Summary
Zebrafish रीढ़ में दिल के उत्थान के तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है. यहाँ, हम वयस्क cryoinjury का उपयोग zebrafish में एक दिल रोधगलितांश के शामिल होने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. Ventricular दीवार के 20% के भीतर यह विधि भारी कोशिका मृत्यु में परिणाम, स्तनधारी दौरे में मनाया है कि समान.
Protocol
1. उपकरण सेट अप
- मुख्य cryoinjury प्रदर्शन उपकरण का इस्तेमाल किसी ऊतक को ठण्डा करने के लिए प्रयोग में आने वाला यंत्र, कलम की तरह साधन है कि स्टेनलेस स्टील (चित्रा 1 ए) किया जाता है है. बेलनाकार हैंडल 40 मिमी और 8 मिमी की एक व्यास है. अपप्लिकेर की टिप 6 मिमी और 0.8 मिमी व्यास है. टिप और संभाल के बीच जंक्शन 4 लंबे समय मिमी शंक्वाकार है. इसके अलावा, किसी ऊतक को ठण्डा करने के लिए प्रयोग में आने वाला यंत्र की संभाल एक प्लास्टिक ट्यूब और टेप करने के लिए उंगलियों के शीतदंश से बचने जबकि प्रक्रिया के दौरान पकड़े उपकरण के साथ अलग किया जाना चाहिए.
- Cryosurgery के लिए की जरूरत है अन्य सामग्री है कि एक stereomicroscope, तेज संदंश, सूक्ष्म विदारक वसंत कैंची और एक प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक हैं. इसके अलावा मछली और मछली स्थानांतरित करने के लिए एक प्लास्टिक के चम्मच anesthetizing के लिए एक बीकर तैयार के.
- शल्य चिकित्सा के दौरान, अपने उदर पक्ष अप (चित्रा 1 बी) के साथ एक नम स्पंज मछली पर रखा जाता है. एक स्थिर प्रक्रिया में पशु पकड़, एकउचित नाली मैन्युअल रूप से स्पंज में कटौती की जानी चाहिए.
- सर्जरी के बाद मछली हस्तांतरण प्रणाली पानी के साथ एक टैंक तैयार.
- एक 10 2 और फिर स्वचालित रूप से एक 24 सेकंड उलटी गिनती उलटी गिनती के साथ एक डबल टाइमर सेट.
2. Cryoinjury प्रक्रिया
- नीचे कम से कम 3 मिनट के लिए तरल नाइट्रोजन के 3-5 सेमी में नोक डुबो कर किसी ऊतक को ठण्डा करने के लिए प्रयोग में आने वाला यंत्र बढ़िया.
- यह 0.02% tricaine में immerging जब तक मछली को अपनी पीठ पर मुड़ता है और अपने गहरे नाले लगभग (लगभग 90 सेकंड) बंद करके एक वयस्क zebrafish चतनाशून्य करना.
- एक नम स्पंज है कि एक मछली पकड़ उल्टा (चित्रा 1 बी) की कटौती की गई है एक प्लास्टिक के चम्मच के साथ मछली का स्थानांतरण. गैर प्रमुख हाथ का उपयोग संदंश के साथ स्थिर मछली पकड़ो. दिखने में दिल के पीछे औसत दर्जे का मार्जिन का पता लगाने और त्वचा पंचर के सीधे iridectomy कैंची का उपयोग. (चित्र 1C).
- घन से दिल के ऊपर एक छोटा सा चीरा (लगभग 2 मिमी)त्वचा, मांसपेशियों (चित्रा -1) के माध्यम से सीधे पूर्व से tting. बोनी गिल तंत्र के माध्यम से कटौती, के रूप में इस जानवर को मार देंगे.
- धीरे कैंची की नोक के साथ hypodermis की चांदी उपकला परत (चित्रा 1E) आंसू पिटाई निलय के लिए सीधी पहुँच है. शरीर गुहा में सम्मिलित नहीं गहरा कैंची इस वसीयत पंचर दिल के रूप में. दिल की धड़कन अच्छी तरह दिखाई होना चाहिए, और कोई व्यापक खून बह रहा है (चित्रा 1F) thoracotomy के दौरान हो जाना चाहिए.
- क्रमादेशित घड़ी है कि 10 सेकंड के लिए 24 सेकंड के बाद निर्धारित किया गया है शुरू करो. 10 सेकंड के दौरान तरल नाइट्रोजन से बाहर किसी ऊतक को ठण्डा करने के लिए प्रयोग में आने वाला यंत्र ले. सुनिश्चित करें कि यह धीरे झटकों से कोई किसी ऊतक को ठण्डा करने के लिए प्रयोग में आने वाला यंत्र पर अधिक नाइट्रोजन है. चीरा laterally संदंश का उपयोग करने के लिए छाती (चित्र 1F) खोलने फैलाओ.
- घड़ी के छल्ले के 10 सेकंड के एक बार, तुरंत लेकिन धीरे जनसंपर्क के टिप के साथ निलय को छूनेई - कूल्ड किसी ऊतक को ठण्डा करने के लिए प्रयोग में आने वाला यंत्र (चित्रा 1G).
- घड़ी के छल्ले के 24 सेकंड के एक बार, प्रणाली पानी के 2-3 एमएल डालना छाती पर एक प्लास्टिक विंदुक का उपयोग करने के लिए ऊतक से किसी ऊतक को ठण्डा करने के लिए प्रयोग में आने वाला यंत्र जारी, और प्रणाली पानी के साथ टैंक में मछली हस्तांतरण.
- मछली साँस लेने में कुछ सेकंड के बाद पुनरारंभ करते हैं, और चाहिए तो यह तैराकी फिर से शुरू करना चाहिए. यदि यह लगभग 45 सेकंड के बाद साँस नहीं ले करता है, गहरे नाले में पानी के एक प्लास्टिक विंदुक के साथ जब तक यह से ही सांस लेने शुरू होता है स्क्वरटिंग द्वारा पशु को प्रोत्साहित. हमारे अनुभव में, मछली का 95% सर्जरी जीवित है, और सभी मौतों सर्जरी के दिन पर होते हैं. यह के चीरों सीवन आवश्यक नहीं होगा.
3. दिल संग्रह और फिक्सेशन
- दिल, दो संदंश, सूक्ष्म विदारक कैंची और नम रखा स्पंज तय करने के लिए एक microcentrifuge ट्यूब में 2% की 1 एमएल formalin तैयार.
- चयनित दिन में cryoinjury के बाद, 5 मिनट के लिए 0.1% tricaine में मछली euthanize.
- प्लेसएक नम, slotted स्पंज में उदर पक्ष मछली. सूक्ष्म विदारक कैंची के साथ ब्रान्चियल उपास्थि के माध्यम से दिल के ऊपर एक बड़ा चीरा (लगभग 4 मिमी). संदंश (1h के चित्रा) के साथ व्यापक रूप से चीरा खोलें.
- बंद धमनी कन्द, एक सफेद वेंट्रिकल (चित्रा 1 HI) पूर्वकाल संरचना चुटकी, और गुहा से इसे खींच कर दिल को दूर. एक पूरे दिल विच्छेदित चित्रा 1J और चित्रा 2A में दिखाया गया है.
- 3 दिलों को 2% formalin के 1 मिलीग्राम के साथ एक microcentrifuge ट्यूब में रखें. धीरे ट्यूब कई बार बारी है और 4 पर यह रातोरात रखने डिग्री सेल्सियस
4. दिल बढ़ते
- , पीबीएस में 5 मिनट के लिए दिल कुल्ला. 10 एमएल में 30% sucrose किया जाना चाहिए कि 4 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व ठंडा दिल स्थानांतरण, और धीरे मिश्रण. नमूना शुरू में sucrose के समाधान की सतह पर तैरने लगते हैं चाहिए. 1 घंटे 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन जारी रखें के बादइस समय, दिल ट्यूब के नीचे डूब जाएगी.
- सूखी बर्फ के साथ एक बॉक्स तैयार है. एक एम्बेडिंग ढालना ले लो, और एक 5 अक्तूबर बढ़ते मध्यम आचारण के नीचे मिमी परत डालना.
- संदंश मैडोना मोल्ड में मध्यम बढ़ते टी में दिल की जगह. Stereomicroscope के तहत, शीर्ष की ओर मोल्ड के तल पर निलय सुप्रीम, और धमनी कन्द को प्राप्त करने के लिए नमूना के उन्मुखीकरण को समायोजित.
- शुष्क बर्फ पर नमूना के साथ molds रखें. बढ़ते मध्यम स्थिर करने के लिए शुरू होता है, अक्टूबर मध्यम के साथ मोल्ड के बाकी को भरने और इसे पूरी तरह से स्थिर है. प्रोटोकॉल से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए -80 ° सी में मोल्ड रखें. -80 में कई महीनों के लिए जमे हुए नमूना संग्रहीत किया जा सकता डिग्री सेल्सियस
5. सेक्शनिंग दिल
- 16 माइक्रोन का एक काटने आकार के साथ, -24 ° सेल्सियस के एक कक्ष तापमान -22 डिग्री सेल्सियस पर नमूना का तापमान एक cryostat सेट के
- साथ जमे हुए ब्लॉक प्लेसcryostat में नमूना और इसकी उन्मुखीकरण तय करने के लिए ब्लॉक के नीचे करने के लिए समानांतर काटने शुरू.
- एक ब्लॉक प्रति छह Superfrost से अधिक स्लाइड तैयार है और उन्हें 1 से 6 तक गिनना. काटने जब तक ऊतक तक पहुँच जाता है, और एक razorblade साथ नमूना चारों ओर ब्लॉक ट्रिम.
- से 6 प्राप्त करने के लिए एक दिल की प्रतिकृति, 1 स्लाइड पर प्रथम खंड, 2 स्लाइड पर दूसरे खंड, 3 स्लाइड पर तीसरे, आदि एक बार जब आप स्लाइड पर 6 छठे खंड रखा, 1 स्लाइड के साथ पुनः आरंभ और जब तक जारी रखने के पूरे अंग काट रहा है. स्लाइड पर लगभग 8 वर्गों के दो पंक्तियों (चित्रा 3) ले लीजिए.
- कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए स्लाइड शुष्क करते हैं. उन्हें 1 वर्ष तक के लिए -20 ° सी. पर कसकर बंद बक्से में स्टोर
6. प्रतिनिधि परिणाम
प्रतिनिधि इस प्रोटोकॉल के बाद हृदय की चोट विच्छेदित पूरे दिल में 4 dpci में दिखाया गया है (दिन पोस्ट cryoinjury के; चित्र 2 डी एफ). वी करने के लिएvivo में दौरे ऊतक isualize के, हम ट्रांसजेनिक मछली का इस्तेमाल हृदय विशिष्ट cmlc 2 11,12 प्रमोटर के नियंत्रण के तहत व्यक्त EGFP और परमाणु DsRed2 है. EGFP और DsRed2 फ्लोरोसेंट संकेत के अभाव निलय शिखर पार्श्व दीवार के साथ एक डिस्क के आकार का रोधगलितांश क्षेत्र सीमांकन.
ऊतक के सेलुलर और आणविक विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए, दिल निश्चित है और एक cryostat साथ में sectioned थे. आड़ा दिल वर्गों की एक श्रृंखला के साथ लगातार एक प्रतिनिधि स्लाइड चित्रा 3 में दिखाया जाता है.
वर्गों के विभिन्न तरीकों (चित्रा 4) के साथ विश्लेषण किया जा सकता है. Scarring के बनाम दिल उत्थान की सीमा निर्धारित करने के लिए, हम ऊतकीय एसिड ऑरेंज जी Fuchsin (AFOG) धुंधला हो जाना है, जो विभिन्न हृदय और fibrotic ऊतकों 9 लेबल का उपयोग करते हुए विश्लेषण किया. जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के अनुसार स्वस्थानी संकरण प्रक्रिया में प्राप्त किया गया
चित्रा 1 वयस्क zebrafish में वेंट्रिकल की cryoinjury उत्प्रेरण. (ए) किसी ऊतक को ठण्डा करने के लिए प्रयोग में आने वाला यंत्र की एक तस्वीर. (बी) एक वयस्क zebrafish स्पंज के भट्ठा में अपने उदर पक्ष के साथ रखा गया है. (CF) के सीने में दिल का उपयोग चीरा. (सी) त्वचा और मांसपेशियों के माध्यम से एक छोटी सी काट दो छाती पर का कवच पंख (लाल रेखा) के बीच किया जाता है. (डी) कैंची चीरा में डाला जाता है लाल तीर के बाद त्वचा में कटौती. (ई) त्वचा के नीचे, ठीक चांदी hypodermis परत नीले धराशायी लाइन ने घेर लिया धीरे दिल का उपयोग करने के लिए खोला जाता है. (एफ) चीरा के साथ फैल रहा हैसंदंश और पिटाई वेंट्रिकल (हरा तीर) cryoinjury के लिए सुलभ है. (G) ठंड किसी ऊतक को ठण्डा करने के लिए प्रयोग में आने वाला यंत्र धीरे सीने में दिल को छू डाला जाता है. (HJ) हार्ट संग्रह. (एच) एक गहरी और लंबी चीरा सीने की गिल मेहराब के माध्यम से किया जाता है लिए pericardial गुहा का उपयोग. दो दिल संरचनाओं दिखाई दे रहे हैं: बल्बस धमनी (सफेद तीर) और निलय (हरा तीर). (मैं) धमनी कन्द संदंश के साथ पकड़ लिया जाता है और शरीर गुहा से बाहर खींच लिया. (जे) शरीर का पूरे दिल से excised है.
चित्रा 2 प्रतिनिधि नियंत्रण और cryoinjured वयस्क ट्रांसजेनिक, EGFP और cardiomyocytes में परमाणु DsRed2 व्यक्त zebrafish से विच्छेदित दिल. (एसी) दिल रिहाई का. (ए) अंधेरे क्षेत्र रोशनी निलय से पता चलता है (वी), कन्द धमनी (बा, सफेद) और वाल्व (VA), जहां atrium के वेंट्रिकल से जुड़ा हुआ था. (ख और ग) टी के प्रतिदीप्त छवियों वह बरकरार वेंट्रिकल प्रदर्शन EGFP और cardiomyocytes में DsRed2 अभिव्यक्ति. 4 दिनों के बाद cryoinjury पर (लोमो) हार्ट (4 dpci) (डी) अंधेरे क्षेत्र रोशनी रोधगलितांश है डिस्क के आकार का (पीले धराशायी लाइन) से पता चलता है. (एफई) cardiomyocyte मार्करों EGFP और DsRed2 रोधगलितांश क्षेत्र में पता नहीं कर रहे हैं, क्षतिग्रस्त मायोकार्डियम (धराशायी लाइन ने घेर लिया) का संकेत है.
चित्रा 3 दिल की सेक्शनिंग. (एक) आड़ा दिल दिल की ऊपर की ओर (1 और 2, लाल रंग में) (3 और हरे रंग में 4) के नीचे से शुरू वर्गों में से एक ड्राइंग के साथ पूरे दिल. (ख) लगातार आड़ा AFOG (एसिड Fuchsin ऑरेंज जी) के साथ दाग वर्गों की श्रृंखला के साथ एक स्लाइड की फोटोग्राफ़ी. 1 वर्गों (1 और 2, लाल वर्गों) निलय सुप्रीम होते हैं, और दिल (3 और 4, हरे वर्गों) के अंतिम वर्गों धमनी कन्द शामिल हैं.
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चित्रा 4 उदाहरण के विश्लेषण के 7 दिनों के बाद cryoinjury पर दिल वर्गों पर प्रदर्शन किया. (ए) AFOG (एसिड Fuchsin ऑरेंज जी) नारंगी में धुंधला लेबल स्वस्थ मांसपेशी कोशिकाओं, नीले और लाल रंग में आतंच में कोलेजन युक्त निशान ऊतक. (बी) निलय मायोसिन भारी श्रृंखला (vmhc) स्वस्थानी संकरण में mRNA के बरकरार मायोकार्डियम (नीला धुंधला) visualizes. घायल ऊतक हृदय जीन प्रतिलिपि (लाल डैश्ड लाइन) से रहित है. (सी) (हरा) Tropomyosin की Immunoassaying बरकरार cardiomyocytes और क्षतिग्रस्त ऊतकों धराशायी लाइन के साथ घेर लिया लेबल. DAPI (नीला) सभी कोशिकाओं के नाभिक दाग. (डी) उनके नाभिक में आनुवंशिक रूप से लेबल cardiomyocytes व्यक्त DsRed2 (लाल). DAPI (नीला) सभी नाभिक लेबल. रोधगलितांश क्षेत्र DsRed2 पॉजिटिव कोशिकाओं (सफेद धराशायी लाइन) को शामिल नहीं करता है.
Discussion
Cryoinjury ऊतक नियंत्रित नुकसान के रूप में अत्यधिक ठंड 14 की सटीक आवेदन के द्वारा परिभाषित किया गया है. प्रत्यक्ष थर्मल आघात प्रोटीन और intracellular द्रव बर्फ क्रिस्टल के गठन है कि प्लाज्मा झिल्ली ruptures द्वारा विनाश की कोशिकाओं को नष्ट कर देता है. नतीजतन, घायल कोशिकाओं में apoptosis और 14 परिगलन की प्रक्रिया में मर जाते हैं. इन सेल मौत तंत्र के दोनों myocardial infarction के बाद 15 ऊतकों को नुकसान के लिए योगदान करने के लिए दिखाया गया है. इस प्रकार, cryoinjury एक दिल रोधगलितांश उत्प्रेरण के लिए एक उपयुक्त मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है. कई अध्ययनों से चूहे, चूहे, खरगोश, और 6,7 सूअर सहित विभिन्न स्तनधारियों में, इस विधि अच्छी तरह से साबित कर दिया की सूचना दी. अनुकूलन zebrafish में cryoinjury प्रोटोकॉल की विभिन्न प्रजातियों के बीच रोधगलितांश प्रतिक्रिया पर एक तुलनात्मक चर्चा सक्षम बनाता है.
दो अन्य समूहों को स्वतंत्र रूप से वयस्क zebrafish दिल के लिए cryoinjury प्रक्रिया विकसित की है. प्रमुख मतभेद हैं सुरgery विधियों, उपकरणों के प्रकार और ठंड समय लागू है. गोंजालेज - रोजा एट अल. द्वारा अध्ययन में, पेरीकार्डियम ऊतक फाड़ काटने के बजाय द्वारा खोला गया था. वे 0.3 मिमी तांबे एक polyamid ट्यूब से जुड़े पूर्व विगलन 10 देखा जा सकता है जब तक कुछ सेकंड के लिए दिल को स्थिर तरल नाइट्रोजन में ठंडा फिलामेंट का इस्तेमाल किया. Schnabel एट अल., इसका व्यास में 2 मिमी की उठाई टिप के साथ एक 20 मिमी लंबाई की सूखी बर्फ की शंक्वाकार टुकड़ा द्वारा अध्ययन में 10 8 सेकंड के लिए दिल को छूने के लिए इस्तेमाल किया गया था. दो समूहों वेंट्रिकुलर क्षति मायोकार्डियम की मौत के माध्यम से प्राप्त की. हमारे विधि का लाभ कोलेजन अमीर निशान है, जो बेहतर जल्दी रोधगलितांश चिकित्सा के स्तनधारी प्रणालियों में मनाया प्रतिक्रियाएं mimics के अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य बयान है.
के दौरान महत्वपूर्ण कदम zebrafish में cryoinjury प्रक्रिया अंतर्निहित दिल puncturing के बिना त्वचा और pericardial थैली के माध्यम से एक चीरा है. एक सही ढंग से performeघ सर्जरी थोड़ा रक्तस्राव का कारण बनता है. विपुल खून बह रहा कैंची से वेंट्रिकल की एक unintentional पंचर इंगित करता है. ऐसे मामलों में, जानवरों के प्रयोग से मुकर जाना चाहिए. दिल puncturing क्रम में से बचने के लिए, कैंची की बात त्वचा के लिए एक उथले कोण करने के उद्देश्य से किया जाना चाहिए.
एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य चोट बनाने के लिए एक अन्य महत्वपूर्ण पहलू इष्टतम सटीक अवधि के लिए निलय पर ठंड किसी ऊतक को ठण्डा करने के लिए प्रयोग में आने वाला यंत्र की सटीक स्थिति है. बहुत कम ठंड समय थोड़ा कोशिका मृत्यु के साथ सूजन में परिणाम देगा. लंबे समय तक ठंड, दूसरे हाथ पर, दिल की व्यापक क्षति, जो पशुओं का बढ़ाया मृत्यु दर को जन्म दे सकती हो सकती है. हम निर्धारित किया है कि इष्टतम समय 23-26 सेकंड के बीच जमे हुए राज्य पर्वतमाला में एक 2 सेमी लंबे समय तक वयस्क zebrafish के लिए निलय पकड़ करने के लिए, और यह dependently पशुओं के आकार पर भिन्न हो सकती है.
क्योंकि हमारे प्रोटोकॉल बहुत सरल और तेजी से है, वहाँ कोई प्रयोगात्मक सीमापशुओं की पर्याप्त संख्या को subjecting करने के लिए पर्याप्त जैविक अनुकरण प्राप्त करने में ations. cryosurgical उपचार बहुत अच्छी तरह से पशुओं द्वारा सहन किया है. Cryoinjury के बाद अलग अलग समय बिंदुओं पर दिल का संग्रह पुनर्योजी प्रक्रिया के दौरान बाद के चरणों की विस्तृत लक्षण वर्णन अनुमति देता है. प्रयोगात्मक विश्लेषण cryoinjured दिल की 1 शामिल हैं) जीन प्रतिलेखन के द्वारा स्वस्थानी संकरण में, दृश्य 2) प्रोटीन वितरण की immunofluorescent धुंधला, 3 द्वारा पहचान) विभिन्न संरचनाओं के histological इमेजिंग हो सकता है. Zebrafish में रोधगलन के बाद प्रमुख चिकित्सा प्रक्रियाओं को समझना पुनर्योजी जीव विज्ञान के क्षेत्र असर होगा. इसके अलावा, यह पुनर्योजी चिकित्सा में उपन्यास चिकित्सात्मक दृष्टिकोण को डिजाइन करने के लिए फायदेमंद हो सकता है.
Disclosures
पशुओं पर प्रायोगिक अनुसंधान Fribourg के केंटन पशु चिकित्सा कार्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया है.
Acknowledgments
हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए और मछली की देखभाल के लिए वी. ज़िम्मरमैन धन्यवाद. 310000_120611: यह काम स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन अनुदान संख्या के द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micro dissecting spring scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5602 | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Formaldehyde ~36% | Sigma-Aldrich | 47630 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84100 | |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Slides Superfrost Plus | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds - Truncated Molds T8 | Polysciences, Inc. | 18985 |
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