Summary
De zebravis is een waardevol model om de mechanismen van het hart regeneratie studeren in gewervelde dieren. Hier presenteren we een protocol voor inductie van een hartinfarct bij volwassen zebravissen met cryoinjury. Deze methode resulteert in een massale celdood binnen 20% van de ventriculaire wand, vergelijkbaar met dat in zoogdiercellen infarcten.
Abstract
De zoogdieren hart is niet in staat om belangrijke regeneratie na een acute blessure zoals myocardinfarct 1. Daarentegen urodele amfibieën en beenvissen behouden van een opmerkelijk vermogen voor cardiale regeneratie met weinig of geen littekens gedurende het hele leven 2,3. Het is niet bekend waarom alleen sommige niet-zoogdieren gewervelde dieren kan een volledig orgaan opnieuw uit de restanten van weefsels 4,5. Om de moleculaire en cellulaire verschillen tussen de regeneratieve reacties in verschillende soorten te begrijpen, moeten we een soortgelijke aanpak te gebruiken voor het induceren van acute blessures.
Bij zoogdieren is het meest gebruikte model om cardiale reparatie studeren geweest acute ischemie na een ligatie van de kransslagader of weefsel vernietiging na cryoinjury 6,7. De cardiale regeneratie in de salamanders en de zebravis is voornamelijk onderzocht na een gedeeltelijke resectie van de ventriculaire apex 2,3. Onlangs zijn enkele groepen establRouveroy laat de cryoinjury techniek bij volwassen zebravissen 8-10. Deze methode biedt grote mogelijkheden omdat hierdoor een vergelijkende bespreking van de resultaten van het zoogdier niet-zoogdiersoorten.
Hier presenteren we een methode om een reproduceerbare schijfvormige infarct van de zebravis ventrikel door cryoinjury induceren. Deze verwonding model is gebaseerd op snel invriezen-ontdooien weefsel, waardoor grote celdood van ongeveer 20% van cardiomyocyten van de ventriculaire wand. Eerst werd een kleine incisie gemaakt door de borst met iridectomie een schaar naar het hart te openen. De ventriculaire wand rechtstreeks bevroren door toepassing van 23-25 seconden een roestvrijstalen cryoprobe voorgekoeld in vloeibare stikstof. Om de bevriezing van het hart, vis water op kamertemperatuur te stoppen werd gedropt op het puntje van de cryoprobe. De procedure wordt goed verdragen door dieren, met een overlevingskans van 95%.
Om het herstel proces te karakteriseren, de harten warenverzameld en gefixeerd op verschillende dagen na cryoinjury. Vervolgens werden het monster ingesloten voor cryosectioning. De dia met secties werden verwerkt voor histologisch onderzoek, in situ hybridisatie en immunofluorescentie. Deze verbintenis vergroot ons begrip van de factoren die nodig zijn voor de regeneratieve plasticiteit in de zebravis, en bieden nieuwe inzichten in de machinerie van cardiale regeneratie. Een conceptueel en moleculaire begrip van hart-en regeneratie in de zebravis zal gevolgen hebben voor de ontwikkelingsbiologie en regeneratieve geneeskunde.
Protocol
1. Apparatuur Set-up
- Het belangrijkste instrument dat wordt gebruikt om cryoinjury uit te voeren is de cryoprobe, de pen-achtige instrument dat is gemaakt van roestvrij staal (figuur 1a). De cilindrische handgreep 40 mm lang en heeft een diameter van 8 mm. Het uiteinde van de applicator 6 mm lang en 0,8 mm diameter. Het verbindingspunt tussen de tip en de handgreep conische 4 mm. Bovendien moet de handgreep van de cryoprobe geïsoleerd worden met een kunststof buis tape bevriezing van de vingers voorkomen terwijl het gereedschap tijdens de procedure.
- Andere materialen die nodig zijn voor de cryochirurgie zijn een stereomicroscoop, scherpe tang, micro ontleden voorjaar schaar en een plastic transferpipet. Daarnaast bereiden op een beker voor de verlamming van de vis en een plastic lepel voor het overbrengen van de vissen.
- Tijdens de operatie worden de vissen op een vochtige spons met de ventrale zijde naar boven (Figuur 1B). Het dier houden in een stabiele procedure, eengewenste groef moet handmatig worden gesneden in de spons.
- Bereid een tank met het systeem water om de vissen over te dragen na de operatie.
- Het opzetten van een dubbele timer eerst met een 10 seconden aftellen en dan automatisch een 24 seconden af te tellen.
2. De Cryoinjury Procedure
- Afkoeling cryoprobe door onderdompelen van de tip 3-5 cm van vloeibare stikstof gedurende ten minste 3 min.
- Verdoof een volwassen zebravissen door alom tegenwoordige in 0,02% tricaïne tot de vis gaat op zijn rug en zijn kieuwen bijna stoppen met bewegen (ongeveer 90 seconden).
- Breng de vis met een plastic lepel op een vochtige spons die is teruggebracht tot een vis te houden op zijn kop (figuur 1B). Houd vis vast met een pincet het gebruik van niet-dominante hand. Visueel zoek de achterste mediale rand van het hart en het gebruik direct iridectomie schaar om doorboren de huid. (Figuur 1c).
- Maak een kleine (ca. 2 mm) incisie boven het hart door cutting rechte voren door de huid, spieren (figuur 1D). Snij niet door de benige branchial apparaat, omdat dit het dier te doden.
- Trek de zilveren epitheellaag van de hypodermis (figuur 1E) met de punt van de schaar om een directe toegang tot het kloppende ventrikel hebben. Steek de schaar dieper in de lichaamsholte, zoals deze wil doorboren het hart. Het kloppend hart moet goed zichtbaar zijn, en geen uitgebreide bloeding zou optreden tijdens de thoracotomie (Figuur 1F).
- Start de geprogrammeerde timer die is ingesteld voor 10 seconden, gevolgd door 24 seconden. Gedurende 10 seconden duren voordat de cryoprobe uit de vloeibare stikstof. Zorg ervoor dat er geen meer stikstof op de cryoprobe door schudden het zachtjes. Spreid de incisie zijdelings met behulp van een tang om de borst (Figuur 1F) te openen.
- Zodra de timer ringen 10 seconden, raken onmiddellijk maar voorzichtig het ventrikel met de punt van de pre-gekoelde cryoprobe (figuur 1G).
- Zodra de timer ringen 24 seconden, giet er 2-3 ml van het systeem water met een plastic pipet op de borst tot aan de cryoprobe los te maken van weefsel, en breng de vis in de tank met het systeem water.
- De vissen moeten opnieuw ademen na een paar seconden, en dan moet het weer zwemmen. Als het niet ademen na ongeveer 45 seconden, het stimuleren van de dierlijke bijproducten spuiten water in de kieuwen met een plastic pipet totdat het begint te ademen vanzelf. Onze ervaring is dat 95% van de vissen overleven operatie, en alle sterfgevallen plaats op de dag van de operatie. Het is niet nodig insnijdingen hechten.
3. Hart Verzamelen en fixatie
- Bereid 1 ml van 2% formaline in een microcentrifugebuis voor het bevestigen van het hart, twee tang, micro-ontleden schaar en de vochtige gleuf spons.
- Op de geselecteerde dag na cryoinjury, euthanaseren de vis in 0,1% tricaïne gedurende 5 minuten.
- Plaats hetvis ventrale zijde naar boven in een vochtige, sleuven spons. Maak een grote (ca. 4 mm) incisie boven het hart door de branchial kraakbeen met de micro ontleden schaar. Open op grote schaal de incisie met een pincet (Figuur 1H).
- Knijp uit de bulbus arteriosus, een witte structuur anterieur van het ventrikel (figuur 1 HI), en verwijder het hart van de holte door te trekken. Een geheel ontleed hart figuur 1J en Figuur 2A.
- Plaats maximaal 3 harten een microcentrifugebuis met 1 ml 2% formaline. Draai de buis een paar keer en houdt het gedurende de nacht bij 4 ° C.
4. Hart Montage
- Spoel het hart in PBS gedurende 5 minuten. Breng het hart in 10 ml 30% sucrose dat moet worden voorgekoeld bij 4 ° C, en meng voorzichtig. Het monster moet in eerste instantie drijven op het oppervlak van sucrose oplossing. Verder incubatie gedurende 1 uur en 20 minuten bij 4 ° C. NaDeze tijd zal de harten zinken naar de bodem van de buis.
- Bereid een doos met droogijs. Neem een verankering matrijs en giet een 5 mm dikke laag oktober montagemedium in de bodem van de matrijs.
- Met een pincet plaatst het hart in de OC T montage medium in de mal. Volgens de stereomicroscoop Pas de stand van het monster van de ventriculaire top van de bodem van de matrijs en de bulbus arteriosus bereiken naar boven.
- Zet de vormpjes met het monster op droog ijs. Wanneer de montage medium begint te vriezen, vul de rest van de mal met OCT medium en laat hem volledig te bevriezen. Bewaar de matrijs ten minste 1 uur bij -80 ° C vóór het snijden. De bevroren monster kan worden opgeslagen voor vele maanden bij -80 ° C.
5. Hearts Snijden
- Stel een cryostaat een snij grootte van 16 pm, een kamer temperatuur van -24 ° C en de temperatuur van het monster bij -22 ° C.
- Plaats de bevroren blok met demodel in de cryostaat en vast de oriëntatie te gaan knippen evenwijdig aan de bodem van het blok.
- Neem zes Superfrost-plus dia's per een blok en opnoemen ze van 1 tot 6. Start het snijden totdat het weefsel wordt bereikt, en trim het blok rond het monster met een scheermesje.
- Voor het verkrijgen van 6 herhalingen van een hart, het nemen van de eerste sectie op dia 1, het tweede deel op dia 2, het derde op dia 3, enz. Als je eenmaal geplaatst de zesde sectie op dia 6, start met glijbaan 1 en doorgaan tot het gehele orgel wordt gesneden. Verzamel twee rijen van rond de 8 secties op de dia (figuur 3).
- Laat de dia drogen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Bewaar ze voor maximaal 1 jaar in goed gesloten dozen bij -20 ° C.
6. Representatieve resultaten
Representatieve hartletsel na dit protocol wordt in ontleed hele hart op 4 dpci (dagen na cryoinjury, Figuur 2D-F). Om visualize het myocardium in vivo, gebruikten we transgene vis expressie EGFP en nucleaire DsRed2 onder besturing van cardiaal-specifieke cmlc-2 promotor 11,12. De afwezigheid van EGFP en DsRed2 fluorescerende signalen afgebakend een schijfvormige infarct langs de apicale-laterale ventriculaire wand.
Cellulaire en moleculaire analyse van het weefsel uit te voeren, de harten werden coupes vaste en een cryostaat. Een representatief dia met een reeks van opeenvolgende transversale hart delen is weergegeven in figuur 3.
De profielen kunnen geanalyseerd met verschillende methoden (figuur 4). Om de mate van hart regeneratie versus littekens te bepalen, voerden we histologische analyse met behulp van Acid fuchsine Oranje-G (AFOG) kleuring, die differentieel labelt hart-en fibrotische weefsels 9. De genexpressie analyses werden bereikt volgens de in situ hybridisatie procedure
Figuur 1. Veroorzaken van cryoinjury van de hartkamer in de volwassen zebravissen. (A) Een foto van de cryoprobe. (B) een volwassene zebravis geplaatst in de gleuf van de spons met ventrale omhoog. (CF) Borst incisie naar het hart te openen. (C) Een kleine snee door de huid en de spieren wordt gemaakt tussen de twee borstvinnen (rode lijn). (D) De schaar worden in de incisie de huid snijden na het rode pijl. (E) onder de huid, wordt de boete laag van zilveren hypodermis (omringd door blauwe stippellijn) opende zachtjes naar het hart te openen. (F) De incisie wordt verspreid met depincet en het kloppende ventrikel (groene pijl) is toegankelijk voor cryoinjury. (G) De koude cryoprobe wordt voorzichtig ingebracht in de borst naar het hart te raken. (HJ) Heart collectie. (H) Een diepe en lange incisie wordt gemaakt door de kieuwbogen van de borst tot aan de pericardiale holte te openen. Twee hart structuren zijn zichtbaar: bulbus arteriosus (witte pijl) en ventrikel (groene pijl). (I) De bulbus arteriosus is te houden met een pincet en trok uit de lichaamsholte. (J) De gehele hart uitgesneden uit het lichaam.
Figuur 2. Vertegenwoordiger controle en cryoinjured hart ontleed van volwassen transgene zebravis uiten EGFP en de nucleaire DsRed2 in cardiomyocyten. (AC) ongedeerd hart. (A) donkerveld-belichting wordt de ventrikel (V), bulbus arteriosus (Ba, wit) en de kleppen (Va), waarbij het atrium werd gekoppeld aan de kamer. (B en C) TL beelden t hij intact ventrikel-display EGFP en DsRed2 uitdrukking in cardiomyocyten. (DF) Hart op 4 dagen na cryoinjury (4 dpci) (D) De donkere veld verlichting toont een schijfvormige infarct (gele stippellijn). (EF) Cardiomyocyte markers EGFP en DsRed2 worden niet gedetecteerd in het infarct gebied, met vermelding van de beschadigde hartspier (omringd door stippellijn).
Figuur 3. Opdeling van het hart. (A) Hele hart met de tekening van transversale delen vanaf de bodem van het hart (1 en 2, rood) naar de top van het hart (3 en 4 in groen). (B) Fotografie van een dia van de reeks van opeenvolgende transversale secties gekleurd met AFOG (Acid fuchsine Oranje-G). De eerste delen (1 en 2, rode vierkanten) bevatten triculaire apex, en de laatste delen van het hart (3 en 4, groen vierkanten) omvatten bulbus arteriosus.
iles/ftp_upload/3666/3666fig4.jpg "/>
Figuur 4. Voorbeelden van analyse uitgevoerd op het hart en dit op 7 dagen na de cryoinjury. (A) AFOG (Acid fuchsine Oranje-G) kleuring labels gezonde spiercellen in oranje, het littekenweefsel van collageen in het blauw en fibrine in het rood. (B) In situ hybridisatie van ventriculaire myosine zware keten (vmhc) mRNA visualiseert de intacte myocard (blauwe vlekken). Het beschadigde weefsel verstoken is van de cardiale gen-transcriptie (rode stippellijn). (C) Immunoassaying van tropomyosine (groen) etiketten intact cardiomyocyten en niet beschadigd weefsel (omcirkeld met de gestippelde lijn). DAPI (blauw) vlekken de kernen van alle cellen. (D) Genetisch gelabeld cardiomyocyten express DsRed2 (rood) in hun kernen. DAPI (blauw) labelt alle kernen. Het infarct zone bevat geen DsRed2-positieve cellen (witte stippellijn).
Discussion
Cryoinjury wordt gedefinieerd als de gecontroleerde beschadiging van weefsel door de nauwkeurige toepassing van extreem lage 14. Direct thermische schok vernietigt de cellen door eiwitten vernietiging en door de intracellulaire vloeistof ijskristal formatie die het plasmamembraan breuken. Bijgevolg is de gewonde cellen sterven in het proces van apoptose en necrose 14. Beide celdood mechanismen aangetoond tot weefselverlies dragen na een hartinfarct 15. Zo cryoinjury is een geschikt model voor het induceren van een hartinfarct. Verschillende studies dit goed bewezen methode in verschillende zoogdieren, waaronder muizen, ratten, konijnen en varkens 6,7. De aanpassing van de cryoinjury protocol in de zebravis kan een meer vergelijkende discussie over het infarct reactie tussen verschillende soorten.
Twee andere groepen onafhankelijk van elkaar ontwikkeld cryoinjury procedure voor de volwassen zebravissen hart. De belangrijkste verschillen zijn de surGery methoden, het type gereedschap en toegepast vriestijd. In de studie van González-Rosa et al.., Werd het hartzakje geopend door het scheuren van het weefsel in plaats van te snijden. Ze gebruikten 0,3 mm koperen draad verbonden met een polyamide buis vooraf gekoeld in vloeibare stikstof om het hart voor enkele seconden bevriezen totdat het ontdooien kan 10 worden waargenomen. In de studie door Schnabel et al.. Een conische stuk droogijs van 20 mm lengte met de punt van 2 mm in de diameter werd gebruikt om de kern raken 10 seconden 8. De twee groepen kregen, ventriculaire schade door dood van het myocard. Het voordeel van onze methode is een meer reproduceerbaar afzetting van collageen-rijke litteken, die beter nabootst het begin van de infarct healing responses waargenomen bij zoogdieren systemen.
De kritische stap tijdens de cryoinjury procedure in de zebravis is het maken van een incisie door de huid en de hartzak zonder aanprikken van de onderliggende hart. Een correct de presenced operatie zorgt ervoor dat kleine bloedingen. Hevige bloedingen geeft een onbedoelde punctie van het ventrikel met de schaar. In dergelijke gevallen moet de dieren worden teruggetrokken uit het experiment. Om te beschadigen het hart, moet de punt van de schaar gericht onder een kleine hoek met de huid.
Een ander belangrijk aspect voor het maken van een reproduceerbare schade is de exacte positie van de koude cryoprobe de ventrikel voor optimale exacte duur. Te kort invriezen tijd zal resulteren in een ontsteking met weinig celdood. Langdurige bevriezing, anderzijds, kan grote beschadigingen van het hart, hetgeen kan leiden tot een verhoogde mortaliteit van de dieren. We hebben vastgesteld dat de optimale tijd om de ventrikel houden in bevroren toestand varieert 23-26 seconden voor een 2 cm lang volwassenen zebravis en kan afhankelijke verschillen van de grootte van de dieren.
Omdat onze protocol zeer eenvoudig en snel zijn er geen experimentele limieteidingen te onderwerpen voldoende aantal dieren voldoende biologische replicatie te verkrijgen. De cryochirurgie behandeling zeer goed verdragen wordt door de dieren. Collection van het hart op verschillende tijdstippen na cryoinjury kan gedetailleerde karakterisering van de volgende fasen tijdens het regeneratieproces. De experimentele analyse van de cryoinjured harten kunnen bestaan uit 1) visualisatie van gentranscriptie door in situ hybridisatie, 2) detectie van eiwit distributie door immunofluorescentie kleuring, 3) histologische beeldvorming van verschillende structuren. Het begrijpen van de belangrijkste genezingsproces na een myocardinfarct in de zebravis zal invloed hebben op het gebied van regeneratieve biologie. Bovendien kan het nuttig zijn voor het ontwerpen van nieuwe therapeutische benaderingen in de regeneratieve geneeskunde.
Disclosures
Experimenteel onderzoek op dieren is goedgekeurd door de kantonrechter Veterinair Bureau van Fribourg.
Acknowledgments
Wij danken V. Zimmermann voor een uitstekende technische bijstand en voor vissen zorg. Dit werk werd ondersteund door de Zwitserse National Science Foundation, licentienummer: 310000_120611.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5602 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Formaldehyde ~36% | Sigma-Aldrich | 47630 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Slides Superfrost Plus | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds - Truncated Molds T8 | Polysciences, Inc. | 18985 |
References
- Laflamme, M. A., Murry, C. E.
- Singh, B. N., Koyano-Nakagawa, N., Garry, J. P., Weaver, C. V. Heart of newt: a recipe for regeneration. J. Cardiovasc. Transl. Res. 3, 397-409 (2010).
- Poss, K. D. Getting to the heart of regeneration in zebrafish. Semin. Cell Dev. Biol. 18, 36-45 (2007).
- Ausoni, S., Sartore, S. From fish to amphibians to mammals: in search of novel strategies to optimize cardiac regeneration. J. Cell Biol. 184, 357-364 (2009).
- Borchardt, T., Braun, T. Cardiovascular regeneration in non-mammalian model systems: what are the differences between newts and man. Thrombosis and haemostasis. 98, 311-318 (2007).
- Bos, E. J. vanden, Mees, B. M., de Waard, M. C., de Crom, R., Duncker, D. J. A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: a comparison with coronary artery ligation. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 289, H1291-H1300 (2005).
- van Amerongen, M. J., Harmsen, M. C., Petersen, A. H., Popa, E. R., van Luyn, M. J. Cryoinjury: a model of myocardial regeneration. Cardiovasc. Pathol. 17, 23-31 (2008).
- Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS ONE. 6, (2011).
- Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jazwinska, A. The zebrafish heart regenerates after cryoinjury-induced myocardial infarction. BMC Dev. Biol. 11, 21 (2011).
- González-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138, 1663-1674 (2011).
- Rottbauer, W. Reptin and pontin antagonistically regulate heart growth in zebrafish embryos. Cell. 111, 661-672 (2002).
- Burns, C. G. High-throughput assay for small molecules that modulate zebrafish embryonic heart rate. Nature chemical biology. 1, 263-264 (2005).
- Chablais, F., Jazwinska, A. IGF signaling between blastema and wound epidermis is required for fin regeneration. Development. 137, 871-879 (2010).
- Baust, J. G., Gage, A. A.
- Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance. Annual review of physiology. 72, 19-44 (2010).
