Summary
Bu protokol Tali Görüntü Tabanlı Sitometre kullanarak hücre canlılığı ve floresan ifade deneyleri nasıl gerçekleştirileceği açıklanır.
Abstract
Tek hücreli ve nüfus bilgileri flow sitometri veya floresan mikroskobu yaygın olarak elde edilir. Ancak, bu iki yöntem farklı bilgiler sağlar. Flow sitometri, fiziksel özellikleri ve boyanması veya ifade hakkında nicel çok parametrik bilgiler verir, ancak görselleştirme için izin vermiyor. Stand-alone floresan mikroskopi görsel veri sağlar, ancak basit nicel ölçümleri 1 için izin vermez.
Heterojen popülasyonları 2 görüntü tabanlı sitometri binlerce hücre hızlı görselleştirme ve eş zamanlı kantitatif analiz sağlayarak, bu iki yöntem arasında bir köprü . Burada, Tali Görüntü Tabanlı Sitometre 3 kullanılarak hücre canlılığı ve yeşil flüoresan protein (GFP) ifade testleri gerçekleştirmek için bir yöntem sunar. Tali enstrüman, 3-kanal (parlak bir alan, yeşil floresans, kırmızı floresans) benchtop tahlil platformu olduğunu Offers flow sitometri ve floresan mikroskobu üzerinde çeşitli avantajları. Tali sitometresinin, daha az pahalı, daha az tezgah yer kaplıyor, daha az bakım gerektirir ve iş akışı çalışma ve analizler çok daha basit ve hızlı böylece basitleştirilmiş oldu. Tali sitometresinin GFP ve kırmızı floresan proteini (RFP) ifadesi, apoptosis 4-6 ve propidium iyodür ile hücre canlılığı analizi (PI) 7-11 dahil olmak üzere süspansiyon hücre tabanlı testlerin bir dizi gerçekleştirme yeteneğine sahiptir.
Burada, GFP ifade hücrelerinde hücre canlılığı tahlil yapmak Tali araç kullanımını göstermek. Ölü Hücre Kırmızı - GFP transduced hücreleri Tali Canlılık kiti kullanılarak boyandı. Bu hücreler daha sonra bir Tali Hücresel Analiz Slayt pipetlenir ve sitometresinin içine yüklenir. Aydınlık alan, kırmızı floresans ve yeşil floresan görüntü yakalanır ve tahlil özel algoritmalar kullanılarak analiz edilmektedir. Histogramlar sonra hücre boyutu, PI fluo görüntülemek için oluşturulanrescence yoğunluğu ve GFP floresan. Bu parametreler daha sonra, belirli bir hücre popülasyonu evine eşiklenir olabilir.
Bir yan yana karşılaştırma Tali Görüntü Tabanlı Sitometre ve geleneksel akış sitometri, iki yöntem hücre canlılığı ve protein ekspresyonu ilişkin karşılaştırılabilir veriler sağlamaktadır olduğunu göstermektedir. Ancak, Tali enstrüman, bir akış sitometre kullanılarak elde edilemeyen hücre popülasyonu hakkında ek görsel bilgi sağlar.
Protocol
1. Tali Canlılık Kiti ile boyanarak Hücreleri - Ölü Hücre Kırmızı Reaktif
- CellLight Nucleus-GFP * BacMam 2.0 kullanarak transduced U2OS hücreleri (Amerikan Tip Kültür Koleksiyonu) ile bu yordama başlamadan *. (Not: Hücreler aynı zamanda aşağı döndü ve orta ya da PBS içinde yeniden süspanse olabilir).
- PI ile ölü hücreleri leke için, yeni bir mikrosantrifüj tüpü 100 mcL hücrelerinin transferi. 1 x 10 5 1 x 10 7 hücre / ml 'lik bir konsantrasyon tayini için önerildiğini unutmayın, ama konsantrasyonu tam olarak sahip değildir.
- Daha sonra, ölü hücreleri leke PI tabanlı Tali Ölü Hücre Kırmızı reaktif 1 mcL ekleyin. Vortex kısa bir süre karıştırın. 1-5 dakika karanlıkta, oda sıcaklığında Tali Ölü Hücre Kırmızı reaktif ve hücre karışımı inkübe edin.
- Inkübasyon sonrasında, hemen Tali Görüntü Tabanlı Sitometre numune analizi geçin.
2. Hücre Canlılık Testi Sahne kullanmaTali Görüntü Tabanlı Sitometre
- Tali sitometresinin, özellikle sitometresinin sığacak ve iki ayrı kapalı odaları (A ve B) 25μL örnekleri tutabilir tek kullanımlık plastik Tali Hücresel Analiz Slaytlar kullanır. Slayt tutarken, her iki tarafın da onu tutmak için emin olun.
- Yavaş yavaş, yarım ay biçimli bir örnek yükleme alanı içine slayt, pipet 25 mcL örnek oluşturan kabarcık veya geri sıçramak özen yüklemek için. Veya dolgu altında bırakmayın.
- Burada, kontrol hücreleri (lekesiz, non-transduced) odasında yüklenir A ve lekeli GFP ifade hücreleri kontrol örneği verileri analiz ederken otofloresans düzeyi belirlemek yardımcı olacaktır kamara B. yüklenir.
- Sitometresinin ana ekranda bir canlılığı testi, dokunmatik GFP / TÇD gerçekleştirmek için. Tahlil seçenekleri sonra sağ tarafta görünecektir. GFP + Canlılık seçin.
- Daha sonra, örnek bir dizi isim, Şimdi Adı basın Kaydet tuşuna basın. (Not: Seç Adı daha sonra tarihi ve saati otomatik olarak her bir numune serisi için bir isim atamak için .)
- Örnek adlandırma sonra, Tali sitometresinin Ölçü ekranına otomatik olarak ilerler. Ölçü ekranın sağ alt yarısında Arka Plan sekmesine basınız.
- Sonra, durana kadar (A) Sitometre uzakta karşı karşıya kontrol örneği ile yükleme noktası slayt eklemek. Kuvvet uygulamayın.
- Arka plan ekran, dokunmatik Yeni lekesiz Hücre Kontrol Ekle tuşuna basın. Slayt otomatik olarak sitometresinin içine çekilebilir ve hücrelerin canlı bir görüntü ekranda görüntülenir.
- Odak düğmesini kullanarak, doğru düzlemde hücreleri getirmek. Hücreler her hücre etrafında parlak bir hale (Şekil 1, Sol) ile düzgün koyu renkli olmalıdır.
- Hücrearka plan ve hücrelerin kenarları arasındaki geçiş bulanık s hücre sınırları iyi tanımlanmış değildir (Şekil 1-Merkez), böylece undercounted olabilir. Hücreler overcounted parlak merkezleri ve karanlık çevrelerinin (Şekil 1, sağ) olduğunda olabilir.
- Odaklanarak hücre popülasyonu daha iyi görmek için, 16X 4X ya da kırmızı Zoom göstergesi düğmesini kaydırın .
- Hücreleri odak noktası haline getirilmiştir sonra, arka plan floresan ölçmek için lekesiz Hücre Kontrolü Çalıştır düğmesine dokunun.
- Sitometresinin otomatik olarak yakalama ve örnek görüntüleri analiz eder. (Resim 9) modu, varsayılan görüntü yakalama ve analiz etmek için yaklaşık 1 dakika sürer.
- Thumbnails görünümü her alanda esir olarak görüntülenir ve ilerleme çubuğu, devam eden bir güncelleştirme sağlar. Görüntü yakalama işlemi tamamlandıktan sonra, sitometresinin otomatik olarak slayt çıkarıyor ve çekilen görüntülerin analiz verileri sağlar.
- Depolanan veri sitometresinin Arka Plan sekmesini menüsü açılan gözükecektir. Arka plan kontrolü örnek deney verilen ve açılır menüden ithal edilecek aynı adı tahsis edilecektir. Not: bir arka plan kontrolü değilse, sitometresinin otomatik olarak bir floresan eşik atar. Bu tahlil yaptıktan sonra elle değiştirilebilir.
- PI lekeli transduced örneği çalıştırmak için, sitometresinin slayt kaldırmak etrafında çevirin ve transduced numune cihaz uzak bakacak şekilde yeniden takın.
- Örnek sekmesine basınız ve daha sonra Yeni Örnek Ekle tuşuna basın dokunmatik . Görüntü ekranda belirdiğinde görüntü ayar düğmesi hücreler, daha önce olduğu gibi odak noktası haline getirmek için kullanın. Sonra Örnek Çalıştır düğmesine dokunun.
- Görüntü yakalama işlemi tamamlandıktan sonra, veri analiz örnek sekmesi ve sitometresinin otomatik altında görünürmüttefiki slayt çıkar.
- Uygun Tali Hücresel Analiz Slide biyolojik tehlikeli atık olarak bertaraf. Tali Hücresel Analiz Slaytlar tekrar edilemez.
3. Ayar Eşikler ve Gates
- Örnek çalıştırıldıktan sonra, eşikler artık belirli bir hücre popülasyonu üzerinde ev için örnek olabilir. Burada, biz, hücreler transduced-GFP canlı ve ölü hücrelerin yüzdesi belirlemek için eşikleri ayarlayabilirsiniz.
- Örnek sekmesi altında, GFP ifade hücreler, GFP, toplam canlılığı, ortalama hücre boyutu, sayılır hücrelerinin sayısı ve hücre konsantrasyonunu ifade canlı ve ölü hücreleri sayı ve yüzde olarak gösterilir.
- Buna ek olarak, hücre boyutu, yeşil floresans, kırmızı floresans (PI) gösteren histogram araziler, ekranın alt kısmında görüntülenir.
- Hücre boyutunu kapısı ayarlamak için, Hücre Boyutu Küçük resim hücre boyutu histogram açmak için dokunun. Kültür hücreleri d nadiren olsa daebris, diğer örnekleri hücrelere oranla daha büyük ya da küçük kalıntılar içerebilir.
- Bu enkaz dışlamak için, hem küçük hem de büyük olaylar hariç, kaydırma çubuğu üzerindeki mavi düğmeleri doğru kaydırın. Sonra, dokunma, verileri yeniden analiz uygulayın ve sonuçları güncelleyecektir .
- Sonra, GFP floresan analize eklemek için, açmak için GFP histogram minik dokunmayın. Kontrol örneği bir kılavuz olarak kullanarak, sadece en belirsiz tepe sağ eşik ayarlamak için mavi çubuğunu kaydırın.
- Bu analiz, GFP pozitif hücreler içerir, ancak autofluorescent hücreleri hariç sağlar. Biyolojik moleküllerin hücre içinde heyecanlıyız Otofloresans sık görülmektedir.
- Onaylayın ve bir önceki ekrana dönmek için Uygula dokunun. Örnek sekmesi altında görüntülenen veriler artık her iki floresan kanal için belirlenen kapı ve kapı eşikleri yansıtmalıdır .
- Daha sonra, otofloresansı basın t PI boyanan hücrelerin ayrıPI histogram minik PI histogram açmak için.
- Yine, kontrol örneği zirve histogram üzerinde gri bir zirve olarak görünecektir. Kırmızı tepe örnek floresan. Eşiğe bu sitometresinde 0 RFU değerine yakın bir tepe olarak görüntülenir.
- PI kanalı arka plan floresan ortadan kaldırmak için, bir referans olarak kontrol örneği gri pik kullanarak, arka plan floresan temsil eden zirve dışlamak için eşik ayarlamak için kaydırma çubuğunu mavi düğme hareket. Onaylayın ve bir önceki ekrana dönmek için Uygula dokunun.
- Sonra, sonra Katmanlar tab tuşuna basarak görsel, her hücre doğru atanmış olduğunu onaylamak Zoom sekmesinde görüntünün küçük resmini basarak, incelenmek üzere yakalanan bir alan seçin.
- Sonra, bu özel kanal aracılığıyla çekilen görüntü ekranı, GFP veya PI düğmesine basın .. Ekrandaki tabakayı kaldırmak için aynı düğmeye tekrar basın; veya katmanları üst üste, Çoklu Katman düğmesine dokunun.
- Hücreleri belirli bir kanal, dokunmatik Çemberleri ile nasıl sayılır tanımlamak için. Floresan mavi çember olacak ifade yok sadece parlak bir alan kanal, üzerinden sayıldı hücreleri. Bu belirli bir hücre (yani PI negatif) canlı olduğunu gösterir.
- Hücreler ifade GFP GFP kanal olacak ve yeşil daire olacak. PI kanal Ölü Hücre Kırmızı ile boyanmış ölü hücreleri görülebilir ve kırmızı daire içine alınmış olacak.
- Sarı, kırmızı ve yeşil kanal sayılır Hücreler daire olacak, bu hücre, GFP ifade ettiğini gösterir, aynı zamanda PI ile boyanmış ve bu nedenle öldü.
- Bazen, siyah daireler, ekranda görünecek, bu nesneleri tespit edilmiştir, ancak hücre boyutuna göre analiz dışında tutulmuştur.
- Fi devamne ayar floresan ifade her hücre uygun bir renk ile daire kadar açıklanan adımları kullanarak floresan histogram eşik.
- Tüm analiz parametreleri otomatik olarak veri sekmesi altında kaydedilir. Tali sitometresinin örnek çalışan yaklaşık 500 veri dosyalarını saklayabilir.
- Veri sekmesinde saklanan Her dosya reanalysis kullanılabilir. Veri sekmesinden dosya seçerek açtı ve tüm histogramlar ve katmanları aktif hale olacaktır.
- Arşiv verileri ve raporları oluşturmak, Sitometre saklanan verileri bir bilgisayara bir USB sürücü kullanarak transfer edilebilir.
4. Temsilcisi Sonuçlar:
Tali Görüntü Tabanlı Sitometre bir nükleer hedefli GFP BacMam 2.0 ifade inşa transduced hücrelerin floresan protein ekspresyon seviyesi ölçmek için kullanılmıştır. Dört temsili hücre tipleri (U2OS, 293MSR, HEKn ve CHO-S) transduced edildi.Bu hücre hatları için, GFP ifade edildi hücrelerinin sayısı Tali sitometresinin tarafından bildirilen ve aynı örneklerinden bir akış sitometresinde analiz verileri ile karşılaştırıldığında. Ayrıca, hücreler Ölü Hücre Kırmızı reaktif Tali sitometresinde ve bir akış sitometresinde hem ölü hücre popülasyonu tespit Tali Canlılık kiti kullanılarak boyandı.
Şekil 2'de grafik GFP ifade vardı, her hücre tipi için toplam nüfusun yüzde göstermektedir. Bu veriler, Tali sitometresinin bir akış sitometresinde tarafından oluşturulan verilerin karşılaştırılabilir veri üretmektedir göstermektedir.
Şekil 1. Hücreler düzgün analizinden önce odaklı olmalıdır. Tali Hücresel Analiz slaytlar analizi için uygun (1 x 10 1 - 5 x 10 7 hücreleri tavsiye edilir) hücre konsantrasyonları ile (SOL) odak hücrelerin düzgün darka plan arasındaki geçiş ve hücrelerin kenarları bulanık ve hücrelere parlak olduğunda Hücreler belki overcounted tanımlanmamış sınırları (SAĞ) olduğunda, her bir hücre (MERKEZ) Hücreler etrafında parlak bir hale ile hücre boyunca gemisinin, undercounted olabilir merkezleri ve karanlık çevrelerinin.
Şekil 2. Tali Görüntü Tabanlı Sitometre floresan protein ekspresyonu verileri flow sitometri kullanılarak elde edilen karşılaştırılabilir canlı hücreler 4 farklı hücre hatları hesaplanan GFP-ifade sonuçlarının yan yana karşılaştırma.
Discussion
Biz sadece, canlılığı sayımları yerine ve Tali Görüntü Tabanlı Sitometre kullanarak GFP ifade değerlendirmek için bir prosedür ayrıntılı var. Aynı prosedürü kullanarak, bu sitometresinin diğer testleri de dahil olmak üzere bir dizi performans yeteneğine sahip olmayan transduced hücreleri kullanarak, apoptoz, RFP ve hücre canlılığı analiz.
Hücre canlılığı, gen ekspresyonu ve apoptosis Florimetrik testleri 7-12 biyomedikal araştırmaların temel yöntemler haline gelmiştir. Geçmişte, ayrı enstrümantasyon, hücreler hakkında nicel ve görsel bilgi almak için kullanılmaktadır. Heterojen bir nüfus içinde hücreleri hakkında kantitatif bilgi akış sitometri kullanımı yoluyla topladı olsa da, görsel ya da nitel bilgiler floresan mikroskobu 1-4 kullanımı yoluyla toplanmıştır. Burada, biz, halk ve tek tek hücre çalışmaları arasında bir köprü bir teknoloji sunuyoruz. Tali Görüntü Tabanlı Sitometre, kantitatif da kullanarakta ve aynı anda, tek tek hücrelerin veya hücre popülasyonlarının hakkında görsel hücre veri toplanabilir. Tali enstrüman, gen ekspresyonu, apoptozis testlerin değerlendirilmesi, ilaç etkinlik çalışmaları ve hastalığın ilerlemesi değerlendirilmesi de dahil olmak üzere bir dizi uygulamalar için kullanılabilir.
Tali Görüntü Tabanlı Sitometre yakalar ve elde edilecek hücrelerin alt popülasyonlar hakkında bilgi sağlayan, parlak alan, kırmızı floresans ve yeşil floresan görüntüleri analiz eder. Örneğin, bu testte, Ölü Hücre Kırmızı boya kullanarak GFP ifade hücre popülasyonu içinde canlı hücrelerin ölü hücreleri ayırt etmek mümkün. Bu canlı hücreler, GFP ifade ölçüm doğruluğu ve sonraki işlemlerde kullanışlı hücreleri nüfus tanımlar. Nüfus içindeki ölü hücreler kültürde çevre koşulları (örneğin, trypsinization veya neden normal hücre ölümü ya da hücre ölümü de dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan gelen ortaya çıkabileceği unutulmamalıdır.seçilen transfeksiyon / transdüksiyon yöntemi ile indüklenen sporcudan).
İşte biz U2OS hücreleri ile Tali sitometresinin kullanımını göstermektedir. Benzer yöntemler, en memeli ve böcek hücreleri kullanılarak yapılabilir. Her bir hücre hattı için, Tali sitometresinin, nicel GFP ifade veriler, standart bir floresan mikroskop kullanılarak hücrelerin görsel bir inceleme ile mümkün değildir. Bu sonuçlar flow sitometri ile karşılaştırılabilir olmasına rağmen, zamanının bir kısmını tahsil edilir. Sitometresinin ideal 1 x 10 1 - 5 x 10 7 hücre / ml 'lik bir konsantrasyon, çapı 5 mikron ile 60 mikron arasında doğru sayma hücreleri yeteneğine sahiptir .
Ölü Hücre Kırmızı boyama protokolü, burada açıklanan dahil olmak üzere çoğu standart boyama protokolleri, işaret etmek önemli, canlı ve ölü hücrelerden ayırt propidium iyodür kullanın. St permeabilize hücreleri canlılığını ölçerken bir meydan okuma sunuyorPI, kuşkulu bir membran ile, herhangi bir hücreyi leke, hücre içi belirteçlerin aining. , Yeşil ya da kırmızı floresan kanalları ile tespit edilebilir herhangi bir floresan boya veya protein Tali Görüntü Tabanlı Sitometre analiz edilebilir, gelecekteki çalışmalar amin reaktif canlılığı boyalar 4 gibi alternatif boyaların kullanımı, keşfedebilirsiniz. 2006 Perfetto ve ark tarafından yapılan bir çalışmada 12, bu boyalar, canlı ve ölü hücre popülasyonlarının ayrımcılık kullanımı kolay ve tekrarlanabilir olduğu bulundu.
Tali gerçekleştirebilirsiniz testlerinin türleri açısından sınırlamalar olduğunu unutmayın. Örneğin, cihaz tarafından kullanılan objektif 4X olduğundan, sayma işlemleri büyük hücre tipleri sınırlıdır: mitokondri veya veziküller gibi alt hücresel yapılar, bakteri hücrelerinin sayısal olamaz. Ayrıca Tali tespit kanalları heyecanlandırmak ve kanalları içinde yayacaktır fluorophores sınırlı olduğunu unutmayın. Iken YFP ve parlak mCherry sinyalleri cbir tespit, dimmer mCherry sinyalleri olamaz. Son olarak, Tali sadece süspansiyon hücreleri analiz. Bu doğru bir slayt yapışan hücreler sayılmaz. Ayrıca, bazı maya ve birincil hücreler de dahil olmak üzere, düzensiz şekilli hücre sayımı için sadece sınırlı bir yeteneği vardır.
Buna ek olarak, gelecekteki çalışmalarda, büyük olasılıkla intrasellüler belirteçlerin ifade değerlendirmek bu sistemin kullanımı ele alınacaktır. Bireysel boyalar Invitrogen Kullanıcı online SpectraViewer aracı (kullanarak komşu kanalları ile spektral örtüşme için kontrol edilebilir www.invitrogen.com / spectraviewer ). Bu teknolojinin yeniliği göz önüne alındığında, tam kapsamlı uygulamalar henüz keşfedilmeyi.
Özetle, Tali Görüntü Tabanlı Sitometre gösterdi, tek tek hücrelerin değerlendirilmesi yanı sıra cel sağlayan hücre popülasyonlarının eşzamanlı görselleştirme ve analizi için olanak sağlayan yeni bir teknoloji sunuyorl nüfusu basit bir iş akışı ile kompakt bir biçimde.
Disclosures
Krissy Remple ve Laurel Stone Bu makalede kullanılan araç üretmiş Life Teknolojileri çalışanı vardır. Yaşam Teknolojileri, bu video makale üretimi sponsor oldu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tali Image-Based Cytometer | Invitrogen | T10796 | |
| Tali Cellular Analysis Slides, 50 Slides | Invitrogen | T10794 | |
| Tali Cellular Analysis Slides, 500 slides | Invitrogen | T10795 | |
| Tali Viability Kit - Dead Cell Red | Invitrogen | A10786 | |
| Tali Viability Kit - Dead Cell Green | Invitrogen | A10787 | |
| Tali Apoptosis Kit | Invitrogen | A10788 | |
| U2OS cells |
References
- Godfrey, W. L., Hill, D. M., Kilgore, J. A., Buller, G. M., Bradford, J. A., Gray, D. R., Ignatius, M. J., Janes, M. S. Complementarity of Flow Cytometry and Fluorescence Microscopy. Microsc. Microanal. 11, 246-247 (2005).
- Mittag, A., Pinto, F. E., Endringer, D. C., Tarnok, A., Lenz, D. Cellular analysis by open-source software for affordable cytometry. Scanning. 33, 33-40 (2011).
- Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. Biophys. J. 73, 2782-2790 (1997).
- Smyth, P. G., Berman, S. A. Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system. Biotechniques. 32, 648-654 (2002).
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V. J. Immunol. Methods. 184, 39-51 (1995).
- Koopman, G. Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis. Blood. 84, 1415-1420 (1994).
- Tanke, H. J., van der Linden, P. W., Langerak, J. Alternative fluorochromes to ethidium bromide for automated read out of cytotoxicity tests. J. Immunol. Methods. 52, 91-916 (1982).
- King, M. A. Detection of dead cells and measurement of cell killing by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 243, 155-166 (2000).
- Jones, K. H., Kniss, D. A. Propidium iodide as a nuclear counterstain for immunofluorescence studies on cells in culture. J. Histochem. Cytochem. 35, 123-125 (1987).
- Dell'Arciprete, R. High-efficiency expression gene cloning by flow cytometry. J. Histochem. Cytochem. 44, 629-640 (1996).
- Lamm, G. M., Steinlein, P., Cotten, M., Christofori, G. A rapid, quantitative and inexpensive method for detecting apoptosis by flow cytometry in transiently transfected cells. Nucleic. Acids. Res. 25, 4855-4857 (1997).
- Perfetto, S. P. Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J. Immunol. Methods. 313, 199-208 (2006).
