在成年斑马鱼心肌梗死的感应使用Cryoinjury

Summary

斑马鱼代表一个有价值的模型来研究脊椎动物的心脏再生的机制。在这里，我们提出了一个在成人使用cryoinjury斑马鱼的心脏梗死诱导的协议。这种方法在大量的细胞死亡的结果，20％的室壁内，类似的观察哺乳动物梗死。

Abstract

哺乳动物心脏不能再生的重大急性损伤，如心肌梗死^1。相比之下，urodele两栖类和硬骨鱼保留了很少或没有疤痕整个生命^2,3心肌再生的非凡能力。它不知道为什么只有一些非哺乳类脊椎动物可以重新创建一个完整的器官，从^4,5残余组织。为了了解在不同物种之间的再生反应的细胞和分子的差异，我们需要使用类似的方法诱导急性损伤。

在哺乳动物中，最常用的模型来研究心脏修复一直是急性心肌缺血后结扎冠状动脉组织的破坏或后cryoinjury ^6,7。已在蝾螈和斑马鱼的心脏再生主要心尖^2,3部分切除后的研究。近日，几组有establ在成年斑马鱼^8-10 ished的cryoinjury技术。这种方法具有很大的潜力，因为它允许从哺乳动物和非哺乳动物物种得到的结果进行比较讨论。

在这里，我们提出了一个方法来诱导重现圆盘形的斑马鱼cryoinjury的心室梗死。此损伤模型的基础上迅速组织冻融，导致大规模的约20％的室壁心​​肌细胞死亡。首先，一个小切口，通过胸部与虹膜切除术剪刀访问的心。室壁直接冻结申请不锈钢超低温液态氮预冷23-25​​秒。停止冻结的心，鱼水在室温下的冷冻探针的尖端下降。程序是很好的耐受动物，成活率为95％。

表征的再生过程，心中收集并固定在不同天cryoinjury后。随后，标本嵌入的cryosectioning。节的幻灯片在原位杂交和免疫组织学分析，处理。这项承诺，增强了我们理解的因素，都需要在斑马鱼再生的可塑性，与心肌再生的机制提供了新的见解。在斑马鱼心脏再生的概念和分子生物学的理解会影响发育生物学和再生医学。

Protocol

1。设备设置

1. 主要工具用于执行cryoinjury的是冷刀，笔状的仪器，由不锈钢制成（ 图1A）。圆柱柄长40毫米，有一个直径为8毫米。涂药的一角是6毫米长，直径0.8毫米。尖和手柄之间的交界处，是4毫米长的锥形。此外，冷刀的手柄应隔离用塑料管和磁带，以避免冻伤的手指，同时在手术过程中的工具。
2. 为冷冻所需的其他材料，立体显微镜，锋利的镊子，解剖微弹簧剪刀和一个塑料移液管。此外，准备麻醉转让的鱼的鱼和一个塑料勺子烧杯。
3. 在手术过程中，鱼放在潮湿的海绵上与它腹朝上（ 图1B）。要保持一个稳定的过程中的动物，适当的凹槽，应手动切断海绵。
4. 准备坦克与系统水转移，手术后的鱼。
5. 成立了第一双定时器10秒倒计时，然后自动24秒倒计时。

2。 Cryoinjury程序

1. 降温超低温液态氮在3-5厘米的一角，至少有3分钟的浸泡。
2. 麻醉成年斑马鱼浸入0.02％tricaine直到鱼变成在它的后面，其鳃几乎停止不动（约90秒）。
3. 转让持有鱼倒挂（ 图1B），已被切割到一个潮湿的海绵用塑料勺子鱼。保持稳定使用非惯用手钳鱼。视觉定位后内侧缘的心，并直接使用虹膜切除术剪刀穿破皮肤。 （ 图1C）。
4. 上述由铜的心脏，使一个小切口（约2毫米）tting直前方通过皮肤，肌肉（ 图1D）。切不要通过骨鳃仪器，因为这会杀死动物。
5. 用剪刀尖轻轻撕的皮下组织银上皮细胞层（ 图1E）有直接访问跳动的心室。不要插入剪刀更深的体腔，这一意志刺穿心脏。跳动的心脏应该是可见的，并没有广泛出血发生在开胸手术（ 图1F）。
6. 开始编程定时器已被设定为24秒10秒。在10秒内从液氮中取出冷冻探针。确保有没有更多的超低温的氮轻轻晃动。传播的切口，横向用钳子打开胸部（ 图1F）。
7. 一旦定时器环10秒，但轻轻触摸立即心室尖的PR电子冷却的超低温（ 图1G）。
8. 一旦定时器铃响24秒，系统的水倒入2-3毫升的胸口上用塑料吸管从组织释放的超低温，并转移到系统水箱的鱼。
9. 鱼应该重新启动后几秒钟的呼吸，那么它应该继续游泳。如果没有呼吸约45秒后，用塑料吸管喷出水，直到它开始进入鳃呼吸本身刺激动物。在我们的经验，95％的鱼类生存的手术，手术当天发生的所有死亡。这不会是必要的缝合切口。

3。心脏的收集和固定

1. 准备在离心管1毫升2％的福尔马林固定的心脏，两钳，微解剖剪刀和开槽的潮湿海绵。
2. 在选择cryoinjury后的一天，安乐死鱼在0.1％tricaine 5分钟。
3. 放置鱼腹部朝上成潮湿的海绵，开槽。做一个心通过与微观解剖剪刀鳃软骨以上大（约4毫米）切口。打开广泛的切口，用血管钳（ 图1H）。
4. 掐了bulbus动脉，心室（ 图1，HI）前一个白色结构，并从拉心腔。一整个心脏解剖图1J和图2A所示。
5. 到离心管中最多放置3心1毫升2％福尔马林。轻轻转动管数次，并保持在一夜之间在4°C。

4。心脏安装

1. 在PBS冲洗5分钟的心中。转入10毫升30％的蔗糖，应在4°C预冷的心，轻轻混匀。标本应首先浮在表面的蔗糖溶液。继续在4°C孵育1小时20分钟后这时候，心中会下沉到试管底部。
2. 准备一个盒子，用干冰。采取嵌入模具，倒在模具的底部1华侨城安装介质5毫米的层。
3. 用钳子把安装在模具的中型到OC牛逼的心。体视显微镜下，调整心室心尖部，模具底部和bulbus动脉标本，以实现对顶部的方向。
4. 干冰放置试样模具。当安装介质开始冻结，填补其余的模具与华侨城中等，让它完全冻结。切片前至少1小时保持在-80℃的模具。冰冻标本可存储多月，在-80°C。

5。心切片

1. 成立有恒冷切片机用切割16微米大小，-24℃的室内温度和试样温度在-22°C。
2. 将冻块样品在低温恒温器和解决的方向，开始切割块底部平行。
3. 准备每一个块六个Superfrost加幻灯片，，且具他们从1到6。开始切割，直到达到组织，修剪周围用剃刀刃的标本块。
4. 一心要获得6重复，首节幻灯片1，幻灯片2的第二部分，第三张幻灯片3，一旦你放在第六部分幻灯片6，重新启动幻灯片1并继续下去，直到整个器官被切断。收集两部分幻灯片上8点左右行（ 图3）。
5. 让幻灯片干燥，在室温下1小时。他们在密闭的箱子存储多达1年内，在-20°C

6。代表结果

DPCI（4几天后cryoinjury的代表心肌损伤后，该协议是在整个心脏解剖图2D - F）。到V在体内 isualize心肌组织中，我们使用转基因鱼心脏特定cmlc-2启动子^11,12的控制下表达绿色荧光蛋白和核DsRed2。 EGFP和DsRed2荧光信号的情况下，划定一个圆盘形的梗塞区，沿心尖侧脑室壁。

执行组织的细胞和分子生物学分析，心中是固定的切片，并与恒温器。与横向的心脏部分的连续系列的一个代表性的幻灯片如图3所示。

的部分，可以分析各种方法（ 图4）。心脏再生与疤痕的程度来确定的，我们进行病理分析，使用酸性品红橙- G（AFOG）染色，心脏和肝纤维化组织差异标签^9。根据原位杂交过程中取得了基因表达分析9特异性抗体免疫荧光法。结合不同的染色程序导致的细胞和分子机制参与心肌再生以下cryoinjury鉴定。

图1。诱导的成年斑马鱼心室cryoinjury。 （A）的超低温照片。 （二）成年斑马鱼被放置在海绵的缝隙，其腹侧的一面朝上。 （CF）胸部切口访问的心。 （C）通过皮肤和肌肉的小切口，两者之间的胸鳍（红线）。 （四）剪刀插入切口，切开皮肤后的红色箭头。 （五）下的皮肤，精致的银色皮下组织层（蓝色虚线包围）轻轻打开访问的心。 （六）切口与传播镊子和跳动的心室（绿色箭头）是为cryoinjury访问。 （七）冷超低温轻轻插入胸部触及心脏。 “（HJ）心的集合。 （H）深又长的切口，通过胸部的鳃弓，进入心包腔。可见两个心脏的结构是：bulbus动脉（白色箭头）和心室（绿色箭头）。 （一）bulbus动脉钳和拉从体腔。 （十）：整个的心离身体。

图2。代表控制和表达EGFP和心肌细胞中的核DsRed2成年转基因斑马鱼解剖cryoinjured心中。 （交流）没有受伤的心。 （一）暗场照明显示心室（V）bulbus动脉（BA，白）和阀门（VA），心房与心室。 T（B和C）的荧光图像他完整的心室显示EGFP和DsRed2表达在心肌细胞。 （DF）的心在后4天cryoinjury（4 DPCI）（四）暗场照明，揭示了一个圆盘形的心肌梗死（黄色虚线）。 （英法），心肌细胞标记EGFP和DsRed2被检测不到的梗死面积，表明受损心肌（虚线包围）。

图3。心脏的切片。 （一）所有的心从心对心脏的顶部（1和2，在红）（绿3和4）的底部开始的横向部分的图纸。 （二）与一系列与AFOG（酸性品红橙 - G）染色的连续横向部分的幻灯片库。第一部分（1和2，红色正方形）包含心室心尖部，心（3和4，绿色方块）的最后部分，包括bulbus动脉。

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分析图4。进行心脏部分7天cryoinjury。 （一）AFOG（酸性品红橙 - G）染色标签橙色健康的肌肉细胞，蓝色和红色纤维中含有胶原蛋白的疤痕组织。 （B） 在心室肌球蛋白重链（vmhc）原位杂交mRNA的可视化的完整的心肌（蓝染色）。受伤的组织是没有心脏基因转录（红色虚线）。 （三）原肌球蛋白Immunoassaying（绿色）标签完整的心肌细胞和未受损的组织（虚线包围）。的DAPI（蓝色）的污渍所有细胞的细胞核。 （四）基因标记的心肌表达DsRed2（红色）在其细胞核。的DAPI（蓝色）标签所有的核。梗死区不包含的DsRed2阳性细胞（白色虚线）。

Discussion

精确应用的极端寒冷的¹⁴ cryoinjury被定义为控制组织损伤。直接热冲击破坏细胞蛋白质的破坏和细胞内液冰晶体的形成，破裂的细胞膜。因此，受伤的细胞死亡过程细胞凋亡和坏死^14。这些细胞死亡的机制都已经被证明有助于心肌梗死后¹⁵到组织的损失。因此，cryoinjury诱发心脏病心肌梗死的一个合适的模型。一些研究报告很好地证明了这在各种哺乳类动物，包括小鼠，大鼠，兔和猪^6,7方法。适应的在斑马cryoinjury协议使梗死响应在不同物种之间的比较讨论。

其他两个小组独立开发的成年斑马鱼心脏cryoinjury程序。主要区别是在河畔的盖瑞方法，工具的类型和应用冻结时间。在由冈萨雷斯罗莎等。的研究，心包被打开了被撕裂的组织，而不是削减。他们用0.3毫米的铜灯丝连接到聚酰胺管在液氮冻结，直到几秒钟的心融化，可观察到¹⁰预冷。在研究施纳贝尔等，其直径为2毫米的尖头锥形件的长度为20毫米的干冰用于触及10秒⁸的心。这两个群体获得通过心室损伤的心肌死亡。我们的方法的优点是富含胶原蛋白的疤痕，从而更好地模仿梗死早期愈合在哺乳动物系统中观察到的反应更重现的沉积。

期间斑马鱼cryoinjury的过程中关键的一步是通过皮肤和心包无切口，刺穿心脏底层。正确performeð手术导致出血少。大出血表​​明无意用剪刀脑室穿刺。在这种情况下，应收回动物实验。为了避免刺穿心脏，剪点应着眼于皮肤浅角度。

创建重复性损伤的另一个重要方面是最佳的精确时间脑室冷超低温的精确定位。冻结时间过短会导致炎症与小细胞死亡。长期冻结，另一方面，可能会造成广泛的损害心脏，这可能会导致以增强动物的死亡率。我们确定的最佳时间保持在23-26秒之间的冻结状态范围为2厘米长的成年斑马鱼心室，它可能会有所不同动物的大小依赖性。

因为我们的协议是非常简单和快速的，有没有实验限制ations在受到足够数量的动物，以获得足够的生物复制。氩氦刀治疗是很好的耐受性动物。在不同的时间点后cryoinjury心中的集合允许在再生过程中的后续阶段的详细描述。实验分析的cryoinjured的心灵可能包括：1）可视化原位杂交基因转录，2）检测免疫荧光染色，3）的蛋白质分布不同结构的组织学成像。了解在斑马鱼心肌梗死后的愈合过程会影响再生生物学领域。此外，它可能是有益的设计在再生医学的新的治疗方法。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro dissecting spring scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5602
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
Formaldehyde ~36%	Sigma-Aldrich	47630
Sucrose	Sigma-Aldrich	84100
Tissue-Tek O.C.T. compound	Sakura Finetek	4583
Slides Superfrost Plus	Fisher Scientific	12-550-15
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds - Truncated Molds T8	Polysciences, Inc.	18985