Induksjon av hjerteinfarkt hos Adult sebrafisk Bruke Cryoinjury

Summary

Sebrafisk representerer en verdifull modell for å studere mekanismer for hjerte regenerering i virveldyr. Her presenterer vi en protokoll for induksjon av en hjerte infarkt i voksen sebrafisk hjelp cryoinjury. Denne metoden gir massiv celledød innenfor 20% av den ventrikulære veggen, tilsvarende den som ble observert i pattedyr infarkter.

Abstract

Hos pattedyr hjerte er i stand til betydelig regenerasjon etter en akutt skade, for eksempel hjerteinfarkt ^en. I motsetning urodele amfibier og teleost fisk beholde en bemerkelsesverdig evne til kardial regenerering med liten eller ingen arr resten av livet ^2,3. Det er ikke kjent hvorfor bare enkelte ikke-pattedyr virveldyr kan gjenskape en fullstendig orgel fra levning vev ^4,5. For å forstå de molekylære og cellulære forskjeller mellom regenerativ respons hos ulike arter, må vi bruke tilsvarende metoder for å framkalle akutte skader.

I pattedyr, har den mest brukte modellen til å studere hjertets reparasjon vært akutt iskemi etter en ligation av koronar arterie eller vev ødeleggelse etter cryoinjury ^6,7. Den kardiale regenerering i salamander og sebrafisk er hovedsakelig studert etter en delvis reseksjon av ventrikulær Apex ^2,3. Nylig flere grupper har etablsvekket den cryoinjury teknikken hos voksne sebrafisk ^8-10. Denne metoden har et stort potensial fordi det gir en sammenlignende drøfting av resultatene oppnådd fra pattedyr og ikke-pattedyrarter.

Her presenterer vi en metode for å indusere en reproduserbar plate-formet infarktet av sebrafisk ventrikkel ved cryoinjury. Denne skaden Modellen er basert på hurtig frysing-tining vev, noe som resulterer i massive celledød på ca 20% av cardiomyocytes av ventrikulære veggen. Først ble et lite innsnitt gjort gjennom brystet med iridectomy saks for å få tilgang til hjertet. Den ventrikulære veggen var direkte frosset ved å søke om 23-25 ​​sekunder i rustfritt stål cryoprobe precooled i flytende nitrogen. For å stoppe frysing av hjertet, fisken vann ved romtemperatur ble droppet på tuppen av cryoprobe. Prosedyren er godt tolerert av dyr, med en overlevelsesrate på 95%.

For å karakterisere den regenerative prosessen, var hjertersamles og festes på forskjellige dager etter cryoinjury. Deretter ble prøven innebygde for cryosectioning. Lysbildene med seksjoner ble behandlet for histologisk analyse, in situ hybridisering og immunfluorescens. Denne forpliktelsen øker vår forståelse av hvilke faktorer som er nødvendige for den regenerative plastisitet i sebrafisk, og gi ny innsikt i maskineriet av hjerte regenerasjon. En konseptuell og molekylær forståelse av hjerte regenerering i sebrafisk vil påvirke både utviklingsbiologi og regenerativ medisin.

Protocol

1. Utstyr Set-up

1. Det viktigste verktøyet brukes til å utføre cryoinjury er cryoprobe, pennen-lignende instrument som er laget av rustfritt stål (figur 1A). Den sylindriske håndtaket er 40 mm lang og har en diameter på 8 mm. Spissen av applikatoren er 6 mm lang og 0,8 mm diameter. Krysset mellom spissen og håndtaket er konisk 4 mm lange. I tillegg bør håndtaket på cryoprobe isoleres med et plastrør og tape for å unngå frostskader på fingrene mens du holder verktøyet under prosedyren.
2. Andre materialer som trengs for cryosurgery er en stereomikroskop, skarpe tang, mikro dissekere våren saks og en plast overføringspipetten. I tillegg forberede et beger for bedøvelse fisken og en plast skje for overføring fisken.
3. Under operasjonen, blir fisken plasseres på en fuktig svamp med ventral siden opp (Figur 1B). Å holde dyret i en stabil prosedyre, enhensiktsmessig groove bør manuelt kuttet i svampen.
4. Forbered en tank med system vann skal overføre fisken etter operasjonen.
5. Sett opp en dobbel timer først med en 10 sekunders nedtelling og deretter automatisk en 24 sekunders nedtelling.

2. Den Cryoinjury Prosedyre

1. Kjøl ned cryoprobe ved å dyppe spissen i 3-5 cm av flytende nitrogen i minst 3 min.
2. Anesthetize en voksen sebrafisk ved immerging den i 0,02% Tricaine til fisken slår seg på ryggen og gjellene nesten stoppe flytting (ca 90 sekunder).
3. Overfør fisken med en plast skje til en fuktig svamp som har blitt kuttet for å holde en fisk opp ned (Figur 1B). Hold fisken fast med tang med ikke-dominant hånd. Visuelt finne bakre mediale margin på hjertet og bruker rette iridectomy saks å punktere huden. (Figur 1C).
4. Lag en liten (ca. 2 mm) snitt over hjertet ved cutting rett anteriorly gjennom huden, musklene (figur 1D). Ikke skjære gjennom benete branchial apparatet, da dette vil drepe dyret.
5. Forsiktig rive den sølvskimrende epithelial laget av hypodermis (figur 1E) med tuppen av saksen til å ha en direkte tilgang til det bankende ventrikkel. Ikke sett saksen dypere i kroppens hulrom, da dette vil punktere hjertet. Det bankende hjerte skal være godt synlig, og ingen omfattende blødninger skulle oppstå under torakotomi (figur 1F).
6. Start programmert tidsinnstilling som er satt i 10 sekunder, etterfulgt av 24 sekunder. Under 10 sekunder tar ut cryoprobe fra flytende nitrogen. Kontroller at det ikke er mer nitrogen på cryoprobe ved å riste forsiktig. Spre snittet sidelengs ved hjelp av pinsett for å åpne brystet (figur 1F).
7. Når tidsuret ringer 10 sekunder, ta umiddelbart, men forsiktig ventrikkelen med tuppen av pre-avkjølte cryoprobe (figur 1G).
8. Når tidsuret ringer 24 sekunder, hell 2-3 ml av systemet vann ved hjelp av en dråpeteller i plast på brystet for å frigjøre cryoprobe fra vev, og overføre fisken inn i tanken med systemet vann.
9. Fisken skal starte å puste etter noen sekunder, og da bør gjenopptas svømming. Hvis den ikke puste etter rundt 45 sekunder, stimulere dyret ved sprut vann inn i gjellene med en dråpeteller i plast før det begynner å puste av seg selv. I vår erfaring, 95% av fisken overlever operasjonen, og alle dødsfallene skjer på operasjonsdagen. Det vil ikke være nødvendig å sy snitt.

3. Hjerte Innsamling og fiksering

1. Forbered 1 mL 2% formalin i en mikrosentrifuge tube for å feste hjerte, to tang, mikro-dissekere saks og fuktig slotted svamp.
2. På valgte dagen etter cryoinjury, avlive fisken i 0,1% Tricaine i 5 minutter.
3. Plasserfisk ventrale siden opp i en fuktig, slotted svamp. Lag en stor (ca. 4 mm) snitt over hjertet gjennom branchial brusken med mikro dissekere saks. Åpne vidt snittet med pinsett (figur 1H).
4. Knip av bulbus arteriosus, en hvit struktur anterior til ventrikkelen (figur 1 HI), og fjern hjerte fra hulrommet ved å trekke den. En hel dissekert hjerte er vist i Figur 1J og Figur 2a.
5. Plasser opp til 3 hjerter til en mikrosentrifuge rør med 1 ml 2% formalin. Forsiktig snu røret flere ganger og holde den over natten ved 4 ° C.

4. Hjerte Montering

1. Skyll hjertene i PBS i 5 minutter. Overfør hjertene til 10 ml 30% sukrose som bør være pre-avkjølt ved 4 ° C, og bland forsiktig. Prøven bør i utgangspunktet flyter på overflaten av sukroseløsning. Fortsett inkubering i 1 time og 20 minutter ved 4 ° C. Etterdenne gangen, vil hjertene synke til bunnen av røret.
2. Forbered en boks med tørris. Ta en embedding mugg, og hell en 5 mm lag av oktober montering medium nederst formen.
3. Med tang plassere hjertet inn i OC T montering medium i formen. Under stereomikroskop, justere retningen av prøven for å oppnå den ventrikulære apex på bunnen av formen, og bulbus arteriosus mot toppen.
4. Plasser formene med prøven på tørris. Når montering medium begynner å fryse, fylle opp resten av formen med oktober medium og la det fryse helt. Hold formen i minst 1 time ved -80 ° C før snitting. Den frosne prøven kan oppbevares i mange måneder ved -80 ° C.

5. Hearts utsnitt

1. Sett opp en cryostat med en skjærende størrelse 16 mikrometer, en kammer temperatur på -24 ° C og temperaturen i prøven ved -22 ° C.
2. Plasser den frosne blokk medprøven i cryostat og fikse orientering å begynne å skjære parallell til bunnen av blokken.
3. Forbered seks Superfrost-pluss lysbilder per én blokk og numerate dem 1-6. Begynn å kutte inntil vevet er nådd, og trimme blokken rundt prøven med en barberblad.
4. For å få seks replikater av ett hjerte, ta opp den første delen lysbilde 1, den andre delen på lysbildet to, den tredje på lysbildet 3, osv. Når du har plassert den sjette avsnittet om lysbilde 6, starter med lysbilde 1 og fortsette til hele organet er kuttet. Samle to rader med rundt 8 seksjoner på glid (figur 3).
5. La lysbildene tørke i 1 time ved romtemperatur. Oppbevar dem i opptil ett år i tett lukkete kasser ved -20 ° C.

6. Representative Resultater

Representant hjertestans skade etter denne protokollen er vist i dissekert hele hjerter ved 4 dpci (dager etter cryoinjury; Figur 2D-F). Slik visualize den hjerteinfarkt vev in vivo, benyttet vi transgen fisk uttrykke EGFP og kjernekraft DsRed2 under kontroll av hjerte-spesifikk cmlc-2 promoter ^11,12. Fraværet av EGFP og DsRed2 fluorescerende signaler avgrenset en plate-formet infarktet sone langs den apikale-laterale ventrikkel vegg.

For å utføre cellulære og molekylære analyser av vev, var hjerter fast og seksjoneres med en cryostat. En representant lysbilde med en rekke av tverrgående hjerte seksjoner er vist i figur 3.

Delene kan analyseres med ulike metoder (figur 4). For å fastslå omfanget av hjertet regenerasjon versus arrdannelse, utførte vi histologisk analyse med Acid Fuchsin Orange-G (AFOG) flekker, som differensielt betegner hjerte-og fibrotisk vev ^9. Genuttrykk analysene ble oppnådd i henhold til in situ hybridisering prosedyre 9. En kombinasjon av ulike flekker prosedyrer fører til identifisering av molekylære og cellulære mekanismene som er involvert i hjertets fornyelse følgende cryoinjury.

Figur 1. Indusere cryoinjury av ventrikkelen i den voksne sebrafisk. (A) Et bilde av cryoprobe. (B) En voksen sebrafisk er plassert i spalten av svampen med ventrale siden opp. (CF) Chest snitt å få tilgang til hjertet. (C) Et lite kutt gjennom huden og musklene er gjort mellom de to brystfinner (rød linje). (D) Saksen er satt inn i snitt for å kutte huden etter den røde pilen. (E) under huden, er det fint lag av sølvfargede hypodermis (omkranset av blå stiplet linje) forsiktig åpnet for tilgang til hjertet. (F) Snittet er spredt medtang og voldshandlingene ventrikkel (grønn pil) er tilgjengelig for cryoinjury. (G) Den kalde cryoprobe er forsiktig inn i brystet for å berøre hjertet. (HJ) Hjerte samling. (H) En dyp og lang innsnitt er gjort gjennom branchial buene av brystet for å få tilgang til perikardial hulrom. To hjerte strukturer er synlige: bulbus arteriosus (hvit pil) og ventrikkel (grønn pil). (I) bulbus arteriosus er hold med tang og dro ut fra kroppens hulrom. (J) Hele hjerte er excised fra av kroppen.

Figur 2. Representant kontroll og cryoinjured hjerter dissekert fra voksen transgen sebrafisk uttrykke EGFP og kjernefysisk DsRed2 i cardiomyocytes. (AC) uskadd hjerte. (A) Det mørke feltet belysning viser ventrikkel (V), bulbus arteriosus (Ba, hvit) og ventilene (Va), der atrium var knyttet til ventrikkelen. (B og C) Fluorescent bilder av t han intakt ventrikkel skjerm EGFP og DsRed2 uttrykk i cardiomyocytes. (DF) Hjerte på fire dager etter cryoinjury (4 dpci) (D) Det mørke feltet belysning avslører en plate-formet infarktet (gul stiplet linje). (EF) Cardiomyocyte markører EGFP og DsRed2 ikke er påvist i infarktet området, indikerer den skadede hjertemuskelen (omkranset av stiplet linje).

Figur 3. Seksjonering av hjertet. (A) Whole hjerte med tegningen av tverrgående seksjoner med start fra bunnen av hjertet (1 og 2, i rødt) mot toppen av hjertet (3 og 4 i grønt). (B) Fotografi av et lysbilde med den serien av påfølgende tverrgående seksjoner farget med AFOG (Acid Fuchsin Orange-G). De første avsnittene (1 og 2, røde firkanter) inneholder den ventrikulære apex, og de siste delene av hjertet (3 og 4, grønne firkanter) utgjør bulbus arteriosus.

iles/ftp_upload/3666/3666fig4.jpg "/>
Figur 4. Eksempler på analyser utført på hjerte seksjoner på 7 dager etter cryoinjury. (A) AFOG (Acid Fuchsin Orange-G) flekker etiketter friske muskelcellene i oransje, arrvev som inneholder kollagen i blått og fibrin i rødt. (B) In situ hybridisering av ventrikulær myosin heavy chain (vmhc) mRNA visualiserer intakt hjertemuskelen (blå flekker). Den skadde vevet er blottet for hjerte-genet karakterutskriften (rød stiplet linje). (C) Immunoassaying av tropomyosin (grønn) etiketter intakte cardiomyocytes og ikke skadet vev (omkranset med den stiplede linjen). DAPI (blå) flekker kjerner av alle cellene. (D) Genetisk merket cardiomyocytes ekspress DsRed2 (rød) i atomkjerner deres. DAPI (blå) betegner alle kjernene. Den infarktet sonen inneholder ikke DsRed2-positive celler (hvit stiplet linje).

Discussion

Cryoinjury er definert som kontrollert skade av vev ved presis bruk av ekstrem kulde ^14. Direkte termisk sjokk ødelegger cellene ved protein ødeleggelse og ved intracellulær væske iskrystall formasjon som sprekker plasmamembranen. Følgelig de skadede cellene dør i de prosesser apoptose og nekrose ^14. Begge disse celledød mekanismene har vist seg å bidra til vevstap etter hjerteinfarkt ^15. Dermed representerer cryoinjury en egnet modell for å indusere en hjerte infarkt. Flere studier rapporterte denne brønnen påviste metoden i ulike pattedyr, inkludert mus, rotter, kaniner og griser ^6,7. Tilpasningen av cryoinjury protokollen i sebrafisk muliggjør en mer komparativ diskusjon om infarktet respons mellom ulike arter.

To andre grupper uavhengig utviklet cryoinjury prosedyre for den voksne sebrafisk hjertet. De største forskjellene er surGery metoder, den type verktøy og anvendt frysing tid. I studien ved González-Rosa et al., Ble hjerteposen åpnet ved å rive vevet i stedet for å kutte. De brukte 0,3 mm kobber filament knyttet til en polyamid rør pre-kjølt i flytende nitrogen til å fryse hjertet for noen sekunder til tining kunne observeres ^10. I studien av Schnabel et al., En konisk stykke tørris på 20 mm lengde med en spiss spiss på 2 mm i diameter ble brukt til å røre hjertet i 10 sekunder ^8. De to gruppene fikk ventrikkel skader ved døden av myokard. Fordelen med vår metode er en mer reproduserbar deponering av kollagen-rik arr, som bedre etterligner de tidlige infarkt helbredende responser observert i pattedyr systemer.

Den kritiske trinn i cryoinjury prosedyren i sebrafisk er å gjøre et snitt gjennom huden og perikardial sac uten punktering av underliggende hjerte. En riktig performed kirurgi fører lite blødning. Rikelig blødning indikerer en utilsiktet punktering av ventrikkelen med saksen. I slike tilfeller bør dyrene trekkes tilbake fra forsøket. For å unngå punktering av hjertet, bør poenget med saks være rettet mot en grunne vinkel til huden.

Et annet viktig aspekt for å skape en reproduserbar skade er den nøyaktige plasseringen av den kalde cryoprobe på ventrikkelen for optimal presis varighet. For kort frysing tid vil resultere i betennelse med lite celledød. Langvarig frysing, på den annen side kan føre til omfattende skader på hjertet, som kan føre til økt dødelighet av dyrene. Vi fastslått at det optimale tidspunktet for å holde ventrikkelen i frossen tilstand varierer mellom 23-26 sekunder for en 2 cm lang voksen sebrafisk, og det kan derfor avvike dependently av størrelsen på dyrene.

Fordi vår protokollen er svært enkel og rask, det er ingen eksperimentell grenseasjon i utsette tilstrekkelig antall dyr for å oppnå tilstrekkelige biologiske gjennomkjøringer. Den cryosurgical behandling er meget godt tolerert av dyrene. Innsamling av hjertene på ulike tidspunkter etter cryoinjury tillater detaljert karakterisering av de etterfølgende fasene under gjenoppbyggingen prosessen. Den eksperimentelle analyse av cryoinjured hjerter kan omfatte 1) visualisering av gentranskripsjon ved in situ hybridisering, 2) påvisning av protein fordeling av immunofluorescent farging, 3) histologiske avbildning av forskjellige strukturer. Forstå de viktigste helbredende prosesser etter hjerteinfarkt i sebrafisk vil påvirke innen regenerativ biologi. Videre kan det være gunstig for å designe nye terapeutiske tilnærminger i regenerativ medisin.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Micro dissecting spring scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5602
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
Formaldehyde ~36%	Sigma-Aldrich	47630
Sucrose	Sigma-Aldrich	84100
Tissue-Tek O.C.T. compound	Sakura Finetek	4583
Slides Superfrost Plus	Fisher Scientific	12-550-15
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds - Truncated Molds T8	Polysciences, Inc.	18985