Summary
Nylige fremskridt inden for to-foton-mikroskopi har muliggjort realtid
Abstract
Lymfeknuder (LN) er sekundære lymfoide organer, som er strategisk placeret i hele kroppen for at tillade indfangning og præsentation af fremmede antigener fra perifere væv til at prime den adaptive immunreaktion. Sammenstillet mellem medfødte og adaptive immunrespons, at LN er et ideelt sted at studere immun celle interaktioner 1,2. Lymfocytter (T-celler, B-celler og NK-celler), dendritiske celler (DC'er), og makrofager omfatter hovedparten af knoglemarv-afledte cellulære elementer i LN. Disse celler er strategisk placeret i LN at muliggøre en effektiv overvågning af selv-antigener og potentielle udenlandske antigener 3-5. Den proces, ved hvilken lymfocytter held støder beslægtede antigener er en genstand for intens undersøgelse i de senere år, og omfatter en integration af molekylære kontakter, herunder antigen-receptorer, adhæsionsmolekyler, kemokiner og stromale strukturer såsom fibro-retikulære netværk 2,6-12 .
Forud for udviklingen af høj-opløsning real-time fluorescerende in vivo billeddannelse, efterforskere har påberåbt sig statisk billeddannelse, som kun giver svar vedrørende morfologi, placering og arkitektur. Selv om disse spørgsmål er grundlæggende i vores forståelse af immun celle adfærd, er de begrænsninger, der med denne teknik ikke tillader analyse til at dechifrere lymfocyt menneskehandel og miljømæssige spor, der påvirker dynamiske celle adfærd. For nylig, udvikling af intravital to-foton laser scanning mikroskopi (2P-LSM) har gjort det muligt for forskerne at se de dynamiske bevægelser og interaktioner af de enkelte celler i live LN i stedet 12-16. Især har vi og andre anvendes denne teknik til billede cellulær adfærd og interaktioner inden den popliteale LN, hvor den kompakte, tætte natur giver den fordel, multipleks dataopsamling over et stort vævsområde med forskellige væv sub-strukturer 11,17-18 . Det jeger vigtigt at bemærke, at denne teknik giver ekstra fordele i forhold til eksplanteret væv billedbehandling teknikker, som kræver afbrydelse af blod, lymfe flow, og i sidste ende de cellulære dynamik i systemet. Derudover eksplanterede væv har en meget begrænset tidsvindue, hvor vævet forbliver levedygtige efter billeddannelse efter eksplantation. Med ordentlig hydrering og overvågning af dyrets miljøforhold, kan den billeddannelse tiden blive udvidet betydeligt med denne intravital teknik. Her præsenterer vi en detaljeret metode til fremstilling af mus popliteal LN med det formål at udføre intravital billeddannelse.Protocol
1. Mus Holder Assembly
- Overlejre dækslet af en 100 mm glas petriskål på toppen af en 100 mm plast Petri-skål låget nedad. Glasset skal næsten røre midtpunkt plastik fad. Ved hjælp af glas som en stencil, spore en mark på plastskål.
- Anvende en håndboremaskine (dvs. Dremel) for at fjerne en del af en 100 mm plastskål låg for at skabe en halvmåneformet platform. Dette halvmåneformet plastlåg vil tjene som en understøtning for den øvre torso af mus (figur 1a). Bores to huller på halvmåneformede låg til at fastgøre gasmaske med et metal snoningsbinding. Fastgøre plastlåg til kanten af glasset petriskålen hjælp superlim eller en ækvivalent stærk adhæsiv (figur 1b).
- Lim lågene af to hvælvede-cap PCR-rør (skåret ved hængslet) 1 cm afstand til midten af bunden skålen med henblik på forankring popliteale hudlapper.
2. Mus Forberedelse
3. Kirurgi 4. 2-Photon Imaging Acquisition ** ** Denne kirurgiske procedure kan også være nyttige til andre former for intravital billeddannelse end 2P-LSM. 5. Repræsentative resultater Forskellige cirkulerende immunceller rekrutteres til LN med forskellige hastigheder efter adoptiv transfer. For CD4 + og CD8 +-lymfocytter, disse celler begynder at komme i LN via de højt endotel venulen (HEV) minutter efter intravenøs overførsel med et større antal ankommer den popliteale LN efter 2 til 4 timer 6,17-18. For B cells, vil et betydeligt antal akkumuleres efter 8 til 24 timer 19. Aktiverede udviklingslandene bør begynde at dukke op i de drænende popliteale LN 8 til 16 timer efter trædepuden injektion 3,11,16-17. Figur 2a viser, at selv uden andre seværdigheder, kan strukturer såsom B-celle hårsække anes let ved den runde kugleformede celleakkumulering synlige under 2P-LSM 19. Ved hjælp af en endogen fluorescerende reporter såsom ubiquitin-GFP splenocytter (figur 2, Supplerende videoer 1 og 2), kan man spore disse lymfocyt migration og adfærd i dag op til en uge under ikke-stimulerende fysiologiske betingelser. Med multi-kanal høj følsomhed detektorer, er det muligt at erhverve en multiplex billedbehandling datasæt, som omfatter strukturel information samt interaktion dynamik mellem flere cellulære partnere 17,19. Når de kirurgiske teknikker er korrekt udført, og de miljømæssige forhold overvåges nøje, lymphocyTES skal udvise karakteristiske migration hastighed, som vist i figur 2c, 2d og andre steder 13-14,16. Lymfocytter kan også udvise forskelle i migration hastighed afhængigt af sub-regioner i LN gennemgår billedbehandling, så vil yderligere seværdigheder såsom blodkar (som fremhævet ved indførelsen af fartøjet farvestoffer) med til at bestemme den overordnede billedkvalitet (dvs. korrekt temperaturstyring , minimal traume LN, osv.) 3,6,20. Supplerende Video 1. Time-lapse intravital 2P-LSM afbildning af en mus popliteale LN som beskrevet i figur 2. I alt 1x10 7 lymfocytter blev isoleret fron en ubiquitin-GFP + donormus og adoptivt overført intravenøst i en C57BL / 6 modtager mus 24 timer før imagografi. En række xy (750 um x 750 um) fluorescens billeder blev taget med fast z stablerne (5 um trin 13 trin) til opnåelse af en XYZ billeddannende stabel (750 um x 750 um x 65 um), som blev gentaget hver 20 sekunder i alt 60 minutter, hvilket resulterer i en xyzt billeddannende sekvens for hastighed analyse (figur 2c, 2d). Afspilningshastigheden = 450x. Målestokken = 50 um. Tidsstempling = min: sek. Klik her for at se supplerende video . Supplerende Video 2 forstørret med henblik på billeddannelse sekvensen i Supplemental Video 1 til B-celle folliklen. - T-celle zone kant. Afspilningshastigheden = 450x. Målestokken = 25 um. Tidsstempling = min. Sek Cslikke her for at se supplerende video.
Figur 1. Opførelse af en mus holder til musen popliteal LN Imaging a) Skematisk af muse holder samling;. B) Repræsentant intravital mus forberedelse c) Afsluttet musen holder samling d) Nærbilleder udsigt over popliteale LN efter kirurgisk eksponering.
Figur 2. Migration analyse af GFP +-lymfocytteri den popliteale LN. (a) 3D billede taget fra 2P-LSM billeddannelse sekvens af popliteale LN i en C57BL / 6 modtager mus adoptivt overført med 1x10 7 GFP +-lymfocytter 1 dag før imagografi. Punkterede linie betegner kant af B-celle follikler (b) spor lymfocytmigrering løbet af 1 time med kontinuerlig billeddannelse c) fordeling af den samlede lymfocytmigrering hastighed. Gennemsnitshastighed = 10,04 ± 4,26 um / min (samlet 15,125 analyserede spor) d) Differential cellulære migration hastighed distribution af celler fundet i den B-celle follikel (åbne søjler; betyder hastighed = 8,79 ± 3,90 um / min; samlede 1.525 spor analyseret ) og T-celle zone (lukkede barer, betyder hastighed = 13,77 ± 5,93 um / min i alt 1.250 analyserede spor). Målestokken = 50 um.
Discussion
Nylige fremskridt i høj opløsning in situ billeddannelsesteknikker, især 2P-LSM, er blevet ledsaget af en voksende interesse i studiet af dynamiske cellulær adfærd in vivo. Den 4D billeddannelse teknik på popliteale LN af en levende mus tillader sådanne analyser i den dynamiske opførsel af immunceller i uafbrudt vævet mikro-miljø. Anvendelsen af 2P-LSM med flere detektorer, der spænder over hele det synlige spektrum tillader samtidig billeddannelse indsamling af multiple cellepopulationer. Dette kan nu opnås ved anvendelse af in vivo celle-specifikke fluorescerende reporter-mus (f.eks Ubiquitin-EGFP-RFP eller-eCFP) kombineret med anvendelsen af adoptiv overføring af differentielt mærkede cellepopulationer under anvendelse af organiske fluorescerende celler farvestoffer (fx CFSE , SNARF-1, og Cell Tracker Orange) at undersøge cellulære mekanismer og funktion inden for LN. Ud over direkte observation af interaktioner mellem differentielt spores cell befolkninger, kan multiplex imaging datasættet gennemgå yderligere analyser med kommercielt tilgængelige billeddiagnostiske behandling programmer (f.eks Imaris, BitPlane Inc.) til yderligere at belyse celle adfærd og funktion. En bred vifte af muligheder eksisterer for at studere cellulære mekanismer til interaktion med disse in vivo og in silico teknikker.
Den væsentligste begrænsning af den eksperimentelle fremgangsmåde, der beskrives her er den tekniske kompleksitet, der ligger i kirurgi tilgang. Denne teknik kræver hård træning at blive fortrolig med den relevante anatomi og de præcise tekniske procedurer og færdigheder som krævet i denne protokol. Yderligere komplicerende faktorer omfatter det er vanskeligt at minimere vævsskader under LN udforskning, optimering af væv stabilitet under billedbehandling, og forhindre termisk og laser skade på LN før og under billedbehandling eksperimenter. Forstyrrelse nogen af disse faktorer vil resultere i mindre end optimal lymfeknuderocyte motilitet og vil derfor interferere med den korrekte fortolkning af den resulterende billeddannelse dataanalyser.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde er støttet af tilskud fra NCI 1R01CA154656, NIAID 1R21AI092299, Cancer Research Institute, St. Baldrick Fond, Dana Foundation, Gabrielle Angel Foundation, og Hyundai Motors of America "Hope-on-Wheels" Program.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Isoflurane, USP | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-773-60 | |
Vetbond | 3M | 1469SB | |
Nair - hair removal lotion | Nair | ||
PBS, 1X | Cellgro | 21-040-CV | |
Heating pad | Watlow | ||
Heating Pad Controller | Watlow | ||
Air and O2 | Airgas | ||
Temperature probe | Harvard Apparatus | ||
Tweezers Dumont #5 | World Precision Instruments, Inc. | 14101 | |
Forceps, Graefe Iris, 7 cm curved | World Precision Instruments, Inc. | 14141 | |
Scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5880 | |
Cover of 100x20 mm glass cell culture dish | Corning | 70165-102 | |
Cover of 100x20 mm polystyrene cell culture dish | Corning | 430167 | |
Betadine Solution (10% Povidine-Iodine Topical Solution) | Purdue Products L.P. | NDC 67618-150-08 |
References
- Bousso, P. T-Cell activation by dendritic cells in the lymph node: lessons from the movies. Nat. Rev. Immunol. 8, 675-684 (2008).
- Germain, R. N. Making friends in out-of-the-way places: how cells of the immune system get together and how they conduct their business as revealed by intravital imaging. Immunol. Rev. 221, 163-181 (2008).
- Huang, A. Illuminating the landscape of in vivo immunity: insights from dynamic in situ imaging of secondary lymphoid tissues. Immunity. 21, 331-339 (2004).
- Stefanova, I. Self-recognition promotes the foreign antigen sensitivity of naive T lymphocytes. Nature. 420, 429-434 (2002).
- Stefanova, I. On the role of self-recognition in T cell responses to foreign antigen. Immunol. Rev. 191, 97-106 (2003).
- Bajenoff, M. Fibroblastic reticular cells guide T lymphocyte entry into and migration within the splenic T cell zone. J. Immunol. 181, 3947-3954 (2008).
- Celli, S. Decoding the dynamics of T cell-dendritic cell interactions in vivo. Immunol. Rev. 221, 182-187 (2008).
- Mempel, T. R., Junt, T., von Andrian, U. H. Rulers over randomness: stroma cells guide lymphocyte migration in lymph nodes. Immunity. 25, 867-869 (2006).
- Worbs, T. CCR7 ligands stimulate the intranodal motility of T lymphocytes in vivo. J. Exp. Med. 204 (3), 489-495 (2007).
- Bajenoff, M. byways and breadcrumbs: directing lymphocyte traffic in the lymph node. Trends Immunol. 28, 346-352 (2007).
- Mempel, T. R. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
- Mempel, T. R. In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues. Curr. Opin. Immunol. 16, 406-417 (2004).
- Miller, M. J. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 2604-2609 (2003).
- Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. Intravital microscopy: visualizing immunity in context. Immunity. 21, 315-329 (2004).
- von Andrian, U. H., Mempel, T. R. Homing and cellular traffic in lymph nodes. Nat. Rev. Immunol. 3, 867-878 (2003).
- Bousso, P., Robey, E. Dynamics of CD8+ T cell priming by dendritic cells in intact lymph nodes. Nat. Immunol. 4, 579-585 (2003).
- Castellino, F. Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction. Nature. 440, 890-895 (2006).
- Halin, C. In vivo imaging of lymphocyte trafficking. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 581-603 (2005).
- Qi, H. Extrafollicular activation of lymph node B cells by antigen-bearing dendritic cells. Science. 312, 1672-1676 (2006).
- Germain, R. N. An extended vision for dynamic high-resolution intravital immune imaging. Semin. Immunol. 17, 431-441 (2005).