Summary
Denne Metoden beskriver anvendelsen af Infrarødt farvestof baseret imaging system for detektion af H1N1 i bronchioalveolar lavage (BAL) fluid af smitteramte mus ved en høj følsomhed. Denne metodik kan udføres i en 96 - eller 384-brøndsplade, kræver <10 gl volumen af test materiale, og har potentiale for samtidig screening af multiple patogener.
Abstract
Influenzavirus er en respiratorisk patogen der forårsager en høj grad af sygelighed og dødelighed hvert år i multiple dele af verden. Derfor, præcis diagnose af den inficerende stamme og hurtige high-throughput screening af et stort antal kliniske prøver er altafgørende at kontrollere spredningen af pandemiske infektioner. Aktuelle kliniske diagnoser af influenzainfektioner er baseret på serologisk prøvning, polymerase chain reaction, direkte modellen immunofluorescens og cellekultur 1,2.
Her, rapporterer vi udviklingen af en hidtil ukendt diagnostisk teknik, der anvendes til at detektere live influenzavira. Vi brugt musen-adapterede humant A/PR/8/34 (PR8, H1N1)-virus 3 til teste effektiviteten af denne teknik under anvendelse MDCK-celler 4. MDCK-celler (10 4 eller 5 x 10 3 pr brønd) blev dyrket i 96 - eller 384-brøndsplader, inficeret med PR8 og virale proteiner blev påvist under anvendelse anti-M2 efterfulgt af en IR dye-konjugeret secsekundær antistof. M2 5 og hæmagglutinin 1 er to store markørproteiner som anvendes i mange forskellige diagnostiske assays. Anvender IR-dye-konjugerede sekundære antistoffer minimeret den autofluorescens forbundet med andre fluorescerende farvestoffer. Anvendelsen af anti-M2-antistof tillod os at benytte det antigen-specifikke fluorescens intensitet som en direkte metrisk af viral mængde. At optælle fluorescensintensitet, brugte vi LI-COR Odyssey-baseret IR scanner. Dette system bruger to kanals laser-baserede IR-registreringer til at identificere fluorophorer og adskiller dem fra baggrundsstøj. Den første kanal exciterer ved 680 nm og emitterer ved 700 nm til at hjælpe kvantificere baggrunden. Den anden kanal detekterer fluoroforer, at ophidse ved 780 nm og emitterer ved 800 nm. Scanning af PR8-inficerede MDCK celler i den IR scanneren indikerede en viral titer-afhængig lyse fluorescens. En positiv korrelation mellem fluorescensintensitet at virus titer startende fra 10 2 -10 5 PFU kunne consistently observeret. Minimal men påviselige positivitet konsekvent set med 10 2 -10 3 PFU PR8 virustitere vist høj følsomhed af de nær-IR-farvestoffer. Den signal-til-støj-forholdet blev bestemt ved at sammenligne de mock-inficerede eller isotype antistof-behandlede MDCK-celler.
Hjælp af de fluorescensintensiteterne fra 96 - eller 384-brøndsplade formater, vi konstrueret standard titreringskurver. I disse beregninger, er den første variable det virale titer mens den anden variabel er fluorescens intensitet. Derfor, anvendte vi den eksponentielle distributionen til generere en kurve-fit at bestemme polynomium forholdet mellem de virale titere og fluorescens intensiteter. Kollektivt, vi konkludere, at IR farvestofbaseret-baseret protein detektering system kan hjælpe med at diagnosticere inficere virale stammer og præcist optælle titeren af de inficerende patogener.
Protocol
1. MDCK celler kulturen
- Kultur 5 millioner MDCK-celler natten over i en T-75 cm 2 kolbe i 20 ml RPMI1640 komplet medium med 10% FBS, 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 1 mM natriumpyruvat, 5% af 7,5% natriumbicarbonat opløsning og 0,001% β-mercaptoethanol i en 37 ° C inkubator infuseret med 5,2% CO 2.
2. PR8 infektion og BAL fluid indsamling
- Challenge C57BL / 6 mus intranasalt med 5000 PFU af PR8 virus i sterilt PBS i et samlet volumen på 30 ul gennem én næsebor. Gennemføre mock infektioner kun bruger steril PBS uden virus.
- Afliv mus 0, 2, 4 og 7 dage efter infektion og skære brysthulen åbne og gøre en 1 cm incision parallelt med luftrøret gennem pelsen af musen for at afsløre det.
- Foretag en midtlinieincision på den proximale aspekt af trachea.
- Indgyde trachea med 0,5 ml af PBS-1% BSA og aspirér BAL fluid. BAL fluider kan lagres i -20 ° C fryser indtil anvendelse.
3. Virusinfektion og detektion af viral matrix protein (M2) med den LI-COR Odyssey
- At kvantificere de virale titere anvender infra røde farvestof-konjugerede antistoffer, høster de MDCK cellerne fra T-75 cm 2-kolber og pladen dem i optisk flad bottom black 96-brønds (10.000 celler pr brønd) eller 384-brønd (5.000 celler per brønd ) plader. Kulturen de MDCK-celler for natten over ved 37 ° C i RPMI1640 komplet medium og vask to gange med serum-frit DMEM holdig BSA (0,2%, vægt / volumen), penicillin (100 U / ml), streptomycin (100 ug / ml), natrium pyruvat (1 mM), natriumbicarbonat-opløsning (5% af 7,5%) og β-mercaptoethanol (0,001%).
- Inkubér MDCK cellerne med BAL fluid (50 pi for 96-brønds plade eller 10 pi for 384-brønds plade) eller PR8 virus med kendte titere i hver brønd med lige volumen (50 ul for 96-brønds plade eller 10 pi for 384 - brønds plade) af DMEM medium,indeholdende L-1-tosylamido-2-phenylethyl chlormethyl keton (TPCK)-behandlet trypsin (0,2 ug / ml).
- Efter den 1. h af infektion, 100 pi (96-brønds plade) eller 20 pi (384-brønds plade) af 10% FBS-indeholdende RPMI1640 komplet medium til hver brønd tilføje.
- Fortsætte dyrkning MDCK-celler for en anden 16 h. for infektion; vaske de MDCK-celler to gange med 100 pi (96-brønds plade) eller 20 pi (384-brønds plade) af PBS-1% BSA-opløsning og fastgør med 100 pi (96-brønds plade) eller 20 pi (384-brønds plade) på 1% paraformaldehyd i 5 min.
- Følge fastsaettelse, de MDCK-celler inkuberes yderligere i 30 minutter med 100 pi (96-brønds plade) eller 20 pi (384-brønds plade) af PBS-1% BSA til blokering.
- Efter blokering inkuber de MDCK-celler i 1 h med primært antistof imod M2-protein (1:1000, fortyndet i PBS-1% BSA). Bruge 50 pi per brønd og 20 ul fortyndet antistof pr brønd i 96-brønd eller 384-brønds plader, hhv.
- Vaske MDCK-celler tre gange med 100 pi (96-brønds plade) Eller 20 pi (384-brønds plade) af PBS-indeholdende 1% BSA og inkuber i 1 h med 50 ul (96-brønds plade) eller 20 pi (384-brønds plade) gede anti-muse IRDye @ 800 sekundært antistof ( 1:200 fortynding).
- Vaske MDCK-celler tre gange med 100 ul PBS-indeholdende 1% BSA. Placere de farvede pladerne på aflæsningen glasset platformen af den LI-COR Odyssey IR scanner og indstil læseren for en 96 - eller 384-brønds plade læsning.
- Blanke negative kontrolbrønde kan indstilles ved hjælp af LI-COR Odyssey software. Kvantificere hel plade eller udvalgte boringer inden plade under anvendelse LI-COR Odyssey software.
- Brug af Auto Shape Tool, grænserne for en target region (ROI) henlede i midten af en test brønd i 96 - eller 384-brønds plader. Oprettelsen af ROI tillader den software for at sammenligne de definerede baggrundsniveauer brøndene til de virus-titrerede prøver.
- For at indstille baseline værdien for hele analysen, skal du bruge en baggrund ROI. Indførelse af to modsatrettede trådkorset fra Odysseen software inden for ROI til measure intensiteten af fluorescensen tværs brønden.
- Scanne plader under anvendelse 780 nm kanal for detektion og 680 nm som reference bølgelængde i en LI-COR Odyssey IR scanner.
- Når 'læse' kommando er aktiveret, vil de fluorescerende intensiteter ved ensartede intervaller af ROI måles, og de indsamlede datapunkter integreret. En standardafvigelse multiplikator vil bestemme niveauet af signalet over baseline, der er inkluderet i ROI beslutsomhed.
- Baggrundsfluorescens vil blive kvantificeret fra den mock-inficerede eller sekundært antistof alene kontrollerer og vil blive anvendt til at estimere den integrerede intensitet i testbrønde.
- Vælg 'integreret intensitet "for beregninger, fordi det repræsenterer netto pixel volumen for en defineret individuelt sted og er uafhængig af funktionen størrelse. Bruger standarden kurven fra de kendte virale titere at beregne de virale titre af ukendte prøver. Brug en lang interpolation kurve præcist at beregne de virustitere. Beregne viral titere i testprøverne ved at sammenligne de intensiteterne af testprøverne med standardkurven.
4. Repræsentative Resultater
Standardisering af IR farvestof-baserede high throughput viral detection system
PR8 virus kan inficere MDCK celler, og derfor brugte vi disse celler til at udvikle denne analyse. Målte vi de virale titere under anvendelse af et primært antistof mod en influenza viralt matrix protein (M2). I modsætning til andre metodologier, brugte vi et sekundært antistof, som er konjugeret til en nær-IR farvestof. Denne fremgangsmåde tilvejebringer en enkel, automatiseret PR8 virus titerbestemmelse under anvendelse fluorescens intensitet, der er genereret medens påvisning M2 protein. Efter en influenza virus infektion, bliver M2 protein oversat, transporteres og akkumuleres i værtscellen herunder celleoverfladen. Således, mængden af M2 proteinet repræsenterer en målbar parameter til at bestemme mængden af virus. Sammenligning af de intensiteter fratestprøverne med den standardkurven tilvejebringer den præcis måling af virale titere.
At fastlægge effekten af den fluorescens-baserede metode, vi kulturperler 10 4 MDCK celler / brønd i kammeret glider natten over. PR8 virale lagre af kendte titere blev tilsat til duplo brønde med forskellige plaquedannende enheder (PFU) og tillades at adsorbere på de cellerne i én time. Celler blev inkuberet i 16 timer at tillade virus til udbrede. Efter dette, blev de MDCK-celler i de kammerets objektglassene fikseret med 1% paraformaldehyd, vasket og farvet med anti-M2 antistof for 1 h, efterfulgt af AlexaFluor 488-konjugeret sekundært antistof for en yderligere 1 time. Konfokale mikroskopiske analyser af inficerede MDCK-celler demonstreret det vedhængende monolaget var i vid udstrækning intakt og den PR8-afledte M2 protein var rigelig mængde stede inde i de inficerede MDCK-celler (figur 1A). Fluorescerende celler kunne detekteres i infektioner med virale titere så lav som 10 2
Derfor, at etablere en nøjagtig viral beregningsmetode vi ansat en IR farvestofbaseret detektion og kvantificering system. MDCK-celler (10 4 / brønd) blev dyrket i 96-brøndsplader, inficeret med PR8 og virale proteiner blev påvist under anvendelse anti-M2 efterfulgt af en IR farvestof-konjugeret sekundært antistof. Anvendelsen af anti-M2-antistof tillod os at benytte det antigen-specifikke fluorescens intensitet som en direkte metrisk af viral mængde. At optælle fluorescensintensitet, brugte vi LI-COR Odyssey-baseret IR scanner. Dette system bruger to-kanals laser-Based IR fund at identificere fluorophorer og adskiller dem fra baggrundsstøj. Den første kanal exciterer ved 680 nm og emitterer ved 700 nm til at hjælpe kvantificere baggrunden. Den anden kanal detekterer fluoroforer, at ophidse ved 780 nm og emitterer ved 800 nm. Scanning af PR8-inficerede MDCK celler i LI-COR Odyssey indikeret en viral titer-afhængig lyse fluorescens (figur 1B). M2 positive fluorescerende MDCK-celler var klart synlige inde i brøndene (figur 1B). En positiv korrelation mellem fluorescensintensitet at virus titer startende fra 10 2 -10 5 PFU kunne konsekvent overholdes. PR8 virale titreringer højere end 10 6 PFU fører til celledød, der sætter en øvre grænse for følsomheden af analysen. Minimal men påviselige positivitet konsekvent set med 10 2 -10 3 PFU PR8 virustitere vist høj følsomhed af de nær-IR-farvestoffer. Den signal-til-støj-forholdet blev bestemt ved at sammenligne den MOCk-inficeret eller isotype-antistof-behandlede MDCK-celler. Begge af disse kontrolelementer resulterede i ubetydelige eller upåviselig niveauer af fluorescens (Figur 1B).
Til yderligere at forbedre følsomheden og at reducere de forsøgsprøvebælterne volumen krav, vi inficeres 5 × 10 3 MDCK celler / brønd i 384-brønds plader. Forskellige PFU'er af PR8 blev testet som serielle én log fortyndinger (figur 1C). Afsløring sensitivitet fra 384-brønds plader var sammenlignelig med at af de 96-brøndplade assays. Både 10 1 og 10 2 PFU arbejdede konsekvent bedre i de 384-brønds plader sammenlignet til 96-brønds-plader. Hjælp af de fluorescensintensiteterne fra 96 - eller 384-brøndsplade formater, vi konstrueret standard titreringskurverne (figur 1D). I disse beregninger, er den første variable det virale titer mens den anden variabel er fluorescens intensitet. Derfor brugte vi den eksponentielle fordeling til at generere en kurve-fit på bestemmelse afINE den polynomielle forholdet mellem de virale titere og fluorescens intensiteter. Har vi også valideret vore observationer anvendelse af en anden antistof, der er rettet mod den nukleoprotein (NP) af PR8 virus (data ikke vist). Distinkte kilder til PR8 stammer blev også anvendt til at inficere MDCK-celler der blev testet med anti-NP eller anti-M2-antistoffer (data ikke vist). Kollektivt, vi konkludere, at IR farvestofbaseret-baseret protein detektering system kan hjælpe med at diagnosticere inficere virale stammer og præcist optælle titeren af de inficerende patogener.
Matematiske overvejelser for beregning af virustitere
De matematiske Beregningerne af fluorescens intensitet og titer bestemmelser er færdig som beskrevet nedenfor. Efter farvningsproceduren, er hele pladen eller udvalgte brønde i pladen kvantificeres ved hjælp af LI-COR Odyssey software. Brug af Auto Shape Tool, blev grænserne for et mål region (ROI) tegnet i midten af testbrøndene i 96 - eller 384-ville plader (figur 2A og B). Oprettelsen af ROI tillader den software for at sammenligne de definerede baggrundsniveauer brøndene til de virus-titrerede prøver. En baggrund ROI blev anvendt til at indstille grundlinjen værdien for hele assayet. To modstående krydshår (hvid) blev indført inden for den ROI til at måle intensiteten af fluorescensen tværs brønden (figur 2C). Kurver til højre side og neden under de repræsentative brøndene i Figur 2C repræsenterer intensiteten af de pixels langs disse trådkrydset. De fluorescerende intensiteter ved ensartede intervaller af den ROI blev målt og de opsamlede datapunkterne blev integreret. En standardafvigelse multiplikator bestemt niveau signalet over baseline, der blev inkluderet i ROI beslutsomhed. Baggrundsfluorescens blev kvantificeret fra det mock-inficerede eller sekundært antistof alene kontroller og anvendt til at estimere den integrerede intensitet i testbrønde. Vi valgte integrerede intensitet for beregninger, fordi det repræsenforældre netto pixel volumen for en defineret individuelt sted og er uafhængig af funktionen størrelse. Desuden er integrerede intensitet væsentlige uafhængig af resolution. Totale intensitet / pixel (I) svarer til signalet intensiteten hidrørende fra er valgt brønd i pixel-området (Er) plus signalet opstår fra baggrunden af den pixel areal (b). Derfor, for pixel 'i':
Jeg i = jeg er i + b i
Pixel volumen repræsenterer både størrelsen af signalet og det område, hvor det distribueres. Signal område er relateret til distributionen af stikprøve, der er genererer signalet. Pixelen rumfang er lig samlede signal målt i pixel »I« i området (a) af pixelen gange dens højde (I). Så for pixel 'jeg':
VI = en jeg jeg
Samlet pixel volumen er summen af samlede signal fra hele området således:
| ; | n | n | |
| V = | Σv i | = | aΣI i |
| i = 1 | i = 1 |
Integrerede intensitet er summen af intensitetsværdierne værdier for alle pixels afgrænses af feature, multipliceret med arealet af det cirklen / rektangel (count mm 2). Derfor, den integrerede intensitet =
en (ΣI i - b)
Her, b. står for den gennemsnitlige baggrunden pixel intensitet. Denne formel beregner de integrerede signalintensiteter af det betjeningsorgan eller eksperimentelle brønde og derved etablerer en standardkurve. Virale titere i testprøverne blev beregnet under anvendelse denne standardkurve. Koncentration (af intensitet) defineres som den mængde af fluorescens stede i en defineret ROI. Koncentrationer i prøver er beregTED i forhold til de definerede koncentrationer af standarder i det samme billede. At beregne de præcise virale titere, bliver intensiteten af hver koncentration standard afbildes og udstyret med en lang interpolering kurve. Koncentrationerne af testprøverne beregnes ved at sammenligne intensiteten af området inden standardkurven.
Fastsættelse af virustitere fra BAL væske af influenza inficerede mus
Påvisning af levende influenza virale partikler i kliniske og laboratoriemæssige prøver er af afgørende betydning. Derfor har vi siden undersøgt, om vi kan bruge denne metode til bestemmelse af virustitere i laboratorieprøver. BAL fluider blev opsamlet fra ikke-immuniserede mus og tilsat med en kendt mængde af PR8 virus. Spiked BAL fluida blev lineart titreres for optælle de virale titere. Aliquoter af spiked BAL fluider blev anvendt til at inficere MDCK celler i 96-brønds plader, fikseret og farvet med anti-M2 og IR dye-konjugeret secondary antistoffer. Resultaterne vist i figur 3A påvise, at de virale titere i den spiked BAL-væsken var påviselige og korreleres med de PR8 titere i standarden kurven. Hjælp standardkurven, blev præcise virale numre i den spiket og titreret BAL fluid kvantificeret. Eksponentiel kurve fit beregninger tilvejebragt en foranstaltning til at beregne de virale titere i den spiked BAL fluidet (figur 3B). Gennem denne metode har vi opnået gode korrelationer mellem de beregnede og tilsat virustitere, validere denne fremgangsmåde (fig. 3C).
Næste, vi analyseret den BAL fluid fra PR8-inficerede mus. PR8 har været flittigt brugt i murine modeller til at forstå den menneskelige patologi og anti-viral immunitet 3. Grupper af mus blev intranasalt inficeret med 5000 PFU af PR8. Mus blev overvåget for vægttab, udseendet af krum ryg, pjusket pels og andre kliniske symptomer. På dagene 0, 2, 4, 7 og 10 af post infektion,mus blev aflivet, og BAL fluider blev opsamlet. At udnytte disse laboratorieforsøg prøver, blev MDCK-celler inkuberet med serielle fortyndinger af BAL fluid i et slutvolumen på 50 ul i 17 h i 96-brønds plader. Kontrolbrønde af MDCK celler inficeret med kendte titere på bestand PR8 virus tjent til at generere en standardkurve. Efter infektion, blev cellerne vasket, fikseret og farvet med anti-M2 primære antistof efterfulgt af nær-IR dye-konjugeret sekundært antistof. MDCK-celler, der var mock-inficeret eller behandlet med isotype-kontrolelementer efter infektion forudsat baggrundsniveauerne fluorescensintensiteterne for titer beregninger.
Analyser af BAL-væsken påvist, at PR8 virus i laboratoriet prøven bliver påvises gennem den IR farvestofbaseret-baserede assay system. En signifikant stigning i den virale belastningen i BAL-væsken blev observeret på dagene 2 og 4 efter infektion (figur 4A). Beregninger af integrerede intensitet viste, at BAL væske fra dag 2 og 4 i indlæg jegnfection indeholdt signifikante niveauer af PR8 virus (Figur 4B). Vores resultater viser en gradvis, men betydelig vægttab løbet den tidlige fase af PR8 infektion, demonstrerer sværhedsgraden af sygdommen. Ikke desto mindre, de fleste mus startede inddrive fra sygdomssymptomer og tage på i vægt 7 dage efter infektion (figur 4C). Mus på dag 10 efter infektion manglede nogen påviselig PR8 angiver clearance af virus, som også korreleret med stigningen i kropsvægt og betydelige reduktioner i de sygdomssymptomer.
For yderligere at udvide anvendelsen af denne analyse, vi har testet en 2009 A (H1N1) human influenza isolere med IR farvestofbaseret antistofdetektering system, og sammenlignet det med real-time PCR-analyse. Denne klinisk prøve blev isoleret fra en kombineret nasopharyngeal / hals svaber opnået fra mistanke patient. Den isolere blev opformeret i MDCK cellelinje ved Milwaukee Health Department Laboratory. De Testresultaterne var virksomrød til kontrollere følsomheden af det IR farvestof-baserede metode til real-time PCR-assays (figur 5). De resultater indikerer, at IR farvestofbaseret-baserede antistofdetektering system har potentialet til at detektere viral load så lav som 10 3 TCID 50 / ml, hvilket er sammenlignelig med PCR-baseret assay (10 TCID 50 / ml), og falder inden for det kliniske relevans interval for de fleste patientprøver. Disse resultater giver stærke beviser for, at IR farvestof-baserede analysesystem er tilstrækkelig følsomhed og potentiale, der skal anvendes for viral titer opregningen i forskningslaboratorium og kliniske omgivelser.
Figur 1.. IR farvestofbaseret-baseret immune påvisning af influenza virus. (A) Konfokale mikroskopiske analyser af influenza-inficerede MDCK celler i 8-brønds kammerkoncerter dias. Immunofluorescens mikroskopiske analyser demonstrere adhærerende MDCK monolaget er i vid udstrækning intakt og belastet med virus-afledt M2-proteinet. (BC) Kvantificering af virustitere baseret på IR farvestof og LI-COR Odyssey system. (D) Generation af standard kurver og eksponentielle kurve-fit profiler. Data præsenteret i AD er repræsentative for fem uafhængige eksperimenter.
Figur 2. Metodologien i bestemmelse af virale titere anvender IR farvestoffer. (A) Integrerede fluorescensintensitets målinger. Et defineret område inde testbrøndene (ROI) var præget at måle fluorescensintensiteterne. Brug af Auto Shape Tool, blev der grænserne for det ROI trukket i midten af proeveresultaterne brøndene i 96 - eller 384-brønd plader. Fluorescens blev målt som individuelle pixel (pixel = n) i ROI. Integrerede intensitet er summen af intensitetsværdierne værdier for alle pixels afgrænses af feature, multipliceret med arealet af det cirklen / rektangel (count mm 2). (B) Fastlæggelse af de integrerede fluorescensintensiteterne i hver brønd. Oprettelse af ROItillod LI-COR scanner at sammenligne de definerede baggrundsniveauer brøndene til de virus-titrerede prøver. Baggrundsfluorescens blev kvantificeret fra det mock-inficerede eller sekundært antistof alene kontroller og anvendt til at estimere den integrerede intensitet i testbrønde. (C) Indsamling af data punkter i ROI. To modstående krydshår (hvid) blev indført inden for den ROI til at måle intensiteten af fluorescensen tværs brønden. Kurver til højre side og neden under de repræsentative huller repræsenterer intensiteten af pixels langs disse trådkors.
Figur 3. Påvisning og kvantificering af virustitere i PR8 spiked BAL-fluider. (A) MDCK-celler blev dyrket i 96-brønds-plader natten over og tilsat med PR8-spiked BAL fluidum. Plader blev læst i LI-COR Odyssey system. (B) Exogent spiked BAL fluid blev sammenlignet med standardkurver. (C) Sammenligning af beregnet til forventet vir al titere. Eksponentielle kurvetilpasning forudsat y = 9.4784e 0.0014x. Data præsenteret i AC er repræsentative for tre uafhængige eksperimenter.
Fig 4. Påvisning og kvantificering af influenza virus i BAL-fluider fra PR8 inficerede mus. (A) Grupper af mus blev intranasalt inficeret med 5000 PFU af PR8. MDCK-celler blev inkuberet med serielle fortyndinger af BAL fluid i et slutvolumen på 50 ul i 17 h i 96-brønds plader. Efter infektion, blev cellerne vasket, fikseret og farvet med anti-M2 primære antistof efterfulgt ved IR dye-konjugeret sekundært antistof. Længst til højre Panelet repræsenterer den standardkurven. (B) Kvantificering af virale titere i den BAL væske af inficerede mus. (C) Vægt tab af mus under PR8 infektion korreleret med den virale belastning. Data præsenteret i AC er repræsentative for tre uafhængige eksperimenter.
Ad 5 "src =" / files/ftp_upload/3623/3623fig5.jpg "/>
Figur 5. Påvisning og kvantificering af 2009 A (H1N1)-pandemien (PDM) influenza isolat fra en human patient. (A) Den IR farvestofbaseret-baserede antistof-fluorescens system, påvisning for halv-fold titrering af inficeret MDCK cellelinje. De fluorescens Resultaterne indikerer assayet har potentiale til at detektere viral load så lav som 10 3 TCID 50 / ml. (B) Nucleic syre ekstraheres fra kulturen isolat sammen med serielle ti-ganges fortyndinger af nogle kendte titrerede H1N1 isolat blev analyseret med den CDC real-time PCR assay 12. Detektionsgrænsen for real-time PCR var 10 TCID 50 / ml.
Discussion
Den seneste epidemi udbrud af aviær influenza i Sydøstasien og en global frygt for svineinfluenza pandemi pålægge store bekymringer for den offentlige sundhed og sikkerhed. Kritisk fokus har været dedikeret til at generere vacciner til eksisterende og nyere stammer af influenzavirus. Tilgængelighed af hurtige high-throughput teknologier til nøjagtig detektering og nøjagtige virustiter beregninger vil enormt forbedre behandlingen. De mest almindeligt anvendte teknikker anvendes til at beregne virustiter indbefatter plak dannende og influenza hæmagglutination assays. Den plakdannende analysen blev først udviklet til at estimere bakteriofagvektorer titre og blev vedtaget af Renato Dulbecco til at beregne dyr virustitere 4. At udføre denne assay, bliver 10-folds fortyndinger af influenza bestand eller animalske prøver såsom BAL fluid forberedt og 0,1 ml alikvoter podes på den monolag af MDCK celler i 6-brønds plader. Viruset får lov til at adsorbere på de MDCK-celler efterfulgt af annoncendition af et næringsstof medium og agarose. Under inkubationen, frigive de oprindelige inficerede celler virusafkom, der spredes kun for de naboceller. Den cytopatogene virkning af den influenza viral infektion frembringer en cirkulær zone af inficerede celler kaldes en plaque. Hver plak er formodentlig dannet efter infektion af en enkelt celle med en enkelt virus partikel efterfulgt ved replikation af virus. Kontrast mellem de levende celler og de plaques kan forstærkes ved farvestoffer såsom krystalviolet. En væsentlig ulempe ved denne assay er mangel på reproducerbarhed-og enorme variationer inden eksperimenter. En anden assay anvendt til at bestemme influenza virale titer er den hæmagglutineringsassay. Den hemagglutinin-proteinet stede på overfladen af influenza-virusset effektivt binder til N-acetylneuraminsyre-holdige proteiner på mammale og aviær røde blodlegemer 1. Denne interaktion mellem den influenzavirus og de erytrocytterne fører til agglutination i form af en lattice. Den lEvel af agglutinering anvendes til at estimere titer af influenza virus i testprøver. Erythrocyt agglutination assay anvendes kun til at bestemme titrering af en kendt virus og kan ikke bruges til strain identifikation formål. Eftersom dette assay ikke skelnes mellem den levende og de døde vira, er det vanskeligt at opnå en nøjagtig beregning af virale titere.
Aktuelle kliniske diagnoser af influenzainfektioner er baseret på serologisk prøvning, polymerase chain reaction, direkte modellen immunofluorescens og cellekultur 1,6. Den nye metode her beskrevne har også klinisk og laboratoriemæssige diagnostisk potentiale. Influenza detektion kits Directigen FLU-A (BD Biosciences, San Jose, CA) og BinaxNow (Binax, Inc., Scarborough, ME) anvendelse immunkromatografi assay til påvisning viralt antigen, såsom nukleoprotein 7. Ved hjælp af disse kits, påvisning af virus kan nås inden 15 minutter, men alle negative prøver skal være yderligere screened ved cellekulturen metoden. Forskellige undersøgelser har også rapporteret lav følsomhed af disse kits, især, da infektion var mild eller lav 8. I vores metode, konsekvent vi detektere så lavt som 100 PFU af virus. Dette antyder vores teknik er nyttig i påvisning af H1N1 virus i kliniske prøver, selv når infektionen er mild. A fluorescens-baseret metode til at påvise virale antigener er blevet rapporteret, hvor enten nasopharyngeale Aspirer enhederne blev direkte analyseret eller blev inokuleret på et monolag af modtagelige celler til virusmultiplikation-og efterfølgende analyser 9. Imidlertid er disse metoder begrænset til diagnostiske formål og er ikke egnede til virustiter beregninger. Q-PCR hjælper med at identificere tilstedeværelsen af viralt RNA og ikke estimere den infektiviteten af levende vira. Sammenlignet med disse analyser, vil IR farvestofbaseret analysesystem hjælpe med at afsløre og viral titer opregningen i kliniske prøver og laboratorieprøver. I tilfælde af influenza udbrud, er detkritisk for diagnosticere tusindvis af prøver i en kort tid periode. Vores metode baseret på en 384-brønds plade og IR scanner kan scanne 6-plader på et tidspunkt (> 2.000 prøver), derfor der tilbyder en større fordel over for andre direkte fluorescerende metoder. Feasibility for hurtig behandling af tusindvis af kliniske prøver kan reducere test variation, længden af analysen tid og omkostninger. Brugen af en M2-specifikt antistof byder den fordel af at være uafhængig af stamme forskelle i H og N proteiner. Den M2--proteinet er relativt konserveret i de fleste influenzastammer inficerende mennesker. Hvis antistoffer specifikke for cirkulerende pletter kombineres med vores system man kan måle både titeren af virus og identificere stammen. Imidlertid, eftersom M2 er målet for de Amantadine-lignende medikamenter, kan mutanter opstå, at kan ændre bindingsstedet for den mAb anvendt her. Dette svarer til en potentiel begrænsning for dette system i individer, der bliver behandlet med disse stoffer.
Multipleassays anvendes til at optælle influenzavira titere i testprøver. Til at beregne virus titer, 50% vævskultur infektiøs dosis (TCID 50) og ægprodukter allantoismembraner fluid-baserede assays er almindeligt anvendt 1,10. Men kravene i flere dage at gøre disse metoder mindre pålidelige. Yderligere, i disse fremgangsmåder beregninger baseret på 50% ændring i antallet af plaques tilvejebringe teoretiske men ikke nøjagtig virale titreringer. Plaquedannende assays kan udføres inden for 96 timer; dog, mangel på reproducerbarhed er et stort problem i virale titer beregninger. Den foreliggende teknik her beskrevne har flere særskilte fordele. Først, det er en meget reproducerbar teknik med konsistente resultater. Sekund, virale titer beregninger er baseret på simpel kvantificering af fluorescensintensiteter, der er sammenlignes imod definerede standardkurver. Det tredje, kan to eller flere primære antistoffer blive brugt til at diagnosticere multiple serotyper i en given prøve. Også, IR dye-konjugerede antistoffer har Minimal autofluorescens og er blevet anvendt for celle billeddannelse 11. UV eller visuel stråling (300-600 nM) resulterer i høj cellulær autofluorescens på grund af tilstedeværelsen af høje kvante ydende endogene fluoroforer. Disse indbefatter aromatiske aminosyrer, Lipo-pigmenter, pyridinic nukleotider (NADPH), elastin, collagen og flavin coenzymer. Dette iboende egenskab af celler gør det vanskeligt at udnytte disse kilder af stråling som prober at kvantificere ekspressionen af specifikke proteiner. I modsætning, begejstre near-IR-farvestoffer og udleder mellem 670-1000 nm. Mange host cellulære molekyler og polyaromatiske hydrocarboner behøver ikke ophidse ved denne bølgelængde og på grund reduceret lysspredning, udsender ekstremt lav baggrundsfluorescens. Yderligere, er vinduet mellem baggrunden og specifik påvisning stærkt forbedret grund af en høj ekstinktion koefficient for de nær-IR fluorophorer. Fotostabilitet, overlegen signal-til-støjforhold, er yderst relevant i kvantificeringen af virale titere. Brug af microfluidic kamre vil automatisere screening proces gennem robot kontrol, og kunne tillade os at teste meget smitsomme kliniske prøver med lethed. Således, udnyttelsen af nær-IR farvestoffer i disse metoder er ideel og meget pålidelig at optælle virale titere i vævsprøver.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde støttes delvis NIH tilskud R01 A1064826-01, U19 AI062627-01, no1-HHSN26600500032C (til SM). Vi takker vores laboratorium medlemmer for diskussion og teknisk hjælp, Tina Heil for kritisk gennemgang af manuskriptet. Vi vil gerne takke David Bina, Milwaukee Health Department laboratorium for virus kultur og PCR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine serum albumin | Atlanta Biologicals | S11750 | |
| PR8 virus | From Dr Thomas M Moran | ||
| Goat anti-mouse IRDye@800 | LI-COR Biosciences | 926-32210 | 1:200 dilution |
| LI-COR Odyssey IR scanner | LI-COR Biosciences | 9201-01 | |
| 384-wells flat bottom plate | Nalge Nunc international | 164730 | |
| 96-wells flat bottom plate | Nalge Nunc international | 165305 | |
| DMEM medium | Invitrogen | 11965126 | |
| RPMI medium | Invitrogen | 11875135 | |
| Sodium bicarbonate | Invitrogen | 25080 | |
| L-glutamine 100x | Invitrogen | 25030 | |
| Trypson-EDTA | Invitrogen | R001100 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360070 | |
| Anti-M-2 antibody | From Dr Thomas M Moran | ||
| Anti-NP mAb | CDC | V2S2208 | Obtained with an MTA |
References
- Hirst, G. K. The agglutination of red cells by allantoic fluid of chick embryos infected with influenza virus. Science. 94, 22-23 (1941).
- Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units. Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).
- Kalter, S. S. Hemagglutinating Behavior of Mouse and Egg-adapted Type A (PR8) Influenza Virus. Science. 110, 184-184 (1949).
- Dulbecco, R. Production of Plaques in Monolayer Tissue Cultures by Single Particles of an Animal Virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 38, 747-752 (1952).
- Deyde, V. M., Nguyen, T., Bright, R. A., Balish, A., Shu, B., Lindstrom, S., Klimov, A. I., Gubareva, L. V. Detection of molecular markers of antiviral resistance in influenza A (H5N1) viruses using a pyrosequencing method. Antimicrob. Agents Chemother. 53, 1039-1047 (2009).
- Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units. Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).
- Rahman, M., Kieke, B. A., Vandermause, M. F., Mitchell, P. D., Greenlee, R. T., Belongia, E. A. Performance of Directigen flu A+B enzyme immunoassay and direct fluorescent assay for detection of influenza infection during the 2004-2005 season. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 58, 413-418 (2007).
- Landry, M. L., Ferguson, D. Suboptimal detection of influenza virus in adults by the Directigen Flu A+B enzyme immunoassay and correlation of results with the number of antigen-positive cells detected by cytospin immunofluorescence. J. Clin. Microbiol. 41, 3407-3409 (2003).
- Herrmann, B., Larsson, C., Zweygberg, B. W. Simultaneous detection and typing of influenza viruses A and B by a nested reverse transcription-PCR: comparison to virus isolation and antigen detection by immunofluorescence and optical immunoassay (FLU OIA). J. Clin. Microbiol. 39, 134-138 (2001).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Epidemiol. 27, 493-497 (1938).
- Doerr, A.
- Shu, B., Wu, K. H., Emery, S., Villanueva, J., Johnson, R., Guthrie, E., Berman, L., Warnes, C., Barnes, N., Klimov, A., Lindstrom, S. Design and performance of the CDC real-time reverse transcriptase PCR swine flu panel for detection of 2009 A (H1N1) pandemic influenza virus. J. Clin. Microbiol. 49, 2614-2619 (2011).
