Summary
इस विधि H1N1 के एक उच्च संवेदनशीलता पर bronchioalveolar पानी से धोना (बाल) के संक्रमित चूहों के तरल पदार्थ में पता लगाने के लिए इन्फ्रारेड डाई आधारित इमेजिंग प्रणाली का उपयोग का वर्णन करता है. 96 एक में इस पद्धति का प्रदर्शन किया जा सकता है - या थाली 384 अच्छी तरह से, <10 परीक्षण सामग्री का μl मात्रा की आवश्यकता है और कई रोगजनकों के समवर्ती स्क्रीनिंग के लिए क्षमता है.
Protocol
1. MDCK कोशिकाओं संस्कृति
- संस्कृति 5 लाख MDCK टी 75 10% FBS, 100 यू / मिलीलीटर पेनिसिलिन, में स्ट्रेप्टोमाइसिन 100 / μg मिलीग्राम, 1 मिमी सोडियम पाइरूवेट, 7.5% सोडियम बिकारबोनिट के 5% के साथ सेमी की RPMI1640 पूरा मध्यम 20 मिलीलीटर में 2 कुप्पी में रातोंरात कोशिकाओं और एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 0,001% β-mercaptoethanol समाधान 5.2% सीओ 2 के साथ संचार.
2. PR8 संक्रमण और बाल द्रव संग्रह
- से चैलेंज C57BL / 6 चूहों intranasally PR8 बाँझ पीबीएस वायरस के एक नथुने के माध्यम से एक 30 μl की कुल मात्रा में 5,000 Pfu के साथ. नकली वायरस के बिना केवल बाँझ पीबीएस का उपयोग संक्रमण कैर्री.
- 0 चूहों, 2, 4 और 7 दिनों के संक्रमण के बाद Euthanize और वक्ष गुहा को खोलने और यह बेनकाब माउस के फर के माध्यम से एक 1 सेमी चीरा ट्रेकिआ समानांतर कटौती.
- ट्रेकिआ के समीपस्थ पहलू पर एक midline चीरा के बनाओ.
- पीबीएस - 1% BSA के 0.5 मिलीग्राम के साथ ट्रेकिआ पानी में डालना और बीए महाप्राण (व्यंजन)एल तरल पदार्थ. बाल तरल पदार्थ -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में संग्रहीत किया जा सकता है जब तक इस्तेमाल किया.
3. वायरस और लाइट - भ्रष्टाचार ओडिसी के साथ वायरल मैट्रिक्स प्रोटीन (M2) का पता लगाने के संक्रमण
- इन्फ़रा लाल डाई संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए वायरल titers यों, T-75 सेमी 2 बोतल और ऑप्टिकल फ्लैट नीचे काले रंग में उन्हें थाली से MDCK कोशिकाओं फसल 96 अच्छी तरह से (अच्छी तरह से प्रति 10,000 सेल) या 384 (अच्छी तरह से प्रति 5,000 कोशिकाओं ) प्लेटें. 37 पर रात भर के लिए MDCK कोशिकाओं संस्कृति ° सी में RPMI1640 पूरा मध्यम और सीरम मुक्त DMEM युक्त (0.2%, वजन / मात्रा) बीएसए, पेनिसिलिन (100 यू / मिलीलीटर), स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 μg / एमएल), सोडियम के साथ दो बार धोने पाइरूवेट (1 मिमी), सोडियम बाइकार्बोनेट (7.5% 5%) समाधान और β mercaptoethanol (0.001%).
- बाल (384 अच्छी तरह से थाली के लिए 50 μl 96 अच्छी तरह से थाली या 10 μl के लिए) तरल पदार्थ या बराबर मात्रा के साथ एक अच्छी तरह से जाना जाता titers (96 अच्छी तरह से थाली या 384 के लिए 10 μl के लिए 50 μl साथ PR8 वायरस के साथ MDCK कोशिकाओं सेते हैं - थाली DMEM मध्यम अच्छी तरह से),युक्त एल 1 tosylamido - 2 - phenylethyl chloromethyl ketone (TPCK) के trypsin (0.2 μg / एमएल) का इलाज.
- संक्रमण के 1 घंटे के बाद, 100 (96 अच्छी तरह से थाली) μl या 10% प्रत्येक अच्छी तरह से RPMI1640 पूरा मध्यम FBS युक्त 20 μl (384 - अच्छी तरह से थाली) जोड़ें.
- संवर्धन MDCK कोशिकाओं के संक्रमण की एक और 16 घंटे के लिए जारी रखें, MDCK कोशिकाओं 100 (96 अच्छी तरह से थाली) एक पीबीएस 1% BSA समाधान या 20 μl μl (384 - अच्छी तरह से थाली) के साथ दो बार और धोने 100 μl (96 अच्छी तरह से साथ तय ) थाली या 5 मिनट के लिए 1% paraformaldehyde 20 μl (384 अच्छी तरह से थाली).
- फिक्सिंग के बाद, 100 (96 अच्छी तरह से थाली) μl या रोकने के लिए 20 μl (384 - अच्छी तरह से थाली) पीबीएस - 1% BSA के साथ 30 मिनट के लिए आगे MDCK कोशिकाओं को सेते हैं.
- M2 प्रोटीन के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ 1 घंटे (1:1000, पीबीएस-1% BSA में पतला) लिए MDCK कोशिकाओं सेते हैं अवरुद्ध करने के बाद. पतला एंटीबॉडी का अच्छी तरह से और 20 μl प्रति 50 μl प्रति 96 या 384 अच्छी तरह से अच्छी तरह से प्लेट में अच्छी तरह से क्रमशः, का उपयोग करें.
- MDCK कोशिकाओं 100 μl (96 अच्छी तरह से थाली के साथ तीन बार धो) या 20 पीबीएस युक्त (1 घंटे के लिए 50 (96 - अच्छी तरह से थाली μl) या 20 (384 - अच्छी तरह से थाली) μl बकरी विरोधी माउस IRDye के @ 800 माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ 1% BSA और सेते हैं μl (384 - अच्छी तरह से थाली) 1:200) कमजोर पड़ने.
- पीबीएस युक्त 1% BSA 100 μl के साथ MDCK कोशिकाओं तीन बार धो. ओडिसी लाइट - भ्रष्टाचार आईआर स्कैनर के पढ़ने कांच मंच पर दाग प्लेटें प्लेस और एक 96 के लिए पाठक सेट - या 384 अच्छी तरह से थाली पढ़ने.
- रिक्त नकारात्मक नियंत्रण कुओं लाइट - भ्रष्टाचार ओडिसी सॉफ्टवेयर का उपयोग कर सेट किया जा सकता है. लाइट - भ्रष्टाचार ओडिसी सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्लेट के भीतर पूरी थाली या चयनित कुओं यों.
- ऑटो आकार उपकरण का उपयोग, एक परीक्षण के बीच में 96 की एक लक्ष्य क्षेत्र (आरओआई) की सीमाओं को आकर्षित - या 384 - अच्छी तरह प्लेटें. रॉय के निर्माण सॉफ्टवेयर परिभाषित पृष्ठभूमि कुओं वायरस titrated नमूने के लिए की तुलना करने के लिए अनुमति देता है.
- पूरी परख के लिए आधारभूत मूल्य निर्धारित करने के लिए, एक पृष्ठभूमि की लागत पर लाभ का उपयोग करें. दो परस्पर विरोधी पार measu रॉय के भीतर ओडिसी सॉफ्टवेयर द्वारा प्रदान की बाल परिचयफिर से अच्छी तरह से भर प्रतिदीप्ति की तीव्रता.
- 780 एनएम चैनल और पता लगाने के लिए एक ओडिसी लाइट - भ्रष्टाचार IR स्कैनर में संदर्भ तरंगदैर्ध्य के रूप में 680 एनएम का उपयोग प्लेट स्कैन.
- एक बार 'पढ़ें' कमांड सक्रिय है, रॉय के समान अंतराल पर फ्लोरोसेंट तीव्रता और मापा जाएगा एकत्र डेटा एकीकृत अंक. एक मानक विचलन गुणक आधारभूत है कि के आरओआई दृढ़ संकल्प में शामिल है पर संकेत के स्तर को निर्धारित करेगा.
- पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति नकली संक्रमित या माध्यमिक एंटीबॉडी अकेले नियंत्रण से मात्रा जाएगा और परीक्षण कुओं में एकीकृत तीव्रता का अनुमान करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
- गणना के लिए एकीकृत तीव्रता 'चुना क्योंकि यह एक परिभाषित व्यक्तिगत स्थान के लिए शुद्ध पिक्सेल मात्रा का प्रतिनिधित्व करता है और सुविधा आकार के स्वतंत्र है. ज्ञात वायरल titers से मानक वक्र का उपयोग करने के लिए अज्ञात नमूनों की वायरल titers की गणना करने के लिए. एक लंबे प्रक्षेप वक्र प्रयोग ठीक वायरल titers की गणना के. वी गणनामानक वक्र के साथ परीक्षण के नमूने की तीव्रता की तुलना द्वारा परीक्षण नमूनों में iral titers.
4. प्रतिनिधि परिणाम
आईआर डाई आधारित उच्च throughput वायरल पहचान प्रणाली का मानकीकरण
PR8 वायरस MDCK कोशिकाओं को संक्रमित कर सकते हैं, इसलिए, हम इस परख के विकास के लिए इन कोशिकाओं का इस्तेमाल किया. हम वायरल इन्फ्लूएंजा वायरल मैट्रिक्स प्रोटीन (M2) के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग titers मापा. अन्य तरीके के विपरीत में, हम एक माध्यमिक एंटीबॉडी है कि एक के पास IR डाई संयुग्मित है. यह विधि एक सरल, स्वचालित PR8 वायरस अनुमापांक प्रतिदीप्ति तीव्रता है कि जबकि M2 प्रोटीन का पता लगाने उत्पन्न होता है का उपयोग दृढ़ संकल्प प्रदान करता है. इन्फ्लूएंजा वायरस के संक्रमण के बाद, M2 प्रोटीन अनुवाद है, पहुँचाया और मेजबान कोशिका की सतह सहित सेल में जम जाता है. इस प्रकार, M2 प्रोटीन की मात्रा एक औसत दर्जे का वायरस की मात्रा निर्धारित करने के लिए पैरामीटर का प्रतिनिधित्व करता है. से तीव्रता तुलनामानक वक्र के साथ परीक्षण के नमूने वायरल titers की सटीक माप उपलब्ध कराता है.
प्रतिदीप्ति आधारित पद्धति की प्रभावकारिता निर्धारित करने के लिए, हम सुसंस्कृत 10 4 MDCK कोशिकाओं / कक्ष में अच्छी तरह से रात में स्लाइड. ज्ञात titers की PR8 वायरल शेयरों अलग पट्टिका गठन इकाइयों (pfu) के साथ कुओं की नकल करने के लिए जोड़ा गया था और एक घंटे के लिए कोशिकाओं पर सोखना करने के लिए अनुमति दी. कोशिकाओं 16 ज के लिए incubated रहे थे करने के लिए वायरस का प्रचार करने के लिए अनुमति देते हैं. इस के बाद, कक्ष स्लाइड में MDCK कोशिकाओं 1% paraformaldehyde के साथ तय किया गया है, धोया और विरोधी M2 एंटीबॉडी के साथ दाग 1 ज के लिए, एक अतिरिक्त 1 घंटे के लिए 488 संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी AlexaFluor द्वारा पीछा किया. Confocal संक्रमित MDCK कोशिकाओं के सूक्ष्म विश्लेषण का प्रदर्शन पक्षपाती monolayer काफी हद तक बरकरार था और PR8 व्युत्पन्न M2 प्रोटीन बहुतायत को संक्रमित MDCK कोशिकाओं (चित्र 1 ए) के अंदर मौजूद था. Fluorescing कोशिकाओं के रूप में कम के रूप में वायरल titers साथ संक्रमण में पता लगाया जा सकता है 10 2
इसलिए, एक सटीक वायरल आकलन विधि की स्थापना के लिए हम एक IR डाई आधारित पता लगाने और मात्रा का ठहराव प्रणाली कार्यरत हैं. MDCK कोशिकाओं (10 4 अच्छी तरह /) 96 अच्छी तरह प्लेटें, PR8 और वायरल प्रोटीन के साथ संक्रमित में संवर्धित किया गया विरोधी M2 एक IR डाई संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के बाद का उपयोग कर पाया गया है. विरोधी M2 एंटीबॉडी के उपयोग हमें वायरल मात्रा का एक सीधा मीट्रिक के रूप में प्रतिजन विशेष प्रतिदीप्ति तीव्रता का उपयोग करने की अनुमति दी. प्रतिदीप्ति तीव्रता को एन्यूमरेट करने के लिए, हम लाइट - भ्रष्टाचार ओडिसी आधारित आईआर स्कैनर का इस्तेमाल किया. इस प्रणाली में दो लेजर बस चैनल का उपयोग करता हैएड आईआर detections fluorophores की पहचान करने के लिए और उन्हें पृष्ठभूमि शोर से अलग है. पहला चैनल 680 एनएम उत्तेजित और मदद करने के लिए पृष्ठभूमि यों के 700 एनएम उत्सर्जन करता है. दूसरे चैनल 780 एनएम उत्तेजित कि fluorophores का पता लगाता है और 800 एनएम पर फेंकना. लाइट - भ्रष्टाचार ओडिसी में PR8 संक्रमित MDCK कोशिकाओं के स्कैन एक वायरल अनुमापांक है निर्भर उज्ज्वल प्रतिदीप्ति (चित्रा 1 बी) ने संकेत दिया. M2 सकारात्मक फ्लोरोसेंट MDCK कोशिकाओं कुओं (चित्रा 1 बी) के अंदर स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे थे. वायरस अनुमापांक 10 2 -10 5 pfu से शुरू करने के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता का एक सकारात्मक सहसंबंध लगातार मनाया जा सकता है. PR8 वायरल titrations 10 6 Pfu कोशिका मृत्यु के लिए सीसा, जो परख की संवेदनशीलता के लिए एक ऊपरी सीमा सेट की तुलना में अधिक है. न्यूनतम लेकिन detectable धनात्मकता लगातार देखा साथ 10 -10 2 3 pfu PR8 वायरल titers पास आईआर रंगों की उच्च संवेदनशीलता का प्रदर्शन किया. संकेत से शोर अनुपात moc की तुलना द्वारा निर्धारित किया गया थाकश्मीर संक्रमित या है निर्धारण एंटीबॉडी का इलाज MDCK कोशिकाओं. इन नियंत्रणों के दोनों प्रतिदीप्ति नगण्य या undetectable स्तर (चित्रा 1 बी) में हुई.
आगे संवेदनशीलता में सुधार और परीक्षण नमूना मात्रा आवश्यकताओं को कम करने के लिए, हम 5 संक्रमित × 10 3 384 अच्छी तरह से प्लेट में MDCK कोशिकाओं / अच्छी तरह से. PR8 के विभिन्न PFUs धारावाहिक एक लॉग इन dilutions (चित्रा 1C) के रूप में परीक्षण किया गया. 384 अच्छी तरह से प्लेटों से जांच की संवेदनशीलता 96 अच्छी तरह से थाली assays के बराबर था. 1 दोनों 10 और 10 2 Pfu 384 अच्छी तरह से प्लेट में लगातार 96 अच्छी तरह प्लेटें तुलना में बेहतर काम किया है. से 96 प्रतिदीप्ति तीव्रता का प्रयोग या 384 अच्छी तरह से थाली प्रारूपों, हम मानक अनुमापन घटता (चित्रा -1) का निर्माण किया. इन गणनाओं में पहले चर वायरल अनुमापांक है जबकि दूसरा चर प्रतिदीप्ति तीव्रता है. इसलिए, हम घातीय वितरण वक्र फिट determ उत्पन्नवायरल titers और प्रतिदीप्ति तीव्रता के बीच बहुपद संबंधों ine. हम भी हमारी टिप्पणियों की पुष्टि की है एक और एंटीबॉडी कि PR8 वायरस (एनपी) nucleoprotein (नहीं दिखाया डेटा) के खिलाफ निर्देशित है का उपयोग कर. PR8 उपभेदों के विशिष्ट सूत्रों ने यह भी है कि विरोधी एनपी या विरोधी M2 एंटीबॉडी (नहीं दिखाया डेटा) के साथ परीक्षण किया गया MDCK कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया गया. सामूहिक रूप से, हम निष्कर्ष है कि आईआर डाई आधारित प्रोटीन प्रणाली का पता लगाने में मदद कर सकते हैं उपभेदों वायरल संक्रमण का निदान और ठीक संक्रमण रोगज़नक़ों के अनुमापांक को एन्यूमरेट.
वायरल titers की गणना करने के लिए गणितीय विचारों
प्रतिदीप्ति तीव्रता और अनुमापांक निर्धारण की गणितीय गणना कर रहे हैं के रूप में नीचे वर्णित है. धुंधला प्रक्रिया के बाद, पूरी थाली या प्लेट के भीतर चयनित कुओं लाइट - भ्रष्टाचार ओडिसी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके मात्रा निर्धारित कर रहे हैं. ऑटो आकार उपकरण का उपयोग, एक लक्ष्य क्षेत्र (आरओआई) की सीमाओं को 96 वर्ष की परीक्षा कुओं के बीच में तैयार किया गया था या 384 हमकरेंगे प्लेट (चित्रा 2A और बी). रॉय के निर्माण सॉफ्टवेयर परिभाषित पृष्ठभूमि कुओं वायरस titrated नमूने के लिए की तुलना करने के लिए अनुमति देता है. एक पृष्ठभूमि लागत पर लाभ के पूरी परख लिए में आधारभूत मूल्य निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. दो परस्पर विरोधी पार बाल (सफेद) अच्छी तरह से (चित्रा -2) के पार प्रतिदीप्ति की तीव्रता को मापने के लिए लागत पर लाभ के भीतर शुरू किए गए थे. सही पक्ष और चित्र 2C में प्रतिनिधि कुओं के नीचे से घटता इन पार बाल के साथ पिक्सेल की तीव्रता का प्रतिनिधित्व करते हैं. फ्लोरोसेंट तीव्रता लागत पर लाभ की वर्दी अंतराल पर मापा गया और एकत्र डेटा बिंदु एकीकृत किया गया. एक मानक विचलन गुणक आधारभूत कि आरओआई दृढ़ संकल्प में शामिल किया गया था पर संकेत के स्तर को निर्धारित की. पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति नकली संक्रमित या माध्यमिक एंटीबॉडी अकेले नियंत्रण से मात्रा निर्धारित किया गया था और परीक्षण कुओं में एकीकृत तीव्रता का अनुमान करने के लिए इस्तेमाल किया. हम गणना के लिए एकीकृत तीव्रता चुना क्योंकि यह REPRESपिता शुद्ध पिक्सेल मात्रा परिभाषित व्यक्तिगत स्थान के लिए और सुविधा आकार के स्वतंत्र है. इसके अलावा, एकीकृत तीव्रता काफी संकल्प के स्वतंत्र है. कुल तीव्रता / पिक्सेल (आई) के संकेत से उत्पन्न होने वाली तीव्रता से मेल खाती है पिक्सेल () क्षेत्र से अधिक पिक्सेल क्षेत्र (ख) की पृष्ठभूमि से उत्पन्न होने के संकेत में अच्छी तरह से चयनित है. इसलिए, पिक्सेल के लिए 'मैं'
मैं = मैं मैं + मैं ख मैं
पिक्सेल मात्रा दोनों संकेत की भयावहता और क्षेत्र में वितरित किया जाता है का प्रतिनिधित्व करता है. संकेत क्षेत्र संकेत पैदा कर रहा है नमूने के वितरण से संबंधित है. पिक्सेल की मात्रा कुल संकेत पिक्सेल में मापा क्षेत्र में पिक्सेल (क) 'मैं' बार अपनी ऊंचाई (मैं) के लिए बराबर है. पिक्सेल के लिए तो 'मैं'
vi = मैं मैं
कुल पिक्सेल मात्रा को इस प्रकार पूरे क्षेत्र से कुल संकेत का योग है:
| ; | पता | पता | |
| वी = | Σv मैं | = | aΣI मैं |
| मैं = 1 | मैं = 1 |
एकीकृत तीव्रता सभी सुविधा से घिरा पिक्सेल की तीव्रता मूल्यों की राशि चक्र / आयत (गिनती मिमी 2) के क्षेत्र से गुणा है. इसलिए, एकीकृत तीव्रता =
A (मैं b ΣI)
यहाँ, ख औसत पृष्ठभूमि पिक्सेल तीव्रता के लिए खड़ा है. यह सूत्र नियंत्रण या प्रयोगात्मक कुओं की एकीकृत संकेत तीव्रता गणना करता है और जिससे एक मानक वक्र स्थापित है. परीक्षण नमूनों में वायरल titers इस मानक वक्र का उपयोग कर की गणना की गई. एकाग्रता तीव्रता के एक निर्धारित लागत पर लाभ में प्रतिदीप्ति वर्तमान की मात्रा के रूप में परिभाषित किया गया है. परीक्षण नमूनों में सांद्रता calculaटेड एक ही छवि में निर्धारित मानकों की सांद्रता के लिए सापेक्ष. सटीक वायरल titers की गणना करने के लिए, प्रत्येक एकाग्रता मानक की तीव्रता साजिश रची है और एक लंबे प्रक्षेप की अवस्था के साथ सज्जित. परीक्षण के नमूने की सांद्रता मानक वक्र के भीतर क्षेत्र की तीव्रता की तुलना द्वारा की गणना कर रहे हैं.
वायरल titers इन्फ्लूएंजा संक्रमित चूहों के बाल द्रव से दृढ़ संकल्प
नैदानिक और प्रयोगशाला नमूनों में रहते इन्फ्लूएंजा वायरल कणों की जांच महत्वपूर्ण महत्व का है. इसलिए, हम अगले जांच की है कि क्या हम इस पद्धति का उपयोग करने के लिए प्रयोगशाला नमूनों में वायरल titers निर्धारित कर सकते हैं. बाल तरल पदार्थ गैर प्रतिरक्षित चूहों से एकत्र किए गए और PR8 वायरस के एक ज्ञात राशि के साथ बालीदार. बालीदार बाल तरल पदार्थ रैखिक वायरल titers गणना के लिए titrated गया. बालीदार बाल तरल पदार्थ की aliquots 96 अच्छी तरह प्लेटें में MDCK कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया गया, तय और विरोधी M2 और IR डाई संयुग्मित secondar साथ दागवाई एंटीबॉडी. चित्रा 3A में दिखाया परिणाम दिखाना है कि बालीदार बाल द्रव में वायरल titers detectable थे और मानक वक्र में PR8 titers साथ सहसंबद्ध है. मानक वक्र का प्रयोग, नुकीला और titrated बाल तरल पदार्थ में सटीक वायरल संख्या मात्रा निर्धारित किया गया था. घातीय वक्र फिट गणना बालीदार बाल द्रव (3B चित्रा) में वायरल titers की गणना करने के उपाय प्रदान की है. इस विधि के माध्यम से हम गणना और नुकीला वायरल titers के बीच उत्कृष्ट परस्पर प्राप्त किया है, इस दृष्टिकोण (चित्रा 3C) मान्य है.
अगला, हम PR8 संक्रमित चूहों से बाल तरल पदार्थ का विश्लेषण किया. PR8 बड़े पैमाने पर किया गया है murine मॉडल में इस्तेमाल मानव विकृति और विरोधी वायरल प्रतिरक्षा 3 को समझने की. चूहों के समूह intranasally PR8 के 5,000 Pfu साथ संक्रमित थे. चूहे वजन घटाने, hunched वापस की उपस्थिति, झालरदार फर और अन्य नैदानिक लक्षण के लिए निगरानी की गई. 0, 2, 4, 7, और 10 के बाद संक्रमण के दिन पर,चूहों और बलिदान बाल तरल पदार्थ एकत्र किए गए थे. इन प्रयोगशाला नमूनों का उपयोग करने के लिए, MDCK कोशिकाओं बाल तरल पदार्थ के धारावाहिक dilutions के साथ 50 μl की अंतिम मात्रा में incubated रहे थे 96 अच्छी तरह से प्लेट में 17 घंटे के लिए. MDCK स्टॉक PR8 वायरस ज्ञात titers के साथ संक्रमित कोशिकाओं का नियंत्रण कुओं के लिए एक मानक वक्र उत्पन्न सेवा. संक्रमण के बाद, कोशिकाओं रहे थे, धोया तय और विरोधी M2 प्राथमिक एंटीबॉडी के पास IR डाई संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के बाद के साथ दाग. MDCK कोशिकाओं है कि नकली संक्रमित या निर्धारण नियंत्रण के साथ इलाज के बाद संक्रमण अनुमापांक गणना के लिए पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रदान थे.
बाल तरल पदार्थ का विश्लेषण प्रदर्शन किया है कि नमूना प्रयोगशाला में PR8 वायरस के के आईआर परख डाई आधारित प्रणाली के माध्यम से detectable है. बाल द्रव में वायरल लोड में एक उल्लेखनीय वृद्धि 2 दिन और 4 के बाद संक्रमण (4A चित्रा) पर मनाया गया. एकीकृत तीव्रता की गणना संकेत दिया कि 2 दिन और 4 से बाल तरल पदार्थ मैं पोस्टnfection PR8 वायरस के महत्वपूर्ण स्तर (4B चित्रा) होता है. हमारे परिणाम PR8 संक्रमण के प्रारंभिक चरण के दौरान एक क्रमिक लेकिन महत्वपूर्ण वजन घटाने दिखाने के लिए, रोग की गंभीरता का प्रदर्शन. फिर भी, ज्यादातर चूहों रोग के लक्षण और वजन बढ़ने से उबरने के बाद 7 दिनों के संक्रमण (चित्रा 4C) शुरू कर दिया. 10 दिन के बाद संक्रमण में चूहों किसी भी detectable वायरस है, जो भी शरीर के वजन में वृद्धि और रोग के लक्षणों में काफी कटौती के साथ सहसंबद्ध की निकासी का संकेत PR8 अभाव है.
आगे इस परख के आवेदन का विस्तार करने के लिए, हम 2009 के एक परीक्षण एक (H1N1) मानव इन्फ्लूएंजा आईआर डाई आधारित एंटीबॉडी का पता लगाने प्रणाली के साथ अलग है और यह वास्तविक समय पीसीआर परख के साथ तुलना में. इस नैदानिक नमूना एक संयुक्त nasopharyngeal / गले संदिग्ध रोगी से प्राप्त झाड़ू से पृथक किया गया. अलग MDCK सेल लाइन में मिलवॉकी स्वास्थ्य विभाग प्रयोगशाला में प्रचारित किया गया था. परीक्षण के परिणाम कंपनियों थेआईआर विधि डाई आधारित वास्तविक समय पीसीआर assays के (चित्रा 5) के लिए संवेदनशीलता की जाँच करने के लिए लाल. परिणामों से संकेत मिलता है कि आईआर प्रतिरक्षी डाई आधारित प्रणाली का पता लगाने के लिए 10 3 50 TCID / मिलीलीटर, जो नैदानिक प्रासंगिकता के भीतर पीसीआर आधारित परख (10 50 TCID / एमएल) और गिरावट के लिए तुलनीय है के रूप में कम के रूप में वायरल लोड का पता लगाने की क्षमता है रेंज सबसे मरीज के नमूनों के लिए. इन परिणामों मजबूत सबूत है कि आईआर परख डाई आधारित प्रणाली पर्याप्त संवेदनशीलता और अनुसंधान प्रयोगशाला और नैदानिक सेटिंग में वायरल अनुमापांक के गणना के लिए लागू होने की संभावना है प्रदान करते हैं.
आकृति 1. आईआर डाई आधारित इन्फ्लूएंजा वायरस के प्रतिरक्षा पता लगाने. (ए) इन्फ्लूएंजा - संक्रमित MDCK, कोशिकाओं के 8 अच्छी तरह से कक्ष स्लाइड में Confocal सूक्ष्म विश्लेषण. Immunofluorescence सूक्ष्म विश्लेषण प्रदर्शन पक्षपाती MDCK monolayer काफी हद तक बरकरार है और वायरस से व्युत्पन्न एम के साथ भरी हुई है2 प्रोटीन. वायरल IR डाई और लाइट - भ्रष्टाचार ओडिसी प्रणाली पर आधारित titers (ई.पू.) की मात्रा. (डी) मानक घटता है और घातीय वक्र फिट प्रोफाइल की पीढ़ी. ई. में प्रस्तुत डेटा के पांच स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं.
चित्रा 2. वायरल titers आईआर रंगों का उपयोग कर का निर्धारण करने के क्रियाविधि विज्ञान (ए) एकीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता माप. परीक्षण कुओं (आरओआई) के अंदर एक परिभाषित क्षेत्र प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने के लिए चिह्नित किया गया था. ऑटो आकार उपकरण का प्रयोग, लागत पर लाभ की सीमाओं को 96 वर्ष की परीक्षण कुओं के बीच में तैयार किया गया है - या प्लेट 384 अच्छी तरह से. प्रतिदीप्ति लागत पर लाभ के भीतर अलग - अलग पिक्सेल (पिक्सेल n =) के रूप में मापा गया था. एकीकृत तीव्रता सभी सुविधा से घिरा पिक्सेल की तीव्रता मूल्यों की राशि चक्र / आयत (गिनती मिमी 2) के क्षेत्र से गुणा है. (बी) परख कुओं में एकीकृत प्रतिदीप्ति तीव्रता का निर्धारण. रॉय के निर्माणलाइट-भ्रष्टाचार के वायरस titrated नमूने को परिभाषित पृष्ठभूमि कुओं की तुलना स्कैनर की अनुमति दी. पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति नकली संक्रमित या माध्यमिक एंटीबॉडी अकेले नियंत्रण से मात्रा निर्धारित किया गया था और परीक्षण कुओं में एकीकृत तीव्रता का अनुमान करने के लिए इस्तेमाल किया. (सी) लागत पर लाभ के भीतर डेटा बिंदुओं का संग्रह. दो परस्पर विरोधी पार बाल (सफेद) अच्छी तरह से भर प्रतिदीप्ति की तीव्रता को मापने के लिए लागत पर लाभ के भीतर शुरू किए गए थे. सही पक्ष और नीचे प्रतिनिधि कुओं घटता इन पार बाल के साथ पिक्सेल की तीव्रता का प्रतिनिधित्व करते हैं.
चित्रा 3. पता लगाने और वायरस titers PR8 बालीदार बाल तरल पदार्थ की मात्रा का ठहराव () MDCK कोशिकाओं में 96 अच्छी तरह प्लेटें सुसंस्कृत गया रातोंरात और PR8 बालीदार बाल तरल पदार्थ के साथ जोड़ी. प्लेट्स ओडिसी लाइट - भ्रष्टाचार प्रणाली में पढ़ रहे थे. (बी) exogenously बालीदार बाल तरल पदार्थ मानक घटता के साथ तुलना में किया गया था. (सी) की गणना करने के लिए उम्मीद वीर की तुलना करें अल titers. घातीय वक्र फिटिंग वाई = 9.4784e 0.0014x प्रदान की है. एसी में प्रस्तुत डेटा के तीन स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं.
चित्रा 4. पता लगाने और इन्फ्लूएंजा वायरस की मात्रा का ठहराव PR8 संक्रमित चूहों से बाल तरल पदार्थ में (ए) चूहों के समूह intranasally PR8 की 5,000 pfu से संक्रमित थे. MDCK कोशिकाओं बाल तरल पदार्थ के धारावाहिक dilutions के साथ 17 घंटे के लिए 50 μl 96 अच्छी तरह से प्लेट में अंतिम मात्रा में incubated रहे थे. संक्रमण के बाद, कोशिकाओं रहे थे, धोया तय और विरोधी M2 प्राथमिक आईआर डाई संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी द्वारा पीछा एंटीबॉडी के साथ दाग. दाएँ पैनल मानक वक्र का प्रतिनिधित्व करता है. (बी) के संक्रमित चूहों के बाल द्रव में वायरल titers की मात्रा. (सी) चूहों के PR8 संक्रमण के दौरान वजन में कमी वायरल लोड के साथ सहसंबद्ध है. एसी में प्रस्तुत डेटा के तीन स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं.
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चित्रा 5. और 2009 की जांच की मात्रा का ठहराव एक मानव रोगी से एक (H1N1) महामारी इन्फ्लूएंजा (PDM) (ए) आईआर संक्रमित MDCK सेल लाइन का आधा गुना अनुमापन के लिए एंटीबॉडी डाई आधारित प्रतिदीप्ति प्रणाली का पता लगाने के अलग. प्रतिदीप्ति परिणामों से संकेत मिलता है परख के लिए 10 3 TCID 50 मिलीग्राम / के रूप में कम के रूप में वायरल लोड का पता लगाने की क्षमता है. (बी) न्यूक्लिक एसिड संस्कृति से निकाले एक ज्ञात titered H1N1 के धारावाहिक दस गुना dilutions के साथ साथ सीडीसी वास्तविक समय पीसीआर 12 परख के साथ अलग अलग विश्लेषण किया गया है. वास्तविक समय पीसीआर का पता लगाने के लिए की सीमा 10 TCID 50 मिलीग्राम / था.
Discussion
दक्षिण पूर्व एशिया में बर्ड फ्लू और स्वाइन फ्लू महामारी के एक वैश्विक डर की हाल ही में महामारी फैलने के सार्वजनिक स्वास्थ्य और सुरक्षा के लिए भारी चिंताओं थोपना. इन्फ्लूएंजा वायरस के मौजूदा और नए उपभेदों के लिए टीके पैदा करने में महत्वपूर्ण ध्यान केंद्रित समर्पित किया गया है. सटीक पता लगाने और सही वायरल अनुमापांक गणना के लिए तेजी से उच्च प्रौद्योगिकी की उपलब्धता काफी उपचार में सुधार होगा. सबसे अधिक इस्तेमाल करने के लिए वायरस अनुमापांक गणना कार्यरत तकनीक पट्टिका गठन और इन्फ्लूएंजा hemagglutination assays शामिल हैं. पट्टिका गठन परख पहले जीवाणुभोजी titers का अनुमान करने के लिए विकसित किया गया था और Renato Dulbecco द्वारा अपनाई पशु वायरल titers 4 गणना. इस परख प्रदर्शन करने के लिए, इन्फ्लूएंजा शेयर या बाल तरल पदार्थ के रूप में पशु नमूनों के 10 गुना dilutions के लिए तैयार कर रहे हैं और 6 अच्छी तरह से प्लेट में 0.1 मिलीलीटर aliquots MDCK कोशिकाओं की monolayer पर inoculated हैं. वायरस MDCK विज्ञापन के बाद कोशिकाओं पर सोखना करने के लिए अनुमति दी गई हैएक पोषक मध्यम और agarose के प्रत्यर्पण. ऊष्मायन के दौरान, मूल संक्रमित कोशिकाओं वायरल संतान है कि केवल पड़ोसी कोशिकाओं में फैल जारी है. इन्फ्लूएंजा वायरल संक्रमण के कोशिकाविकृतिजनक प्रभाव संक्रमित कोशिकाओं के एक परिपत्र क्षेत्र एक पट्टिका बुलाया पैदा करता है. प्रत्येक पट्टिका संभवतः एक वायरस वायरस की प्रतिकृति के बाद कण के साथ एक एकल कोशिका के संक्रमण के बाद बनाई है. जीवित कोशिकाओं और सजीले टुकड़े के बीच इसके विपरीत जैसे क्रिस्टल बैंगनी रंगों से बढ़ाया जा सकता है. इस परख की एक बड़ी खामी reproducibility और प्रयोगों के भीतर भारी बदलाव की कमी है. एक और के लिए इन्फ्लूएंजा वायरल अनुमापांक निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया परख hemagglutination परख है. hemagglutinin प्रोटीन इन्फ्लूएंजा वायरस की सतह पर मौजूद कुशलतापूर्वक एन acetylneuraminic स्तनधारी और एवियन लाल रक्त कोशिकाओं को एक एसिड युक्त प्रोटीन को बांधता है. इन्फ्लूएंजा वायरस और एरिथ्रोसाइट्स के बीच यह बातचीत एक जाली के रूप में समूहन की ओर जाता है. मैंसमूहन की Evel परीक्षण नमूनों में इन्फ्लूएंजा वायरस की अनुमापांक का अनुमान करने के लिए प्रयोग किया जाता है. एरिथ्रोसाइट समूहन परख ही प्रयोग किया जाता है एक ज्ञात वायरस का अनुमापन निर्धारित करने के लिए और तनाव पहचान प्रयोजनों के लिए उपयोग नहीं किया जा सकता है. इस परख के बाद से रहते हैं और मृत वायरस के बीच अंतर नहीं है, यह मुश्किल है वायरल titers का एक सटीक गणना प्राप्त है.
इन्फ्लूएंजा संक्रमण के वर्तमान नैदानिक निदान serologic परीक्षण, पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन, प्रत्यक्ष नमूना immunofluorescence और सेल 1,6 संस्कृति पर आधारित हैं. नई विधि यहाँ वर्णित भी नैदानिक और प्रयोगशाला नैदानिक संभावित है. इन्फ्लुएंजा का पता लगाने किट Directigen फ्लू ए (बी.डी. बायोसाइंसेज, सैन जोस, सीए) और (Binax इंक, स्कारबोरो, इ) उपयोग immunochromatography परख BinaxNow nucleoprotein 7 के रूप में वायरल प्रतिजन पता लगाने के. ये किट का उपयोग वायरस का पता लगाने के 15 मिनट के भीतर प्राप्त किया जा सकता है, तथापि, सभी नकारात्मक नमूने आगे हैसेल संस्कृति विधि द्वारा creened. विभिन्न अध्ययनों से यह भी इन किटों की कम संवेदनशीलता, विशेष रूप से, जब संक्रमण हल्के या कम 8 था की सूचना दी है. हमारे विधि में, हम लगातार वायरस का पता लगाने के रूप में कम के रूप में 100 pfu. यह पता चलता है हमारे तकनीक नैदानिक नमूनों में H1N1 वायरस का पता लगाने में उपयोगी है, तब भी जब संक्रमण हल्का है. एक प्रतिदीप्ति आधारित विधि वायरल एंटीजन का पता लगाने के लिए बताया गया है, जहां या तो nasopharyngeal महाप्राण (व्यंजन) नमूनों को सीधे या विश्लेषण किया गया वायरस गुणा और बाद में विश्लेषण 9 के लिए अतिसंवेदनशील कोशिकाओं की एक monolayer पर टीका. हालांकि, इन तरीकों नैदानिक प्रयोजनों के लिए सीमित कर रहे हैं और वायरस अनुमापांक गणना के लिए उपयुक्त नहीं हैं. क्यू पीसीआर वायरल शाही सेना की उपस्थिति की पहचान करने में मदद करता है और रहते वायरस की संक्रामकता का अनुमान नहीं है. इन assays के लिए की तुलना में, आईआर परख डाई आधारित प्रणाली का पता लगाने और नैदानिक और प्रयोगशाला नमूनों में वायरल अनुमापांक के गणना में मदद मिलेगी. इन्फ्लूएंजा प्रकोप के मामले में, यह हैएक कम समय अवधि में नमूने के हजारों का पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण है. हमारे 384 अच्छी तरह से थाली और आईआर स्कैनर के आधार पर विधि एक समय (> 2000 नमूनों) में 6 प्लेट स्कैन, इसलिए अन्य प्रत्यक्ष फ्लोरोसेंट तरीकों पर एक बड़ा लाभ की पेशकश कर सकते हैं. नैदानिक नमूनों के हजारों की तेजी से प्रसंस्करण की व्यवहार्यता परीक्षण परख समय और लागत की लंबाई, परिवर्तनशीलता को कम कर सकता है. M2-विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग एच एन और प्रोटीन में तनाव मतभेद के स्वतंत्र होने का लाभ प्रदान करता है. प्रोटीन M2 अपेक्षाकृत सबसे इन्फ्लूएंजा संक्रमण मनुष्यों उपभेदों में संरक्षित है. यदि परिसंचारी दाग के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी हमारी प्रणाली के साथ संयुक्त कर रहे हैं एक वायरस की दोनों अनुमापांक उपाय और तनाव की पहचान कर सकते हैं. हालांकि, के बाद से M2 के Amantadine की तरह दवाओं के लिए लक्ष्य है, म्यूटेंट पैदा कर सकते हैं कि यहां इस्तेमाल किया MAB के लिए बाध्यकारी साइट बदल सकता है. यह व्यक्तियों, जो इन दवाओं से इलाज किया जा रहा में इस प्रणाली के लिए एक संभावित सीमा का प्रतिनिधित्व करता है.
विभिन्नassays के लिए परीक्षण के नमूने में इन्फ्लूएंजा titers की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है. वायरस अनुमापांक, 50% टिशू कल्चर संक्रामक खुराक (50 TCID) और अंडे द्रव्य आधारित assays व्यापक रूप से गणना 1,10 उपयोग किया जाता है. हालांकि, कई दिनों की आवश्यकताओं को इन तरीकों कम विश्वसनीय बनाते हैं. इसके अलावा, इन तरीकों में सजीले टुकड़े की संख्या में 50% परिवर्तन पर आधारित गणना सैद्धांतिक लेकिन नहीं सही वायरल titrations प्रदान करते हैं. फलक assays के गठन के 96 घंटे के भीतर किया जा सकता है, तथापि, reproducibility के अभाव वायरल अनुमापांक गणना में एक प्रमुख चिंता का विषय है. वर्तमान तकनीक यहाँ वर्णित कई अलग फायदे हैं. सबसे पहले, यह संगत परिणामों के साथ एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तकनीक है. दूसरा, वायरल अनुमापांक गणना प्रतिदीप्ति तीव्रता है कि परिभाषित मानक घटता के खिलाफ तुलना कर रहे हैं सरल मात्रा का ठहराव के आधार पर कर रहे हैं. तीसरा, दो या दो से अधिक प्राथमिक एंटीबॉडी किसी नमूने में कई सीरमप्रकारों निदान किया जा सकता है. इसके अलावा, आईआर डाई संयुग्मित एंटीबॉडी एक राग हैअल autofluorescence और 11 इमेजिंग सेल के लिए इस्तेमाल किया गया है. उच्च सेलुलर उच्च मात्रा उपज अंतर्जात fluorophores की उपस्थिति के कारण autofluorescence में यूवी या दृश्य विकिरण परिणाम (300-600 एनएम). खुशबूदार एमिनो एसिड, लाइपो - pigments के है, pyridinic nucleotides (NADPH), elastin, कोलेजन और पीला रंग coenzymes शामिल हैं. कोशिकाओं के इस आंतरिक संपत्ति यह विकिरण के इन स्रोतों का उपयोग करने के लिए मुश्किल के रूप में जांच विशिष्ट प्रोटीन की अभिव्यक्ति मात्रा ठहराना करने के लिए बनाता है. इसके विपरीत में, पास आईआर रंगों को उत्तेजित और 670-1000 एनएम के बीच फेंकना. कई मेजबान सेलुलर अणुओं और polyaromatic हाइड्रोकार्बन इस तरंग दैर्ध्य में नहीं उत्तेजित और कम रोशनी बिखरने के कारण, बहुत कम पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति फेंकना. इसके अलावा, पृष्ठभूमि और विशिष्ट पहचान के बीच खिड़की बेहद पास IR fluorophores के एक उच्च विलुप्त होने गुणांक की वजह से सुधार हुआ है. Photostability, बेहतर संकेत करने के लिए शोर अनुपात, वायरल titers की मात्रा का ठहराव में अत्यंत प्रासंगिक है. Microfl का प्रयोग करेंuidic कक्षों रोबोट नियंत्रण के माध्यम से जांच प्रक्रिया को स्वचालित करेगा और हमें आसानी से अत्यधिक संक्रामक नैदानिक नमूनों का परीक्षण करने के लिए अनुमति दे सकता है. इस प्रकार, इन तरीकों में पास आईआर रंगों के उपयोग आदर्श और अत्यधिक विश्वसनीय ऊतकों के नमूनों में वायरल titers की गणना है.
Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
इस काम के भाग एनआईएच R01 A1064826 01 अनुदान, U19 AI062627-01, No1 - HHSN26600500032C (एस.एम. के लिए) में समर्थित है. हम चर्चा और तकनीकी मदद के लिए हमारी प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद, पांडुलिपि के महत्वपूर्ण समीक्षा के लिए टीना Heil. हम के डेविड बीना, मिलवॉकी स्वास्थ्य विभाग प्रयोगशाला वायरस संस्कृति और पीसीआर के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine serum albumin | Atlanta Biologicals | S11750 | |
| PR8 virus | From Dr Thomas M Moran | ||
| Goat anti-mouse IRDye@800 | LI-COR Biosciences | 926-32210 | 1:200 dilution |
| LI-COR Odyssey IR scanner | LI-COR Biosciences | 9201-01 | |
| 384-wells flat bottom plate | Nalge Nunc international | 164730 | |
| 96-wells flat bottom plate | Nalge Nunc international | 165305 | |
| DMEM medium | Invitrogen | 11965126 | |
| RPMI medium | Invitrogen | 11875135 | |
| Sodium bicarbonate | Invitrogen | 25080 | |
| L-glutamine 100x | Invitrogen | 25030 | |
| Trypson-EDTA | Invitrogen | R001100 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360070 | |
| Anti-M-2 antibody | From Dr Thomas M Moran | ||
| Anti-NP mAb | CDC | V2S2208 | Obtained with an MTA |
References
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