| Platform rocker | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Vari-mix | |
| Collagen IIa-forward | 5’-TTC ATC CCA CCC TCT CAC AGT-3’ | ||
| Collagen IIa-reverse | 5’-CCTCTGCCTTGACCCGAA-3’ | ||
| MMP13-forward | 5’-TGT GCC CTT CTT CAC ACA GAC ACT-3’ | ||
| MMP13-reverse | 5’-GAG AGC AGA CTT TGA GTC ATT GCC-3’ | ||
| Caspase 3-forward | 5’-TCA TTA TTC AGG CCT GCC GTG GTA-3’ | ||
| Caspase 3-reverse | 5’-TGG ATG AAC CAG GAG CCA TCC TTT -3’ | ||
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