Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Intravitale Imaging van de muis knieholte lymfkliertest

Published: February 8, 2012 doi: 10.3791/3720
Automatic Translation
1, 1, 1, 2
1Department of Pediatrics, Case Western Reserve University, 2Department of Pediatrics, Pathology and Biomedical Engineering, Case Western Reserve University

Summary

Recente ontwikkelingen in de 2-foton microscopie hebben real-time ingeschakeld

Abstract

Lymfeklieren (LNS) zijn secundaire lymfoïde organen, die strategisch liggen verspreid over het lichaam toe te staan ​​voor het vangen en presentatie van vreemde antigenen van perifere weefsels naar de adaptieve immuunrespons te vullen. Naast elkaar tussen de aangeboren en adaptieve immuunreacties, de LN is een ideale plaats om immuun cel interacties 1,2 bestuderen. Lymfocyten (T-cellen, B-cellen en NK-cellen), dendritische cellen (DC) en macrofagen omvatten de bulk van beenmerg-afgeleide cellulaire elementen van het LN. Deze cellen zijn strategisch gepositioneerd in het LN om een efficiënte bewaking van de eigen antigenen en potentiële buitenlandse antigenen 3-5 mogelijk te maken. Het proces waarbij lymfocyten succes tegenkomen verwante antigenen is een onderwerp van intens onderzoek in de afgelopen jaren, en het gaat om een integratie van moleculaire contacten met inbegrip van antigeen-receptoren, adhesiemoleculen, chemokines, en stromale structuren zoals de fibro-reticulair netwerk 2,6-12 . Voorafgaand aan de ontwikkeling van hoge-resolutie real-time in vivo fluorescentie beeldvorming, onderzoekers zich op statische beeldvorming, die biedt alleen antwoorden met betrekking tot morfologie, positie en architectuur. Hoewel deze vragen zijn van fundamenteel belang in ons begrip van het immuunsysteem van cel gedrag, heeft de beperkingen die inherent zijn met deze techniek niet toe analyse te ontcijferen lymfocyten mensenhandel en milieu aanwijzingen dat dynamische cel gedrag beïnvloeden. Onlangs heeft de ontwikkeling van intravitale twee-foton laser scanning microscopie (2P-LSM) heeft het mogelijk gemaakt de onderzoekers om de dynamische bewegingen en interacties van individuele cellen te bekijken binnen de live-LNS in situ 12-16. In het bijzonder, hebben wij en anderen gebruikt een techniek die afbeelding cellulaire gedrag en interacties binnen de knieholte LN, waar de compacte, dichte natuur in het voordeel van multiplex data-acquisitie biedt over een groot weefsel gebied met diverse weefsel sub-structuren 11,17-18 . Het iis belangrijk op te merken dat deze techniek extra voordelen ten opzichte van geëxplanteerd tissue imaging technieken, die verstoring van bloed, lymfe stroom, en uiteindelijk de cellulaire dynamiek van het systeem nodig heeft. Daarnaast geëxplanteerd weefsels hebben een zeer beperkt venster van de tijd waarin het weefsel blijft levensvatbaar voor de beeldvorming na explant. Met de juiste hydratatie en bewaking van het milieu van het dier omstandigheden kan de beeldvorming tijd aanzienlijk uit te breiden met deze intravitale techniek. Hier presenteren we een gedetailleerde methode voor het bereiden muis knieholte LN voor het verrichten van intravitale beeldvorming.

Protocol

1. Mouse Holder Vergadering

  1. Overlay de cover van een 100-mm glas petrischaal op de top van een 100-mm plastic petrischaal deksel naar beneden. Het glas moet nauwelijks raken het middelpunt van de plastic schotel. Met behulp van het glas als een stencil, op te sporen van een merk op de plastic schotel.
  2. Gebruik een handboor (dat wil zeggen Dremel) om een ​​gedeelte van een 100-mm kunststof schaal deksel op een halvemaanvormige platform te creëren te verwijderen. Deze halvemaanvormige plastic deksel zal dienen als ondersteuning van het bovenlichaam van de muis (figuur 1a). Boor twee gaten in de halvemaanvormige deksel op de gasmasker vast met een metalen twist das. Zet het plastic deksel aan de rand van het glas petrischaal met behulp van superlijm of een ander gelijkwaardig sterke lijm (Figuur 1b).
  3. Lijm de deksels van twee koepelvormige kap-PCR buizen (afgesneden het scharnier) 1 cm van elkaar in het midden van de onderste schaal ter verankering popliteale huidlappen.

2. Muis Voorbereiding

  1. Verdoof de muis met isofluraan (2 tot 2,5% voor inductie, 1,5 tot 2% voor een operatie / imaging) gemengd in een 1:1 O 2: lucht-mengsel bij een debiet van 1L/min met behulp van een IACUC-goedgekeurde procedure. Zodra de muis is verdoofd, zorgen voor een gas masker over de neus met tape. Bepaal of de muis is volledig verdoofd door het gebrek aan respons tot teen en / of staart knijpt. Het niveau van isofluraan kan worden aangepast om ervoor te zorgen het dier volledig verdoofd, met een vaste, niet-moeizame ademhaling tussen de 60-80 ademhalingen / min.
  2. Gebruik een elektrische trimmer om haar te verwijderen aan de rechter achterbeen en inguinale gebied van de muis.
  3. Borstel weg losse haren en voorzichtig een bescheiden laag Nair lotion toe te passen op het geschoren gebied met een wattenstaafje. Na een minuut van de eerste aanvraag, verwijder de Nair en reinig de blootgestelde huid met een vochtigepapieren handdoek. Controleer of de muis schoon en droog is voordat u verder gaat.
  4. Maak een kleine 2 tot 3 mm incisie met een schaar op de rechter knie aan de strekpees bloot te leggen.
  5. Breng Vetbond langs het midden van de muis houder waarin de muis lichaam been wordt aangebracht. Zorgvuldig zet de muis op de houder, met de rechter knie naar beneden, naar rechts knieholte bloot te leggen. Zet de rechter knie pees met Vetbond tussen de 2 huidflap houders om te helpen stabiliseren van de beeldvorming veld.
  6. Rek en tape de armen en linker-op het bovenste platform van de houder.
  7. Gebruik een twist band met het gas masker op zijn plaats vast te zetten.
  8. Plaats de houder onder de dissectie microscoop. De LN moet absoluut blijven, onafhankelijk van de ademhaling beweging van de muis. Daarom moeten de nodige voorzorgen worden genomen tijdens het uitvoeren van de operatie om de stabiliteit van het been te optimaliseren. Bepaal de stand van de staart (typisch boven het hoofd) die bijdragen aan de grootstestabiliteit van het rechterbeen en tape de staart naar beneden.

3. Chirurgie

  1. Terwijl onder de dissectie omvang, te behouden muis lichaamstemperatuur met behulp van een kachel of een verwarmingselement. Voor een succesvolle beeldvorming van de knieholte LN, is het essentieel voor een goede lichaamstemperatuur houden gedurende de operatie alsmede weefsel vocht te behouden door continu toepassing warm PBS de blootgestelde weefsel.
  2. Steriliseer de huid met Betadine. Met behulp van steriele schaar, een middellijn incisie door de huid op de juiste halverwege de kuit, en blijven snijden verticaal tot aan de superieure deel van de rechterdij.
  3. Maak twee horizontale incisies op de top van de verticale incisie lijn voor de huid flappen te maken aan beide zijden.
  4. Trek en lijm naar beneden zowel de huid flappen met Vetbond. Trekken aan de huid strak voorafgaand aan de toepassing van Vetbond zal deze verder stimuleren been stabiliteit, maar zorg ervoor dat de huid spanning niet bloedstroom af te sluiten (dat wil zeggen veranderingen in de vessel kleur of diameter). Blijf lijm naar beneden andere gebieden van de huid om de stabiliteit van het been zorgen voor het blootstellen van de LN. De grootte van de muis bepalen hoeveel extra huid nodig lijmen beneden. Typerend zal groter muizen vereisen huid worden gelijmd aan de houder.
  5. De LN moet ofwel liggen in de knieholte naar rechts of links van de knieholte ader, afhankelijk van de plaatsing van de muis op de houder. Haal voorzichtig de LN uit de omliggende vetweefsel en de spieren met behulp van micro-ontleden pincet en tang. Om bloedingen en trauma's te minimaliseren, gebruikt u de Spreidingsdrukvrije technieken met micro-pincet om het ontleden van afzonderlijke weefsels. Voorzichtig bloot de knieholte LN zonder gevaar voor de integriteit van de afferente en efferente bloedvaten en de afferente lymfevaten.
  6. Voor extra stabiliteit weefsel, kan een vierkant deksel glas worden geplaatst op de vochtige LN, nog net aanraken van de LN terwijl het vermijden van schip occlusie. De dekking van glas kan worden secured met boetseerklei aan weerszijden van de muis.
  7. Fluorescerende kleurstoffen schip van verschillende grootte (bijvoorbeeld TRITC-dextran, minimaal 70kDa) kan intraveneus worden ingevoerd op dit punt te helpen de structurele relatie en integriteit van de LN tijdens de beeldvorming te markeren.

4. 2-Photon Imaging Acquisition **

  1. Zodra de LN afdoende blootgesteld en de stabiliteit wordt verkregen, onmiddellijk het volledige door muishouder montage op de microscooptafel voorzien van een programmeerbare temperatuur-geregelde verwarmingselement in een milieu microscoop kamer bij 37 ° C. Voeg genoeg steriel warm (37 ° C) PBS of HBSS onder water de LN. Het volume zal veranderen, afhankelijk van de grootte en plaats van de muis. Als alternatief kan warm PBS of HBSS rechtstreeks op de gedissecteerde LN door een fijne glazen pipet gemonteerd op een peristaltische pomp en met plakband aan de kolom van de onderdompeling lens doel. De stroming van de vloeistof moet zodanig zijn dat eenstabiele waterkolom kan worden gehandhaafd tussen de lens en het weefsel.
  2. Houd de PBS of HBSS temperatuur op 37 ° C met behulp van een verwarmingselement met een feedback sonde. Een afzonderlijke instrument moet worden geplaatst in de muis houder om de temperatuur van de PBS bevestigen in het bereik van 36,5 tot 37,5 ° C. Een rectale probe kan ook worden gebruikt om de lichaamstemperatuur van de experimentele muis controleren gehele opnamesessie.
  3. Gebruik een epi-tl-lamp naar de gids van LN plaatsing te helpen onder de doelstelling. Verwerven van fluorescerende beeld stapels met tijdsintervallen die geschikt zijn voor de gewenste cellulaire interacties (meestal 10 seconden tot 1 minuut tussen elke xyz beeld stack).
  4. De status van het dier in de microscoop kamer vaak door visuele inspectie of door een dier monitoringsysteem. Bepaal of de muis is volledig verdoofd door het gebrek aan respons tot teen en / of nagel wringt, en een stabiele, niet-moeizame ademhaling tussen 60-80 breaths / min. Het niveau van isofluraan kan worden aangepast om te verzekeren dat het dier volledig verdoofd. Met de juiste controle en hydratatie, kunnen dieren worden afgebeeld voor 4-6 uur, of misschien langer.
  5. Na de imaging experiment, laten inslapen het dier in een CO 2 kamer met behulp van IACUC-goedgekeurde euthanasie protocol. Het dier mag niet te voorschijn kwam uit anesthesie voorafgaand aan euthanasie.

** Deze chirurgische procedure kan ook nuttig zijn voor andere vormen van intravitale beeldvorming anders dan 2P-LSM.

5. Representatieve resultaten

Diverse circulerende immuuncellen worden gerekruteerd voor de LN met verschillende snelheden na adoptieve overdracht. Voor CD4 + en CD8 + lymfocyten deze cellen gaan in de LN komen door de hoge endotheliale venule (HEV) minuten na de intraveneuze overdracht met grote aantallen aankomst in de knieholte LN na 2 tot 4 uur 6,17-18. Voor B cells, is een aanzienlijk aantal accumuleren na 8 24 uur 19. Geactiveerde DC's zou moeten beginnen te verschijnen in de drainerende knieholte LN 8 tot 16 uur na injectie 3,11,16-17 voetzool. Figuur 2a toont aan dat zelfs zonder andere bezienswaardigheden, structuren zoals B-cel follikels kan gemakkelijk worden onderscheiden door de ronde bolvormige cel accumulatie zichtbaar onder 2P-LSM 19. Met behulp van een endogene fluorescerende reporter zoals het ubiquitine-GFP splenocyten (figuur 2, aanvullende Video's 1 en 2), kan men volgen van deze lymfocyten migraties en gedragingen dagen tot een week onder niet-stimulerende fysiologische omstandigheden. Met multi-channel hoge gevoeligheid detectoren, is het mogelijk om het verwerven van een multiplex imaging dataset dat structurele informatie en interactie dynamiek omvat tussen meerdere cellulaire partners 17,19.

Wanneer de chirurgische technieken goed worden uitgevoerd en de milieu-omstandigheden zorgvuldig gecontroleerd, lymphocytes moeten vertonen karakteristieke migratie snelheid, zoals aangetoond in figuur 2c, 2d en elders 13-14,16. Lymfocyten kunnen ook verschillen in de migratie snelheid, afhankelijk van de sub-regio's van de LN ondergaan beeldvorming vertonen, zal dat extra bezienswaardigheden, zoals de bloedvaten (zoals blijkt uit de introductie van schip kleurstoffen) te helpen om de algemene beeldkwaliteit (dat wil zeggen een goede temperatuurregeling te bepalen , minimale trauma aan LN, etc.) 3,6,20.

Figuur 1.
Figuur 1. Bouw van een muis houder voor muis knieholte LN Imaging a) Schema's van de muis houder samenstel;. B) Representatieve intravitale muis voorbereiding; c) Voltooid muis houder montage; d) Close-up beelden van de knieholte LN na chirurgische blootstelling.

Figuur 2.
Figuur 2. Migratie analyse van GFP + lymfocytenin de knieholte LN. (a) 3D momentopname van 2P-LSM beeldvorming volgorde van de knieholte LN in een C57BL / 6 ontvanger muis adoptief overgedragen met 1x10 7 GFP + lymfocyten 1 dag voor beeldvorming. Dash lijn geeft de grens van B-cel follikels, (b) Tracks van lymfocytenmigratie gedurende 1 uur continu beeldvorming; c) Verdeling van de totale lymfocytenmigratie snelheid. Gemiddelde snelheid = 10,04 ± 4,26 micrometer / min (totaal van de geanalyseerde 15.125 tracks), d) Verschil cellulaire migratie snelheid verdeling van de cellen in de B-cel follikel (open balken met een gemiddelde snelheid = 8,79 ± 3,90 micrometer / min; in totaal 1.525 nummers geanalyseerd ) en T-cel-zone (gesloten bars met een gemiddelde snelheid = 13,77 ± 5,93 micrometer / min; totaal van de onderzochte 1250 nummers). Schaal bar = 50 urn.

Aanvullende Video 1. Intervalfilm intravitaal 2P-LSM afbeelden van een muis knieholte LN zoals beschreven in figuur 2. In totaal 1x10 7 lymfocyten werden geïsoleerd frOM een ubiquitine-GFP + donor muis en adoptief intraveneus overgebracht in een C57BL / 6 ontvanger muis 24 uur voor beeldvorming. Een reeks xy (750 urn x 750 urn) fluorescentiebeelden genomen via vaste z stapels (5 pm stappen 13 stappen) een xyz imaging stapel (750 urn x 750 pm x 65 m), die herhaald 20 seconden geven in totaal 60 minuten, zodat een xyzt imaging volgorde snelheid analyse (figuren 2c, 2d). Afspeelsnelheid = 450x. Schaal bar = 50 urn. Tijd stempel = min: sec. Klik hier om aanvullende video te bekijken .

Aanvullende Video 2 ingezoomd-gezien de beeldvorming sequentie aanvullend Video 1 op de B-cel follikel -. T cel zone rand. Afspeelsnelheid = 450x. Schaal bar = 25 pm. Tijd stempel = min: sec. Clik hier om aanvullende video te bekijken.

Discussion

Recente ontwikkelingen in de hoge-resolutie in situ beeldvormende technieken, in het bijzonder 2P-LSM, gingen gepaard met een groeiende interesse in de studie van dynamische cellulaire gedrag in vivo. De 4D beeldverwerking techniek op de knieholte LN van een levende muis kunnen dergelijke analyses in het dynamisch gedrag van de immuuncellen in het ongestoorde weefsel micro-omgeving. Het gebruik van 2P-LSM met meerdere detectoren verspreid over het hele zichtbare spectrum maakt simultane beeldvorming het verzamelen van gegevens van meerdere celpopulaties. Dit kan nu worden bereikt door het gebruik van in vivo celspecifieke fluorescerende reporter muizen (bijv. ubiquitine-EGFP,-RFP of-eCFP) gecombineerd met het gebruik van adoptieve overdracht van differentieel gelabelde celpopulaties met organische fluorescente cellen kleurstoffen (bijv. CFSE , Snarf-1 en Cell Tracker Oranje) om cellulaire mechanismen en de functie te onderzoeken binnen de LN. Naast de directe waarneming van interacties tussen differentieel gevolgd cell populaties de multiplex imaging dataset verder analyse ondergaan met in de handel verkrijgbaar beeldverwerkingssysteem software programma's (bijvoorbeeld Imaris, Inc BitPlane) verder te ontrafelen cel gedrag en functie. Een breed scala aan mogelijkheden bestaan ​​om te studeren cellulaire interactie mechanismen met behulp van deze in vivo en in silico technieken.

De belangrijkste beperking van de experimentele benadering hier beschreven de technische complexiteit inherent aan de operatie benadering. Deze techniek vergt zware training om vertrouwd te raken met de relevante anatomie en de precieze technische procedures en vaardigheden zoals vereist door dit protocol. Verdere complicerende factoren zijn onder meer de moeilijkheid bij het minimaliseren van weefselschade tijdens LN exploratie, het optimaliseren van weefsel stabiliteit tijdens beeldvorming, en het voorkomen van thermische en laser letsel aan de LN voor en tijdens de beeldvorming experimenteren. Storing van een van deze factoren zal resulteren in minder-dan-optimale lymfeocyte beweeglijkheid en zal daarom de correcte interpretatie van de resulterende imaging data-analyses.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk wordt ondersteund door subsidies van NCI 1R01CA154656, NIAID 1R21AI092299, Cancer Research Institute, St. Baldrick's Foundation, Dana Foundation, Gabrielle's Angel Foundation, en Hyundai Motors van Amerika "Hope-on-Wheels"-programma.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Isoflurane, USP Baxter Internationl Inc. NDC 10019-773-60
Vetbond 3M 1469SB
Nair - hair removal lotion Nair
PBS, 1X Cellgro 21-040-CV
Heating pad Watlow
Heating Pad Controller Watlow
Air and O2 Airgas
Temperature probe Harvard Apparatus
Tweezers Dumont #5 World Precision Instruments, Inc. 14101
Forceps, Graefe Iris, 7 cm curved World Precision Instruments, Inc. 14141
Scissors Roboz Surgical Instruments Co. RS-5880
Cover of 100x20 mm glass cell culture dish Corning 70165-102
Cover of 100x20 mm polystyrene cell culture dish Corning 430167
Betadine Solution (10% Povidine-Iodine Topical Solution) Purdue Products L.P. NDC 67618-150-08

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bousso, P. T-Cell activation by dendritic cells in the lymph node: lessons from the movies. Nat. Rev. Immunol. 8, 675-684 (2008).
  2. Germain, R. N. Making friends in out-of-the-way places: how cells of the immune system get together and how they conduct their business as revealed by intravital imaging. Immunol. Rev. 221, 163-181 (2008).
  3. Huang, A. Illuminating the landscape of in vivo immunity: insights from dynamic in situ imaging of secondary lymphoid tissues. Immunity. 21, 331-339 (2004).
  4. Stefanova, I. Self-recognition promotes the foreign antigen sensitivity of naive T lymphocytes. Nature. 420, 429-434 (2002).
  5. Stefanova, I. On the role of self-recognition in T cell responses to foreign antigen. Immunol. Rev. 191, 97-106 (2003).
  6. Bajenoff, M. Fibroblastic reticular cells guide T lymphocyte entry into and migration within the splenic T cell zone. J. Immunol. 181, 3947-3954 (2008).
  7. Celli, S. Decoding the dynamics of T cell-dendritic cell interactions in vivo. Immunol. Rev. 221, 182-187 (2008).
  8. Mempel, T. R., Junt, T., von Andrian, U. H. Rulers over randomness: stroma cells guide lymphocyte migration in lymph nodes. Immunity. 25, 867-869 (2006).
  9. Worbs, T. CCR7 ligands stimulate the intranodal motility of T lymphocytes in vivo. J. Exp. Med. 204 (3), 489-495 (2007).
  10. Bajenoff, M. byways and breadcrumbs: directing lymphocyte traffic in the lymph node. Trends Immunol. 28, 346-352 (2007).
  11. Mempel, T. R. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
  12. Mempel, T. R. In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues. Curr. Opin. Immunol. 16, 406-417 (2004).
  13. Miller, M. J. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 2604-2609 (2003).
  14. Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. Intravital microscopy: visualizing immunity in context. Immunity. 21, 315-329 (2004).
  15. von Andrian, U. H., Mempel, T. R. Homing and cellular traffic in lymph nodes. Nat. Rev. Immunol. 3, 867-878 (2003).
  16. Bousso, P., Robey, E. Dynamics of CD8+ T cell priming by dendritic cells in intact lymph nodes. Nat. Immunol. 4, 579-585 (2003).
  17. Castellino, F. Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction. Nature. 440, 890-895 (2006).
  18. Halin, C. In vivo imaging of lymphocyte trafficking. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 581-603 (2005).
  19. Qi, H. Extrafollicular activation of lymph node B cells by antigen-bearing dendritic cells. Science. 312, 1672-1676 (2006).
  20. Germain, R. N. An extended vision for dynamic high-resolution intravital immune imaging. Semin. Immunol. 17, 431-441 (2005).

Tags

Immunologie lymfeknoop knieholte intravitale multi-foton microscopie cel mensenhandel muis tumor immunologie
Intravitale Imaging van de muis knieholte lymfkliertest
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liou, H. L. R., Myers, J. T.,… More

Liou, H. L. R., Myers, J. T., Barkauskas, D. S., Huang, A. Y. Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node. J. Vis. Exp. (60), e3720, doi:10.3791/3720 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter