Summary
سريع
Abstract
ويمكن استخدام مركبات الكشف عن النشاط في الجسم الحي، كخطوة أولى لتحديد المرشحين التي يمكن وضعها في 1،2 كلاء الدوائية. وضعنا رواية nanoinjection / الكهربية الفحص الذي يسمح للكشف عن الآثار تغييري من المركبات النشطة بيولوجيا على وظيفة الدائرة العصبية التي تتوسط استجابة الهروب في ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا 3،4. لدينا في فحص الجسم الحي، والذي يستخدم الألياف العملاق ذبابة الفاكهة نظام (GFS، الشكل 1) يسمح للفحص من أنواع مختلفة من المركبات، مثل الجزيئات الصغيرة أو الببتيد، ويتطلب سوى كميات ضئيلة للحصول تأثير. بالإضافة إلى ذلك، GFS ذبابة الفاكهة يقدم مجموعة كبيرة ومتنوعة من الأهداف الجزيئية المحتملة على الخلايا العصبية أو العضلات. الألياف العملاق (GFS) المشبك كهربائيا (GAP المفارق)، فضلا عن كيميائيا (الكوليني) في الصعود إلى عصبون Synapsing الطرفية (PSI) وTrochanteral Tergo الخلايا العصبية العضلية (TTMn) 5 6. وأخيرا، فإن الوصلات العصبية والعضلية (NMJ) من TTMn وDLMn ومع القفزة (الايراد) وعضلات الطيران (DLM) هي glutamatergic 7-12. هنا، نحن لشرح كيفية حقن كميات نانولتر من مركب، في حين الحصول على تسجيلات داخل الخلايا الكهربية من نظام الألياف العملاق 13 وكيفية رصد آثار مجمع على وظيفة من هذه الدائرة. نعرض خصوصية مقايسة مع سترات methyllycaconitine (MLA)، وهو خصم nAChR، والذي يعطل هذه المبادرة إلى DLMn اتصال ولكن ليس إلى GF TTMn اتصال أو وظيفة NMJ في الوثب أو عضلات الطيران.
قبل البدء في هذا الفيديو من الأهمية بمكان أن تشاهد بعناية وتصبح مألوفة مع الفيديو [جوف] بعنوان "تسجيلات الكهربية من مسار الألياف العملاق من melan د.والمقصود ogaster "من أوغسطين وآخرون 7، كما قدم شريط الفيديو هنا كما توسع لهذه التقنية القائمة. هنا نستخدم طريقة التسجيلات الكهربية والتركيز في التفاصيل فقط على إضافة nanoinjections تقرن وتقنية الرصد.
Protocol
1. الكهربية الزي مجموعة المتابعة
- يوصف المعدات اللازمة للتلاعب الكهربية مجموعة المتابعة بالتفصيل من قبل أوغسطين وآخرون. في هذه المجلة 14. يرجى الرجوع إلى هذه المقالة لشرح مفصل من الأجهزة الكهربية المطلوبة.
- تعديل سبق وصفها الكهربية تلاعب مجموعة، بزيادة 14 عن طريق إضافة micromanipulator السادس، الذي يحمل nanoinjector. لسهولة الوصول إلى رأس حيوان وينبغي وضعها بين micromanipulators 2 تحفيز الكهربائي كما هو موضح في الشكل رقم 2.
- قبل بدء التجربة، تأكد أن لديك مجموعة ومريحة في جميع محاور دوران مع كل micromanipulators، وأن جميع أقطاب كهربائية، فضلا عن micropipette حقن (راجع الخطوة 2) يمكن ان تصل الى حيوان.
2. Nanoinjection مجموعة المتابعة
- وnanoinjection مجموعة المتابعة يتطلب Nanoliter2000 (البنك Precisiعلى الآلات، ساراسوتا، فلوريدا، الولايات المتحدة الأمريكية) أو أي نوع مماثل من محقن التي تسمح للرقابة في حقن كميات نانولتر.
- إعداد إبرة الحقن باستخدام بال micropipettes زجاج مزودة محقن عن طريق سحب منهم لمقاومة 80-100 MΩ مع مجتذب الكهربائي.
- لحقن السلس هو مطلوب منها لشطبة وmicropipettes لفتح 11-17 ميكرومتر بزاوية 45 درجة (الشكل 3).
- ردم ببطء micropipette مع حقن زيت الاصطناعية باستخدام محقنة هاملتون وفقا لتعليمات دليل Nanoliter2000، وضمان عدم وفقاعات الهواء موجودة.
- تأمين بعناية micropipette على nanoinjector وتهيئته لتحميل مركب من قبل تفريغ فائض من النفط وفقا لتعليمات دليل Nanoliter2000.
- وضع محقن على micromanipulator وتحميل مركب وفقا للتعليمات في دليل Nanoliter2000. تأكد من أن غيض من micropipette لا يفطر خلال هذاالإجراء.
- حدد المبلغ المطلوب من nanoliters ليتم حقنه في مربع سيطرة حاقن وفقا لتعليمات دليل Nanoliter2000. تجدر الإشارة إلى أن حقن المبلغ الإجمالي لا ينبغي أن يتجاوز 100 NL. وجدنا أن كميات أكبر من حلول التحكم المالحة قد تؤثر على وظيفة في دائرة إحصاءات المالية الحكومية.
- فمن الأهمية بمكان أن يكون حاقن موصول من السيطرة على المربع خلال اكتساب تسجيل مع استثناء من حقن نفسه، لأن إمدادات الطاقة من nanoinjector يتداخل مع التسجيلات، وهو أمر واضح والضوضاء في الخلفية (الشكل 4). ومع ذلك، لا قطع التيار الكهربائي إلى السيطرة على المربع كما أنه سيتم إعادة تعيينها.
3. التحضير ذبابة الفاكهة السوداء البطن
- تخدير الذباب يوم 2-6 القديمة مع CO 2 أو على الجليد كما هو موضح سابقا 14،15.
- غير متحرك مرة واحدة، استخدام زوج من ملاقط لنقل الحيوانات الى واي لوحة صغيرةال شمع الأسنان الناعمة عن طريق التقاط انها تصل من ساقيه. يرجى ملاحظة أن ذبابة الفاكهة ذكر يزن حوالي 1.0 ملغ وذبابة الفاكهة الإناث يزن حوالي 1.2 ملغ، وبالتالي مركب إلى وزن الجسم نسبة يختلف في الذباب الذكور مقابل الإناث. ولذلك، فمن المستحسن استخدام واحد فقط بين الجنسين للتجارب.
- كما هو موضح سابقا 14،15، جبل بعناية الجانب ذبابة ظهري حتى وضمان ثبتوا في الصدر والرأس مع شمع الأسنان الناعمة وضعت في جميع أنحاء الجسم. نشر بعناية أجنحة خارج بحيث وضع عمودي على الصدر (الشكل 2، C). يجب أن يتم تنظيمها الطاير مع وضرر أقل قدر ممكن.
4. تقرن Nanoinjection / الكهربية
- تضع الذبابة التي شنت على تلاعب الكهربية ورأسه نحو الأقطاب محفزة.
- أسعد الحيوان على سطح الأرض المقابلة، محفزة وأقطاب تسجيل كما هو موضح سابقا 14،15 (Figure 2، C). ما لم يكن المطلوب على خلاف ذلك، القطب مكان تسجيل واحد في DLM والأخرى في عضلة الايراد. يقع عضلة DLM في الصدر بين ظهراني الشعر الأمامية والوسطى خط الوسط من الطيران. يقع بالقرب من عضلة الايراد مرفقات الجناح، وبين الشعر فوق الجناحي الخلفي والأمامي للذبابة 7.
- محاذاة micropipette الحقن التي تحتوي على مركب مع مركز التي تشبه 3 تقع في الجزء الخلفي من الرأس وسطي ولكن لا تضخ حتى الآن (الشكل 2، C).
- قبل حقن مركب الحصول على تسجيل خط الأساس للقصر على الايراد وGF إلى DLM مسارات لنظام الألياف العملاق (GFS، الشكل 1) عن طريق تحفيز المخ. للقيام بذلك، وتفعيل ألياف العملاق (GFS) مع 10 قطارات من 10 المنبهات (40-50 السيارات) كل تعطى لمدة 0،03 مللي في 100 هرتز مع تأخير 1 ثانية بين القطارات 14،15 (الشكل 4). النوع البري يطير SHولد تكون قادرة على متابعة واحد الى واحد وعلى هذا المعدل من التحفيز لكلا DLM ومسارات الايراد. تجاهل الطاير اذا كان GF إلى DLM وGF لمسارات الايراد لا تتبع التحفيز هرتز 100 في نسبة 1:1.
- التحول إلى التحفيز المستمر لGF مع البقول واحدة في هرتز 1 (الشكل 4).
- سد العجز بسرعة حاقن إلى السيطرة على المربع. على الرغم من الضوضاء في الخلفية وسوف تتداخل مع تسجيلات هرتز التحفيز 1، لا التوقف عن ذلك.
- بعناية إدراج micropipette الحقن في كبسولة رئيس ذبابة أقل بقليل من cuticule، وضخ المبلغ المطلوب من مركب في الدملمف من الذبابة مع الحفاظ على التحفيز 1 هرتز (الشكل 4). بسبب الدورة الدموية المفتوحة للذبابة، وسوف يتعرض النظام بأكمله العصبي للمجمع في غضون ثوان. على الرغم من حقن موقع خاص ليست حرجة لتسليم المركبات في اللمف الدموي، ونحن نجد ان منطقة التي تشبه، والتي يتم توطيند وسطي في الجانب الأكثر الظهري للكبسولة الرأس، إلى أن يكون موقع ملائم يسمح للحقنة من السهل أن يؤدي إلى التوزيع السريع وحتى من المجمع.
- على الفور إزالة micropipette حقن من موقع الحقن وافصل محقن من السيطرة على المربع في الوقت الذي تواصل في 1 التحفيز GF هرتز تصل إلى 1 دقيقة بعد حقن (الشكل 4).
- من أجل الكشف عن آثار أكثر مكرا من المركبات على GFS، نشدد على ألياف العملاق (GFS) مع 10 قطارات من 10 مؤثرات في 100 هرتز مع تأخير 1 ثانية بين القطارات. تواصل لاختبار وظيفة المسارات GF مع هذا النموذج كل 5 دقائق حتى 15 دقيقة (الشكل 4). ومع ذلك، فواصل زمنية أقصر أو أطول فترات المراقبة من الممكن أيضا.
- من أجل اختبار ما إذا كان مركب له تأثير على تقاطعات العصبي العضلي (NMJs) من GFS، وتضييق ربما أسفل من آثار مركب، والمضي قدما لتنشيط الخلايا العصبية الحركية directly بواسطة التحفيز الصدري. لهذا، وإزالة الأقطاب محفزة من وجهة نظر واستبدالها على الجانبين الأمامي للصدر من أجل تحفيز الخلايا العصبية الحركية مع 10 قطارات من 10 مؤثرات في 100 هرتز.
ملاحظة: آثار الكهربية يظهر في شريط الفيديو لا تتطابق مع آثار حقن صبغة نقية.
5. ممثل النتائج
تأثير وجود خصم على المبادرة إلى DLM المشبك لنظام الألياف العملاق
Methyllycaconitine سترات (MLA) هو خصم nAChR التي هي محددة لأنواع فرعية nAChR α7. هذه المبادرة إلى DLMn المشبك في مسار GF-DLM يعتمد على النوع الفرعي nAChR Dα7 عن وظيفة مناسبة، في حين إزالة الوراثي للسلالة nAChR Dα7 له أي تأثير على مسار GF-الايراد 5،6. من أجل إثبات لخصوصية وحساسية من فحص لدينا حقن نحن MLA بتركيزات مختلفة (0، 0.02، 0.04، 0.08، 0،12 نانوغرام / ملغ، 46 NL حقن) في رأس الحيوان (ن = 10 في علاج مركب، ن = 15 لمعالجة المياه المالحة). واستخدمت الذباب الذكور فقط (من نوع النمط الجيني البرية البرية 10E)، ويتم رصد تأثير المجمع ليصبح المجموع 15 دقيقة بعد الحقن.
الشكل 5 يصور الفرق بين التسجيلات التي تم الحصول عليها خط الأساس قبل الحقن وتلك التي حصلنا عليها بعد حقن ردا على قانون مكافحة غسل الأموال ومراقبة محلول ملحي. وجدنا أن حقن من قانون مكافحة غسل الأموال أدت إلى عدم قدرة المسار GF-DLM لمتابعة واحد الى واحد في 100 هرتز بواسطة التحفيز للإحصاءات المالية الحكومية في الدماغ في حين أن المسار GF-الايراد لم تتأثر. (الشكل 5، أثر العليا والوسطى، تي اختبار أداء بين الضوابط المالحة [0 نانوغرام / مغ]، وتركيزات مختلفة من قانون مكافحة غسل الأموال في كل نقطة زمنية ما لم تكن البيانات غير حدودي [الفروق الطبيعية وعلى قدم المساواة اختبار]، وإلا فإننا نستخدم وهو مبلغ رتبة مان ويتني للتجارب. * P <0.001). ومع ذلك، فإن البحث واحد الى واحدوقد لوحظ esponse من DLM عندما تم تحفيز الخلايا العصبية الحركية مباشرة (الشكل 5، تتبع القاع)، مما يدل على أن لا تتأثر وظيفة NMJ من DLM والايراد بواسطة MLA. وبدا MLA للوصول إلى أقصى تأثير 1 دقيقة بعد الحقن ل0.08، 0.04 و 0.12 نانوغرام / ملغ من MLA حقن، كما لم يلاحظ أي تغييرات أخرى كبيرة خلال ال 15 دقيقة التالية للفترة الاختبار. وعلاوة على ذلك، وصل مركب له تأثير في الحد الأقصى 0،08 نانوغرام / ملغ منذ لم تراع أقوى الاستجابات مع ارتفاع جرعة من 0،12 نانوغرام / ملغ.
الشكل 1. نظام الألياف العملاق رسم تخطيطي لنظام الألياف العملاق (GFS). الألياف العملاق (GFS، كما هو موضح باللون الأحمر) المشبك كهربائيا (GAP المفارق)، فضلا عن كيميائيا (الكوليني) في الصعود إلى عصبون Synapsing الطرفية (PSI، كما هو موضح باللون الأخضر) و الخلايا العصبية Tergo العضلات Trochanteral (TTMn، كما هو موضح باللون الأصفر) 5. وPSأنا على اتصال (الخلايا العصبية الظهرية العضلات الطولية، كما هو موضح باللون الأزرق) DLMn يعتمد على النوع الفرعي nAChR Dα7 6. أخيرا تقاطع الاعصاب (NMJ) من TTMn وDLMn وعلى القفزة (الايراد، كما هو موضح في اللون الأرجواني) وعضلات الطيران (DLM، كما هو موضح في اللون الأرجواني) هو glutamatergic.
ملاحظة: GF على اتصال المبادرة على حد سواء الكهربائية والكيميائية. ومع ذلك، في المسوخ shakB (التي تفتقر إلى تقاطعات الفجوة)، يمكن تسجيل أي رد من DLM على تحفيز GFS في الدماغ، مما يدل على أن عنصر كيميائي في حالة عدم وجود توصيلات كهربائية غير كافية لاستحضار إمكانات العمل في PSI 5،16-18. لأن GF على اتصال PSI هو الفجوة تعتمد على مفترق طرق، وهذا الرقم يدل فقط على تقاطع GAP في المشبك لأسباب بساطة.
الشكل 2.
Micromanipulators قوآخرون المتابعة.
- ويستخدم تعديل مجموعة المتابعة لبروتوكول نشرت سابقا 14 لتتناسب مع micromanipulator حقن للتسجيلات GFS يقترن nanoinjections في وقت واحد. توجه لإعداد الذبابة التي شنت مع رئيس الذبابة نحو مجرب. يتم وضع micromanipulator حقن (# 1) في الجبهة من مجرب بين المتلاعبين اثنين لأقطاب التنغستن تحفيز (2 و 3 # #). توضع micromanipulators اثنين لأقطاب تسجيل زجاج (# 4 و # 5) على الجانب الأيسر والأيمن، على التوالي. يتم وضع micromanipulator لالتنغستن قطب كهربائي الارض (# 6) أبعد في الظهر اما على الجانب الأيسر (كما هو موضح هنا)، أو على الجانب الأيمن.
- مقرب من عرض ما يصل الجزء العلوي من الترتيبات من الأقطاب المختلفة وmicropipette حقن.
- وتصاعدت بشكل سليم د. مخوزق الدروسوفيلا مع الأقطاب الكهربائية وmicropipette حقن جاهزة للحقن. لاحظ أن الحيوان الجسمهي التي شنت مع الصدر لها أفقيا واجنحتها انتشرت. وملفوفة بإحكام الشمع حول جسمه منع الحيوانات من التحرك. بالإضافة إلى ذلك، القطب الأرض (رقم 6، في البطن)، وأقطاب تسجيل زجاج (# 4 و # 5، في الصدر، والتي أبرزها الخطوط العريضة الظلام)، وتحفيز كهربائي (رقم 2 ورقم 3، واحدة في كل عين ) ومخوزق في مكان، كما هو موضح سابقا 14. يتم محاذاة بشكل صحيح micropipette حقن (# 1) مع مركز التي تشبه ثلاثة (دائري). يجب وضع الإدراج من micropipette حقن في هذا المجال.
الشكل 3. مشطوف micropipette حقن. ويظهر رسم تخطيطي لmicropipette مشطوف بشكل صحيح هنا. وينبغي مشطوف افتتاح القطب بزاوية 45 درجة ويكون لها فتحة بين 11-17 ميكرومتر. والصحيح micropipette حقن مشطوف أمر بالغ الأهمية لحقن السلس مع د الحد الأدنىamage على الطاير.
الشكل 4. مخطط شامل للبروتوكول nanoinjection / الكهربية. رسم تخطيطي ممثل عن الخطة الشاملة للnanoinjection / بروتوكول الكهربية. تبدأ عن طريق الحصول على تسجيل خط الأساس من خلال تحفيز ألياف العملاق (GFS) في 100 هرتز مع 10 قطارات من 10 منبهات كل (واحد فقط قطار هو موضح هنا). قبل الحقن، وتبدأ في 1 التحفيز هرتز ثانية واحدة على حدة. خلال فترة وحقن (في حين يتم توصيل حاقن في السيطرة على المربع)، وسوف نلاحظ كبير ضجيج في الخلفية، ولكن لا يوقف التسجيلات. بعد حقن (وموصول حاقن من مربع عنصر التحكم)، الاستمرار في تنشيط هرتز 1 لمزيد من حوالي 1 دقيقة. أخيرا، والمضي قدما إلى التأكيد على إحصاءات مالية الحكومة مع 10 قطارات من 10 مؤثرات في 100 هرتز، ومواصلة اختبار وظيفة من المسارات GF مع هذا النموذج كل 5 دقائق حتى 15 دقيقة. ملاحظة: تسجيلات ثيحرث التلاعب بها لخلق الخطة الشاملة، وهي لا تمثل نتيجة محددة تم الحصول عليها. ليس لحجمه، وتظهر ليس كل أثر. اضغط هنا لتكبير الصورة .
الشكل 5. الآثار المترتبة على قانون مكافحة غسل الأموال في جي إف إس.
- تصوير بياني لآثار سترات nAChR α7 Methyllycaconitine خصم (MLA) على طريق GF-DLM من ذبابة الفاكهة في تركيزات مختلفة (0، 0.02، 0.04، 0.08، 0.12 نانوغرام / مغ ن = 10 في علاج مركب. ن = 15 لمعالجة المياه المالحة). دقيقة واحدة فقط بعد الحقن، وكان ينظر لها تأثير كبير وفوري مع 0،04 نانوغرام / ملغ من قانون مكافحة غسل الأموال. كما لوحظ تأثير واضح مع 0.8ng/mg و0.12ng/mg من قانون مكافحة غسل الأموال في 100Hz تحفيز GFS. وقد لوحظ هناك فرق كبير بين الضوابط المالحة و 0.02 نانوغرام / ملغ من قانون مكافحة غسل الأموال. بالإضافة إلى ذلك، لا يغير أناواعتبر ن أثر بعد 1 حقن آخر دقيقة خلال فترة اختبار (15 دقيقة). تم إجراء اختبار (ت) بين عناصر التحكم المالحة (0 نانوغرام / مغ) وتركيزات مختلفة من قانون مكافحة غسل الأموال في كل نقطة زمنية. وترد مستويات كما يعني + / - ووزارة شؤون المرأة، * P <0.001.
- آثار عينة من الردود DLM في تنشيط هرتز 100. تتبع أعلى يدل على استجابات العضلات قبل حقن MLA على تنشيط GF في الدماغ. لاحظ أن العضلات هي قادرة على الرد على كل حافز واحد الى واحد في 100 هرتز. وسط تتبع يعرض ردود DLM بعد حقن MLA (0.12 نانوغرام / ملغ). لاحظ أن العضلات ليست قادرة على الاستجابة لتحفيز كل واحد الى واحد في 100 هرتز. (النجمة). تتبع أسفل يدل على ردود DLM من إعداد نفسه (0.12 نانوغرام / ملغ) على التحفيز المباشر للالخلايا العصبية الحركية في القفص الصدري. لأن DLM يستجيب احد الى واحد في 100 هرتز مع تحفيز الصدر، يمكن أن يعزى فشل استجابات الدماغ مع التحفيز على الاتصال PSI-DLMn الكوليني.
- تصوير بياني للآثار مع تركيزات مختلفة MLA (0، 0.02، 0.04، 0.08، 0.12 نانوغرام / ملغ) عن طريق GF-الايراد. لم يلاحظ أي آثار كبيرة بين المياه المالحة (0 نانوغرام / ملغ) وحقن مركب في أي لحظة زمن. تم إجراء اختبار (ت) بين عناصر التحكم المالحة (0 نانوغرام / مغ) وتركيزات مختلفة من قانون مكافحة غسل الأموال في كل نقطة زمنية، * P <0.001.
- آثار عينة من الردود الايراد في تنشيط هرتز 100. تتبع أعلى يدل على استجابات العضلات قبل حقن MLA على تفعيل GF مع التحفيز في المخ. لاحظ أن العضلات هي قادرة على الاستجابة لجميع المحفزات في 100 هرتز. وسط أثر يدل على ردود DLM بعد حقن MLA (0.12 نانوغرام / ملغ). الاستجابات من عضلة الايراد لتحفيز GF في الدماغ تظل واحدة الى واحد. تتبع أسفل يدل على ردود الايراد من إعداد نفسه لتحفيز هرتز 100 من الخلايا العصبية الحركية في الصدر (0.12 نانوغرام / ملغ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
والأحيائي nanoinjection / الكهربية المقدمة هنا يسمح لفحص السريع للمركبات في الجهاز العصبي من ذبابة الفاكهة. هذه هي رواية في تقنية الجسم الحي الذي يتطلب كميات صغيرة من مركب للحصول تأثير على مجموعة متنوعة من الأهداف الجزيئية في دائرة العصبية جيدا تتميز. ويمكن استخدام هذه الطريقة لاختبار النشاط الحيوي لمركبات مختلفة، وغير معروف من السموم إلى وكلاء الدوائية المتاحة تجاريا.
تظاهر هنا نحن وظيفة الفحص لنا باستخدام قانون مكافحة غسل الأموال، والتي كان لها تأثير على نظام الألياف العملاق (GFS) من ذبابة الفاكهة (الشكل 5). وجدنا أنها عطلت انتقائي GF إلى مسار DLM ولكن ليس على المسار GF الايراد. تنشيط الخلايا العصبية الحركية مباشرة عن طريق تحفيز الصدر أثبتت أن الخلل في GF إلى مسار DLM لم يكن بسبب وجود خلل في الوصل العصبي العضلي (NMJ) ولكنه كان يتفق مع يالحظ العدائيةر من قانون مكافحة غسل الأموال في فرعية nAChR Dα7 الحاضرة في المشبك PSI-DLMn (الشكل 1). على الرغم من أنه أظهر GF إلى اتصال TTMn أن تكون الكوليني، ومن غير المعروف ما إذا Dα7 مفارز nAChR موجودة في هذا المشبك. وعلاوة على ذلك، فإن غياب وراثي لهذا الجين الكولين (تشا) أسيتيل أو النوع الفرعي nAChR Dα7 (Dα7) الجين لا تعطل وظيفة الاتصال GF-TTMn بسبب وجود في الوقت ذاته لتقاطع الكهربائية 5،6،17،19، 20، مما يجعل الطريق غير المحتمل أن تتأثر MLA.
بعد حقن المركب، ينبغي أن حل تزج فورا النظام بأكمله العصبي للحيوان بسبب نظامها الدورة الدموية المفتوحة 21. إذا حقنت بشكل صحيح، ومجمع يصل عادة في الصدر والبطن في غضون ثوان، ولكن تشتت متجانسة يمكن ان يستغرق فترة تصل الى دقيقة واحدة. ومع ذلك، إذا لم يتم حقن مركب بشكل صحيح في الدملمف (أي حقن micropipette جدا ديالجيش الشعبي الخوض في أنسجة المخ)، ثم لوحظ تباطؤ تشتت في جميع أنحاء الحيوانية. في حين يمكن استخدام صبغ لممارسة تقنية الحقن المناسب كما هو موضح في الفيديو، فمن غير المستحسن أن تشارك في حقن تلوين الطعام الأزرق مع مجمع لفحصها لأنها قد تغير خصائص المركب، وبالتالي النشاط الحيوي لها. بالإضافة إلى ذلك، لأن معظم الحلول يستخدم كمذيب واضحة في اللون (المالحة، DMSO، الخ)، فمن الصعب معرفة ما إذا كانت أو لم تكن إخراج مركب من إبرة الحقن. ولذلك، عندما حل مركب معين من المهم لضمان أن يذهب تماما في حل؛ الجزيئات غير منحل وإلا سوف تسد بسرعة غيض الحقن، ومنع من أي طرد من السوائل. وعلاوة على ذلك، على الرغم من تشتت المجمع قد يكون فوريا في جميع أنحاء اللمف الدموي، والوصول إلى أهداف في الجهاز العصبي المركزي، وكذلك التوصل إلى الجرعة القصوى، قد يستغرق وقتا أطول على أساس الخصائص الكيميائية للمركب، مثل حجم وpolaritذ، وقدرته على تتخلل حاجز الذبابة الدم في الدماغ (22). وبالتالي، فمن المهم رصد الآثار المحتملة للمركبات غير معروف بعد عدة دقائق من الحقن لمركبات مختلفة يمكن أن يكون اختلاف في أوقات آثار بداية، والتي قد تزيد بمرور الوقت في بعض الحالات . ويمكن بالفعل تأثيرات قوية وفورية من المركب الذي منع تماما من وظيفة الخلايا العصبية ان ينظر اليها مع ردود تسبب في 1 هرتز، في حين يستخدم تحفيز GFS في ترددات أعلى (100 هرتز) للكشف عن آثار أكثر دقة نظرا لانخفاض جرعة أو رجولية من مركب. إذا لم يلاحظ أي آثار بعد حقن المركب يمكن أن يكون راجعا إما إلى جرعة دواء صغيرة أو حقيقة أن هدف المجمع الجزيئية معين غير موجود في جي إف إس.
وعلاوة على ذلك، عند استخدام الأحيائي المقدمة هنا كأداة لفحص مركبات جديدة (مثل conotoxins) من المهم أن نلاحظ أن يقتصر الفحص على أهداف جزيئية وجدت فيGFS من الطيران. على الرغم من أن الفحص نفسه لا تسمح تحديد الأهداف الفعلية الجزيئي للمركب حقن، فإنه لا يسمح للتضييق من الأهداف المحتملة داخل GFS. ويمكن أن يتم اختبارات إضافية، مثل المشبك التصحيح على الخلايا العصبية أو العضلات أو دراسات الجينية التفاعل مع المسوخ الدروسوفيلا ذبابة الفاكهة، لتحديد هدف معين من هذه المركبات. أخيرا، تم تصميم بروتوكول تسجيل قدم للكشف عن آثار معادية على وظيفة GFS. ومع ذلك، قد يتم تسجيل بروتوكول تعديلها بسهولة لمراقبة آثار ناهض من خلال رصد سلبية للاستجابات التي يسببها مركب بدلا من اختبار إذا GFS ليست قادرة على الاستجابة بشكل صحيح عندما يتم تحفيز الدوائر من قبل المجرب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نود أن نعترف أعضاء مختبر ماري ومختبر Godenschwege، في Yonezawa ألين وجه الخصوص، للتعليق عليها والمساعدة في هذا البروتوكول. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية R21NS06637 إلى منح وزير الخارجية وTAG، وكان يمول من قبل عدد AB الوطنية للعلوم جائزة مؤسسة 082925، URM: البيولوجيا التكاملية للباحثين في المستقبل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recording glass electrodes: borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 | 1.0mm OD, 0.58mm ID |
| Stimulator | Grass Technologies | Model S48 | |
| Amplifier | Getting Instruments, Inc. | Model 5A | |
| Data acquisition Software: Digidata | Molecular Devices | Model 1440A | |
| Data collection software: pCLAMP | Molecular Devices | Version 10 | |
| Stereomicroscope with fiber optic microscope ring illuminator | AmScope | SM-4T Model HL250-AR | |
| Dissecting scope for mounting | AmScope | SM-2TZ | |
| Kite Manual Micromanipulator & Tilting Base | World Precision Instruments, Inc. | Model # M3301 Kite: Model # KITE-M3-L | |
| Drosophila melanogaster Wild 10E genotype (wild type strain) | Bloomington Stock center | Stock # 3892 | |
| Vertical pipette puller | David Kopf Instruments | Model 700c | |
| Injection glass micropipettes: Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments, Inc. | Catalogue # 4878 | 1.14mm OD, 0.5mm ID |
| Silicon oil | Fisher Scientific | Catalogue # S159-500 | |
| Beveler | Sutter Instrument Co. | K.T. Brown Type Model # BV-10 | |
| Nanoliter2000 | World Precision Instruments, Inc. | Catalogue # B203XVY | |
| Blue food coloring | McCormick & Co. | N/A | Ingredients: Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1, and 0.1% Propylparaben (preservative). |
| Methyllycaconitine citrate (MLA) | Tocris Bioscience | Catalogue # 1029 | |
| Plastic wax sticks | Hygenic Corporation (Akron Ohio USA) |
References
- Koehn, F. E., Carter, G. T. The evolving role of natural products in drug discovery. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 206-220 (2005).
- Miljanich, G. P. Ziconotide: neuronal calcium channel blocker for treating severe chronic pain. Curr. Med. Chem. 11, 3029-3040 (2004).
- Layer, R. T., Wagstaff, J. D., White, H. S. Conantokins: peptide antagonists of NMDA receptors. Curr. Med. Chem. 11, 3073-3084 (2004).
- Lewis, R. J. Conotoxins as selective inhibitors of neuronal ion channels, receptors and transporters. IUBMB Life. 56, 89-93 (2004).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. Making an escape: development and function of the Drosophila giant fibre system. Semin. Cell Dev. Biol. 17, 31-41 (2006).
- Fayyazuddin, A., Zaheer, M. A., Hiesinger, P. R., Bellen, H. J. The nicotinic acetylcholine receptor Dalpha7 is required for an escape behavior in Drosophila. PLoS biology. 4, e63 (2006).
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. L-glutamate as an excitatory transmitter at the Drosophila larval neuromuscular junction. The Journal of physiology. 262, 215-236 (1976).
- Usherwood, P. N., Machili, P., Leaf, G. L-Glutamate at insect excitatory nerve-muscle synapses. Nature. 219, 1169-1172 (1968).
- Marrus, S. B., Portman, S. L., Allen, M. J., Moffat, K. G., DiAntonio, A. Differential localization of glutamate receptor subunits at the Drosophila neuromuscular junction. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 24, 1406-1415 (2004).
- Petersen, S. A., Fetter, R. D., Noordermeer, J. N., Goodman, C. S., DiAntonio, A. Genetic analysis of glutamate receptors in Drosophila reveals a retrograde signal regulating presynaptic transmitter release. Neuron. 19, 1237-1248 (1997).
- Qin, G. Four different subunits are essential for expressing the synaptic glutamate receptor at neuromuscular junctions of Drosophila. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 3209-3218 (2005).
- Schuster, C. M. Molecular cloning of an invertebrate glutamate receptor subunit expressed in Drosophila muscle. Science. 254, 112-114 (1991).
- Tanouye, M. A., Wyman, R. J. Motor outputs of giant nerve fiber in Drosophila. Journal of. 44, 405-421 (1980).
- Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster. J. Vis. Exp. (47), e2412 (2011).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. Drosophila Neurobiology. Zhang, B., Freeman, M. R., Waddell, S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 215-224 (2010).
- Blagburn, J. M., Alexopoulos, H., Davies, J. A., Bacon, J. P. Null mutation in shaking-B eliminates electrical, but not chemical, synapses in the Drosophila giant fiber system: a structural study. J. Comp. Neurol. 404, 449-458 (1999).
- Thomas, J. B., Wyman, R. J. Mutations altering synaptic connectivity between identified neurons in Drosophila. J. Neurosci. 4, 530-538 (1984).
- Baird, D. H., Schalet, A. P., Wyman, R. J. The Passover locus in Drosophila melanogaster: complex complementation and different effects on the giant fiber neural pathway. Genetics. 126, 1045-1059 (1990).
- Gorczyca, M., Hall, J. C. Identification of a cholinergic synapse in the giant fiber pathway of Drosophila using conditional mutations of acetylcholine synthesis. J. Neurogenet. 1, 289-313 (1984).
- Allen, M. J., Murphey, R. K. The chemical component of the mixed GF-TTMn synapse in Drosophila melanogaster uses acetylcholine as its neurotransmitter. The European journal of neuroscience. 26, 439-445 (2007).
- Mejia, M. A novel approach for in vivo screening of toxins using the Drosophila Giant Fiber circuit. Toxicon. 56, 1398-1407 (2010).
- Stork, T. Organization and function of the blood-brain barrier in Drosophila. J. Neurosci. 28, 587-597 (2008).
