Summary
אנו מציגים שיטה באמצעות MALDI ספקטרומטריית מסה וכימיה מתילציה רדוקטיבי לכמת שינויים מתילציה ליזין.
Abstract
לאחרונה, הרגולטורים אפיגנטים המשנים התגלו כשחקנים מרכזיים מחלות רבות ושונות 1-3. כתוצאה מכך, אנזימים אלה הם מטרות הממשלה ללימודי מולקולה קטנה ועל פיתוח 4 תרופות. הרגולטורים אפיגנטים המשנים רבים יש רק לאחרונה התגלה, והם עדיין בתהליך של להיות מסווג. בין אנזימים אלה הם demethylases ליזין אשר הסרת קבוצות מתיל מ lysines על ההיסטונים וחלבונים אחרים. בשל אופיו של הרומן המעמד הזה של אנזימים, מבחני כמה פותחו כדי ללמוד על פעילותם. זה היה מחסום הסיווג והן במחקר קצב העברת נתונים גבוה של demethylases היסטון. נכון לעכשיו, מבחני demethylase מעט מאוד קיים. אלה אכן קיימים נוטים להיות איכותית בטבע ולא ניתן להבחין בו זמנית בין מדינות שונות מתילציה ליזין (האו"ם, מונו, די ו-Tri-). ספקטרומטריית מסה משמש בדרך כלל כדי לקבוע פעילות demethylase אבל הנוכחי מבחני ספקטרומטריה לעשותלא לענות אם פפטידים מפוגל דיפרנציאלי ליינן אחרת. יינון ההפרש של פפטידים מפוגל עושה השוואה בין מדינות מתילציה קשה ובוודאי לא כמותית (איור 1 א). לכן מבחני כניסה אינן מותאמות ניתוח מקיף של פעילות demethylase.
כאן אנו מתארים שיטה הנקראת MassSQUIRM (quantitation ספקטרומטריה באמצעות מתילציה רדוקטיבי איזוטופי) המבוסס על מתילציה רדוקטיבי של קבוצות האמין עם פורמלדהיד deuterated לכפות lysines כל להיות DI-מפוגל, ולכן מה שהופך אותם למעשה המין כימי ולכן ליינן אותו (1B איור). ההבדל הכימי רק לאחר מתילציה רדוקטיבי הוא מימן דאוטריום, אשר אינו משפיע על יעילות MALDI יינון. Assay MassSQUIRM הוא ספציפי עבור תוצרי התגובה demethylase עם lysines האו"ם, מונו או di-מפוגל. Assay גם לגבי methyltransferases ליזין נותן SAלי תוצרי התגובה. כאן, אנו משתמשים בשילוב של כימיה מתילציה רדוקטיבי ו ספקטרומטריית MALDI המונית כדי למדוד את הפעילות של LSD1, demethylase ליזין מסוגלת להסיר DI-וחד-methyl קבוצות, על מצע פפטיד סינתטי 5. Assay זה פשוט נוח בקלות למעבדה כל גישה ספקטרומטר מסה MALDI במעבדה או באמצעות מתקן proteomics. Assay יש ~ 8 פי טווח דינמי והוא ניתן להרחבה בקלות לעצב צלחת 5.
Protocol
פרוטוקול זה הוא שונה מן בלייר ואחרים. 6.
1. LSD1 demethylation Assay
- בכרך האחרון של μL 20, לשלב 125 LSD1 רקומביננטי ng עם 0.25 di-methyl מיקרוגרם היסטון H3 פפטיד (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-ביוטין) במאגר demethylase (50 מ"מ טריס-Cl-pH 8.5, 50 מ"מ KCl, 5 מ"מ MgCl 2, 5% גליצרול). בנוסף, לבצע בקרת לבד הפפטיד עם האנזים לא. השליטה היא על סעיף 3 ואין צורך מתילציה רדוקטיבי.
- דגירה של 2 שעות ב 37 ° C.
- כדי לאסוף את הפפטידים, להוסיף 8 פורוס μL 20 R2 חרוזים מיקרון למדגם כל להתסיס במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. להכין חרוזים פורוס על ידי השעיית 1 נפח של חרוזים עם נפח של 1 מתנול, ולאחר מכן להוסיף 10 כרכים של חומצה פורמית 5% / 0.2% TFA.
- מצב 2 ג 18 ZipTips ידי aspirating 20 μL של TFA 0.1% אל קצה ודוחף אותו חזרה עם pipettor. לעשות את זה פעמיים עם T 0.1%FA, ארבע פעמים עם אצטוניטריל 70% / TFA 0.1% ו ארבע פעמים שוב עם TFA 0.1%.
- טען שתי דוגמאות (מלאה התגובה demethylase) על ה-C 18 ZipTips מותנה pipetting slurry חרוז מאחורי שרף C 18 ב ZipTips ודוחף את עוצמת הקול דרך עם pipettor.
- לשטוף ZipTips פעמיים עם 20 μL של TFA 0.1%.
- Elute ב μL 40 אצטוניטריל של 70% / 0.1% TFA.
- Lyophilize כל eluant לחלוטין עם concentrator SpeedVac.
2. רדוקטיבי מתילציה
חלק זה של הפרוטוקול הוא שונה מן בלייר et al. ו Rayment et al. 6,7.
- שוב להשעות את התגובה demethylase ב μL 100 של המאגר 50 מ"מ פוספט, pH 7.4.
- לתגובה demethylase, להוסיף 8 μL של 15 מ"ג / מ"ל borane dimethylamine. Borane dimethylamine הוא מומס חיץ 50 מ"מ פוספט, pH 7.4, לתת 15 מ"ג / מ"ל פתרון המניות.זה צריך להיות טרי.
- לתגובה demethylase, להוסיף 16 μL של פורמלדהיד 250 מ"מ deuterated. פורמלדהיד deuterated 250 mm הוא הוכן על ידי דילול מניות של H 2 0. זה צריך להיות טרי.
- דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
- חזור על שלבים 2.2, 2.3 & 2.4.
- חזור על שלב 2.2.
- דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 15 שעות ~~~HEAD=NNS.
- המדגם demethylase, להוסיף 12.5 μL של 1M טריס, pH 7.4 כדי להרוות את התגובה מתילציה רדוקטיבי.
3. MALDI המוניים ספקטרומטריית
- הוסף פורוס R2 20 חרוזים מיקרון לתגובה demethylase, ולאסוף על ZipTips כמתואר צעדים 1.3-1.6.
הערה: Re-להשעות את השליטה μL 100 מתוך חוצץ 50 מ"מ פוספט, pH 7.4 ולטפל כמו המדגם השני החל שלב 3.1.
- Elute מלאה דוגמאות התגובה demethylase מ ZipTips את לצלחת מדגם MALDI באמצעות 2 μL של 33% להרוות2,5-D dihydroxybenzoic חומצה. להכין 33% חומצה 2,5-dihydroxybenzoic, להפוך את פתרון רווי של חומצה 2,5-dihydroxybenzoic ב אצטוניטריל 70% / 0.1% TFA ואז לדלל 33% רווי אצטוניטריל 70% / 0.1% TFA. אפשר דגימות eluted לייבוש להתגבש.
- איסוף ספקטרום באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-prOTOF PerkinElmerSciex המונית או זמינים ברזולוציה גבוהה MALDI ספקטרומטר מסה 8,9,10.
- הצג את ספקטרום ולחלץ האזורים השיא PerkinElmerSciex באמצעות תוכנת TOFworks או תוכנה המסופקים על ידי היצרן ספקטרומטר מסה.
- אמת את תוצרי התגובה של 2 MS עם מערכת המונית זמין spectrometric מתן יכולות טנדם המוניים spectrometric.
4. ניתוח נתונים
- על מנת לפצות על חפיפה איזוטופים שנוצרו באמצעות פורמלדהיד כבד (איור 1 ב), לקבוע את אזור השיא (א) יחס של 13 C 2 ו - 13 C 4 איזוטופים relativדואר לשיא monoisotopic למדגם שליטה, שלא עבר מתילציה רדוקטיבי (איור 2 א).
EQ 1: 13C2 / 12C = R 1
EQ 2: 13C4 / 12C = R 2
זה ייתן לך את היחס של פפטיד הקיים במדינות אלו איזוטופי (R & R 1 2) ספציפית להתנסות שלך ספקטרומטר מסה. - השתמש R & R 1 2 ערכים הנוסחאות הבאות לכימות הסכום היחסי של הפפטיד הקיימים במצב כל שינוי במדגם התגובה demethylase (איור 2 ב):
EQ 3: H3K4me2 = 1
EQ 4: H3K4me = 2 - R 1 (1)
EQ 5: H3K4 = 3 - R 2 (1) - [R 1 (2 - R 1 (1))]
5. נציג תוצאות
שימוש LSD1, אנו מראים את היעילות של MassSQUIRM לכימותליזין demethylation. כפי שתואר בסעיף טקסט פרוטוקול, ביצענו assay demethylase עם ng 125 של LSD1 ו 0.25 di-methyl מיקרוגרם היסטון H3 פפטיד (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-ביוטין). שליטה ודוגמאות התגובה demethylase היו נתונים מתילציה רדוקטיבי ו ספקטרומטריית MALDI המונית. תגובת פקד לא עבר מתילציה רדוקטיבי הראה את המעטפה איזוטופי אופייני פפטיד זה ובתנאי אזורים השיא של משוואות 1 ו -2 (איור 2 א). הספקטרום המונית לתגובה demethylase בתנאי באזורים שיא עבור משוואות 3-5 (איור 2 ב). שימוש באזורים שיא השליטה והתגובה demethylase, קבענו כי LSD1 demethylated פפטיד לתת את תוצרי התגובה הבאים: 33.7% di-methyl Lys4, 42.3% מונו מתיל Lys4, ו -24% בלתי מפוגל ליס 4. עיין בלייר ואחרים. ניתוח מלא של הפעילות LSD1 demethylase כמו גם מחקרים מעכב 6. שים לב משתנים משתנים כגון אנזימים, זמן תגובהריכוז ריכוז המצע תאפשר ניתוח מעמיק של פעילות.
באיור 1. סקירה MassSQUIRM. (א) פפטיד N-מסוף מ היסטון H3 מוצג בתור בלתי (ירוק), מונו (אדום), או di-(כחול) מפוגל על ליזין 4. וריאציה בהרכב הכימי של הפפטיד כל מוביל יינון ההפרש ביצוע מורכבת כימות. (ב) מתילציה Reductive ממיר את כל שאריות ליזין למצב di-methyl הגורמת פפטידים כדי ליינן את כל דומה. השימוש פורמלדהיד כבד בתגובה מתילציה רדוקטיבי מאפשר שימור הזהות של מתילציה המקורי. חוגים פתוחים מצביעים מתילציה אור בעוד בחוגים סגורים עולה מתילציה כבדה. השתנה מן בלייר et al. 2011 6.
Figur2 ה. MassSQUIRM ניתן לכמת פפטידים מפוגל דיפרנציאלי. (א) DI-מפוגל סינתטי היסטון H3 פפטיד (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK-ביוטין) נותח באמצעות ספקטרומטר מסה יחסי שיא ביחס לשיא monoisotopic היו כאמור R 1 ו R 2 במשוואות 1 ו -2. (ב) פפטיד סינטטי באותו הודגר עם 125 LSD1 נג ב חיץ demethylase עבור שעתיים על 37 ° C. דוגמאות היו נתונים אז MassSQUIRM ניתוח. אוכלוסייה מעורבת של פסגות חופפים מייצג שלושה מצבי מתילציה שונים כפי שניתן לראות באיור 1 ב. באזורים שתחת פסגות monoisotopic היו כאמור 1, 2, ו 3. אזורי שיא שימשו משוואות 3-5. חוגים פתוחים מצביעים מתילציה אור בעוד בחוגים סגורים עולה מתילציה כבדה. השתנה מן בלייר ואחרים. 2011 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MassSQUIRM היא שיטה זולה כמותית לניתוח מקיף של פעילותו של demethylases ליזין המעורבים מונו ו מתילציה-di. MassSQUIRM מציע quantitation לא רק של המוצר התגובה אלא גם את התשומות. Assay זה יכול לשמש ככלי רב עוצמה בחקר מנגנון demethylases היסטון LSD1 אחרים. זה יהיה גם שימושי לסיווג אנזימים רבים שהתגלו לאחרונה demethylase ליזין כגון PHF8 ויכול לשמש methyltransferase אנזימים מסוימים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין לנו מה למסור.
Acknowledgments
אנו מודים UAMS Proteomics מתקן לתמיכה ספקטרומטריה. המימון לפרויקט זה סופק על ידי NIH מענקים P20RR015569, P20RR016460 ו R01DA025755.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LSD1 | BPS Biosciences | 50100 | |
| H3K4me2-biotin peptide | Prepared in Lab | none | |
| POROS R2 20 micron beads | Applied Biosystems | 1-1129-06 | |
| C18 ZipTip | EMD Millipore | ZTC18M | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 28904 | |
| acetonitrile | Fisher Scientific | A996 | |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | 85707 | |
| Borane dimethylamine | Sigma-Aldrich | 180238 | |
| isotopically heavy d2-formaldehyde | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-805-20 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP154 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33 | |
| Formic acid | Fluka | 06440 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452 | |
| Na-phosphate | Fisher Scientific | BP329 | |
| SpeedVac Concentrator | Savant | DNA110 | |
| MALDI-prOTOF mass spectrometer and TOFworks software | PerkinElmer, Inc. | none |
References
- Goldberg, A. D., Allis, C. D., Bernstein, E. Epigenetics: a landscape takes shape. Cell. 128, 635-638 (2007).
- Kouzarides, T.
- Blair, L. P., Cao, J., Zou, M. R., Sayegh, J., Yan, Q. Epigenetic Regulation by Lysine Demethylase 5 (KDM5) Enzymes in Cancer. Cancers (Basel). 3, 1383-1404 (2011).
- Cole, P. A. Chemical probes for histone-modifying enzymes. Nat. Chem. Biol. 4, 590-597 (2008).
- Shi, Y. Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell. 119, 941-953 (2004).
- Blair, L. P. MassSQUIRM: An assay for quantitative measurement of lysine demethylase activity. Epigenetics. 6, 490-499 (2011).
- Rayment, I. Three-dimensional structure of myosin subfragment-1: a molecular motor. Science. 261, 50-508 (1993).
- Collom, S. L., Jamakhandi, A. P., Tackett, A. J., Radominska-Pandya, A., Miller, G. P. CYP2E1 active site residues in substrate recognition sequence 5 identified by photoaffinity labeling and homology modeling. Arch. Biochem. Biophys. 459, 59-69 (2007).
- Gradolatto, A. Saccharomyces cerevisiae Yta7 Regulates Histone Gene Expression. Genetics. 179, 291-304 (2008).
- Taverna, S. D. Yng1 PHD finger binding to histone H3 trimethylated at lysine 4 promotes NuA3 HAT activity at Lysine 14 of H3 and transcripiton at a subset of targeted ORFs. Mol. Cell. 24, 785-796 (2006).
