Summary
हम MALDI मास स्पेक्ट्रोमेट्री और reductive मेथिलिकरण रसायन शास्त्र का उपयोग करने के लिए lysine मेथिलिकरण में बदलाव यों के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं.
Protocol
यह प्रोटोकॉल ब्लेयर एट अल से संशोधित किया गया है 6.
1. LSD1 Demethylation परख
- 20 μL की एक अंतिम मात्रा में, 0.25 μg di मिथाइल demethylase बफर में histone H3 (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK - बायोटिन) पेप्टाइड (50 मिमी Tris - सीएल 8.5 पीएच, 50 मिमी KCl, 5 मिमी 2 MgCl, 5% के साथ 125 एनजी पुनः संयोजक LSD1 गठबंधन ) ग्लिसरॉल. इसके अतिरिक्त, कोई एंजाइम के साथ एक पेप्टाइड अकेले नियंत्रण करते हैं. नियंत्रण धारा 3 के लिए है और है reductive मेथिलिकरण की जरूरत नहीं है.
- 37 पर 2 घंटे के लिए सेते हैं डिग्री सेल्सियस
- पेप्टाइड्स इकट्ठा, प्रत्येक नमूना के लिए 8 μL Poros R2 के 20 माइक्रोन मोती जोड़ सकते हैं और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए आंदोलन. मेथनॉल का एक मात्रा के साथ मोतियों की मात्रा 1 निलंबित Poros मोती तैयार है, और तो 5% चींटी एसिड / 0.2% TFA के 10 खंडों को जोड़ने.
- दो हालत सी टिप में 0.1% TFA के 20 μL aspirating और यह वापस एक pipettor के साथ बाहर धक्का द्वारा 18 ZipTips. यह दो बार करो टी के साथ 0.1%एफए, 70% acetonitrile के साथ चार बार / TFA 0.1%, और फिर 0.1% TFA के साथ चार बार.
- के वातानुकूलित सी 18 ZipTips पर 18 ZipTips में सी राल के पीछे मनका घोल pipetting और pipettor साथ के माध्यम से मात्रा धक्का द्वारा दो नमूने (नियंत्रण और demethylase प्रतिक्रिया) लोड.
- ZipTips दो बार धो 0.1% TFA के 20 μL के साथ.
- 70% acetonitrile / 0.1% TFA 40 μL में Elute.
- Lyophilize प्रत्येक eluant पूरी तरह से एक SpeedVac concentrator के साथ.
2. Reductive मेथिलिकरण
प्रोटोकॉल के इस भाग ब्लेयर एट अल से संशोधित किया गया है और Rayment एट अल. 6,7.
- 50 मिमी फॉस्फेट बफर, 7.4 पीएच के 100 μL में demethylase प्रतिक्रिया को फिर से रोक देते हैं.
- Demethylase प्रतिक्रिया, 15 मिलीग्राम / एमएल borane dimethylamine 8 μL जोड़ें. Borane dimethylamine 50 मिमी फॉस्फेट बफर, 7.4 पीएच में भंग कर रहा है, 15 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक समाधान दे.यह ताजा किया जाना चाहिए.
- Demethylase प्रतिक्रिया, 250 मिमी deuterated formaldehyde के 16 μL जोड़ें. 250 मिमी deuterated formaldehyde 0 एच 2 में कमजोर स्टॉक से तैयार है. यह ताजा किया जाना चाहिए.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए सेते हैं.
- 2.2, 2.3 और 2.4 के चरणों को दोहराएँ.
- 2.2 कदम दोहराएँ.
- 4 में सेते हैं डिग्री सेल्सियस ~ 15 घंटे के लिए.
- Demethylase नमूना, 1M Tris, 7.4 पीएच reductive मेथिलिकरण प्रतिक्रिया बुझाना 12.5 μL जोड़ें.
3. MALDI मास स्पेक्ट्रोमेट्री
- Demethylase प्रतिक्रिया Poros R2 के 20 माइक्रोन मोती जोड़ें, और ZipTips पर जमा के रूप में 1.3-1.6 चरणों में वर्णित है.
नोट: 50 मिमी फॉस्फेट बफर, 7.4 पीएच के 100 μL में नियंत्रण पुनः निलंबित और अन्य नमूना 3.1 कदम पर शुरू के रूप में व्यवहार.
- एक MALDI नमूना है 33% तर 2 μL का उपयोग थाली पर नियंत्रण और ZipTips से demethylase प्रतिक्रिया के नमूने Eluteघ एसिड 2,5-dihydroxybenzoic. 33% 2,5-dihydroxybenzoic एसिड को तैयार करने के लिए, 70% acetonitrile / 0.1% TFA में 2,5-dihydroxybenzoic एसिड की एक संतृप्त समाधान बनाने और फिर 33% 70% acetonitrile / 0.1% TFA में संतृप्त करने के लिए पतला. Eluted नमूनों सूखे और मणिभ बनाना करने के लिए अनुमति देते हैं.
- जन स्पेक्ट्रा का उपयोग कर एक PerkinElmerSciex जन MALDI-prOTOF स्पेक्ट्रोमीटर या उपलब्ध उच्च संकल्प MALDI मास स्पेक्ट्रोमीटर 8,9,10 लीजिए.
- इस स्पेक्ट्रा देखें और निकालने के शिखर क्षेत्रों PerkinElmerSciex TOFworks सॉफ्टवेयर या सॉफ्टवेयर मास स्पेक्ट्रोमीटर निर्माता द्वारा प्रदान का उपयोग कर.
- 2 एमएस द्वारा उपलब्ध जन spectrometric अग्रानुक्रम मास spectrometric क्षमताओं प्रदान प्रणाली के साथ प्रतिक्रिया उत्पादों सत्यापित करें.
4. डेटा विश्लेषण
- आदेश के समस्थानिक भारी formaldehyde (चित्रा 1 बी) का उपयोग करके बनाया ओवरलैप के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए, शिखर क्षेत्र (ए) अनुपात 13 2 सी और 13 सी 4 आइसोटोप relativ निर्धारितनियंत्रण नमूना, जो reductive मेथिलिकरण (2A छवि) नहीं आया है के लिए monoisotopic शिखर ई.
1 eq: एक 13C2 / एक 12C = 1 आर
2 eq: 13C4 / 12C = r 2
यह आपको इन के समस्थानिक राज्यों में मौजूदा पेप्टाइड का अनुपात (1 आर एंड आर 2) अपने प्रयोग मास स्पेक्ट्रोमीटर के लिए विशिष्ट दे देंगे. - Demethylase प्रतिक्रिया नमूने में प्रत्येक संशोधन राज्य (छवि 2B) में मौजूदा पेप्टाइड के रिश्तेदार राशि बढ़ाता के लिए निम्न सूत्रों में 1 आर एंड R 2 मूल्यों का उपयोग करें:
3 eq: H3K4me2 = 1 ए
4 eq: = 2 एक H3K4me - आर 1 (1 ए)
5 eq: H3K4 के = 3 एक - r 2 (1 ए) [1 आर (एक 2 - आर 1 (1 एक))]
5. प्रतिनिधि परिणाम
LSD1 का उपयोग करना, हम बढ़ाता लिए MassSQUIRM की प्रभावशीलता को दिखाने केलाइसिन demethylation. रूप में प्रोटोकॉल पाठ खंड में वर्णित है, हम LSD1 की 125 एनजी और 0.25 di मिथाइल μg histone H3 पेप्टाइड (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK - बायोटिन) के के साथ एक demethylase परख प्रदर्शन किया है. नियंत्रण और demethylase प्रतिक्रिया नमूने reductive मेथिलिकरण और MALDI मास स्पेक्ट्रोमेट्री के अधीन थे. नियंत्रण प्रतिक्रिया है कि reductive का मेथिलिकरण नहीं गुजरना था इस पेप्टाइड के लिए ठेठ समस्थानिक लिफाफा दिखाया और 1 समीकरण और 2 (2A चित्रा) के लिए शिखर क्षेत्रों प्रदान की. demethylase प्रतिक्रिया के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम 3-5 समीकरण (चित्रा 2 बी) के लिए शिखर क्षेत्रों में प्रदान की है. नियंत्रण और demethylase प्रतिक्रिया से शिखर क्षेत्रों का उपयोग करना, हम निर्धारित किया है कि LSD1 पेप्टाइड demethylated निम्न प्रतिक्रिया उत्पादों दे: 33.7% Lys4 di मिथाइल, 42.3% मोनो मिथाइल Lys4, और 24% संयुक्त राष्ट्र methylated Lys 4. ब्लेयर एट अल LSD1 demethylase गतिविधि का पूरा विश्लेषण के रूप में अच्छी तरह के रूप में अवरोध करनेवाला 6 अध्ययन के लिए. का संदर्भ लें. ध्यान दें कि प्रतिक्रिया समय, एंजाइम के रूप में बदल चरएकाग्रता और एकाग्रता सब्सट्रेट गतिविधि का एक में गहराई से विश्लेषण के लिए अनुमति देगा.
चित्रा 1 MassSQUIRM सिंहावलोकन. (ए) histone H3 से एक एन टर्मिनल पेप्टाइड के रूप में किया जा रहा दिखाया गया है संयुक्त राष्ट्र (हरा), मोनो (लाल), या di (नीला) 4 lysine में methylated में. प्रत्येक पेप्टाइड की रासायनिक संरचना में भिन्नता अंतर ionization मात्रा का ठहराव जटिल बनाने के लिए होता है. (बी) reductive मेथिलिकरण di मिथाइल राज्य है जो सभी पेप्टाइड्स इसी तरह योण बनाना करने के लिए कारण बनता सभी लाइसिन अवशेषों धर्मान्तरित. reductive मेथिलिकरण प्रतिक्रिया में भारी formaldehyde के उपयोग मूल मेथिलिकरण की पहचान की अवधारण की अनुमति देता है. ओपन हलकों प्रकाश मेथिलिकरण से संकेत मिलता है जबकि बंद हलकों भारी मेथिलिकरण से संकेत मिलता है 2011 ब्लेयर एट अल. 6 से संशोधित.
Figurई 2 MassSQUIRM. विभिन्न methylated पेप्टाइड्स मात्रा ठहराना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. (ए) एक di methylated सिंथेटिक histone H3 पेप्टाइड (ARTKme2QTARKSTGGKAPRKQLYK - बायोटिन) मास स्पेक्ट्रोमेट्री और चोटी monoisotopic चोटी के सापेक्ष अनुपात का उपयोग कर रहे थे 1 आर और आर समीकरणों 1 और 2 में 2 के रूप में विख्यात विश्लेषण किया गया था. (बी) एक ही सिंथेटिक पेप्टाइड 125 demethylase बफर में दो घंटे के लिए एनजी LSD1 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated रहे किया गया था नमूने तो के विश्लेषण MassSQUIRM किए गए. चोटियों अतिव्यापी के एक मिश्रित आबादी तीन अलग अलग मेथिलिकरण के रूप में चित्रा 1 बी में देखा राज्यों का प्रतिनिधित्व करता है. Monoisotopic चोटियों के तहत क्षेत्र 1, 2, और एक 3 के रूप में उल्लेख किया गया. शिखर क्षेत्रों 3-5 समीकरणों में इस्तेमाल किया गया है. ओपन हलकों प्रकाश मेथिलिकरण से संकेत मिलता है जबकि बंद हलकों भारी मेथिलिकरण से संकेत मिलता है ब्लेयर एट अल से संशोधित. +२,०११ 6.
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Discussion
MassSQUIRM लाइसिन मोनो और di मेथिलिकरण में शामिल demethylases की गतिविधि के व्यापक विश्लेषण के लिए एक सस्ता और मात्रात्मक विधि है. MassSQUIRM न केवल प्रतिक्रिया के उत्पाद की लेकिन यह भी मध्यवर्ती के लिए quantitation प्रदान करता है. इस परख की LSD1 और अन्य histone demethylases के तंत्र का अध्ययन करने में एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. यह भी कई नव की खोज की PHF8 जैसे लाइसिन demethylase एंजाइमों वर्गीकृत और कुछ मिथाइल एंजाइमों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के लिए उपयोगी हो जाएगा.
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Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम लिए सामूहिक spectrometric समर्थन UAMS प्रोटिओमिक्स सुविधा धन्यवाद. इस परियोजना के लिए अनुदान के एनआईएच P20RR015569 अनुदान, P20RR016460 और R01DA025755 द्वारा प्रदान किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LSD1 | BPS Biosciences | 50100 | |
| H3K4me2-biotin peptide | Prepared in Lab | none | |
| POROS R2 20 micron beads | Applied Biosystems | 1-1129-06 | |
| C18 ZipTip | EMD Millipore | ZTC18M | |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 28904 | |
| acetonitrile | Fisher Scientific | A996 | |
| 2,5-dihydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | 85707 | |
| Borane dimethylamine | Sigma-Aldrich | 180238 | |
| isotopically heavy d2-formaldehyde | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-805-20 | |
| Tris | Fisher Scientific | BP154 | |
| KCl | Fisher Scientific | BP366 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | G33 | |
| Formic acid | Fluka | 06440 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452 | |
| Na-phosphate | Fisher Scientific | BP329 | |
| SpeedVac Concentrator | Savant | DNA110 | |
| MALDI-prOTOF mass spectrometer and TOFworks software | PerkinElmer, Inc. | none |
References
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