Summary
Nylige fremskritt innen to-foton mikroskopi har aktivert sanntid
Abstract
Lymfeknuter (LNS) er sekundære lymfoide organer, som er strategisk plassert over hele kroppen for å tillate fangst og presentasjon av utenlandske antigener fra perifert vev til prime den adaptive immunresponsen. Sidestilt mellom medfødte og ervervede immunresponser, er det LN et ideelt sted å studere immunceller interaksjoner 1,2. Lymfocytter (T-celler, B-celler og NK-celler), dendrittiske celler (DCS), og makrofager utgjør hoveddelen av benmarg-avledet cellulære elementer av LN. Disse cellene er strategisk plassert i LN for å tillate effektiv overvåking av selvtillit antigener og potensielle utenlandske antigener 3-5. Den prosessen som lymfocytter vellykket møte beslektet antigener er en gjenstand for intens etterforskning i de senere årene, og innebærer en integrasjon av molekylære kontakter, inkludert antigen reseptorer, adhesjonsmolekyler chemokines og stromale strukturer som fibro-retikulære nettverk 2,6-12 .
Før utviklingen av høyoppløste sanntid fluorescerende in vivo imaging, etterforskere støttet seg på statiske bilder, som bare gir svar om morfologi, plassering og arkitektur. Selv om disse spørsmålene er grunnleggende i vår forståelse av immun celle atferd, ikke begrensningene iboende med denne teknikken ikke tillater analyse for å dechiffrere lymfocytt menneskehandel og miljømessige ledetråder som påvirker dynamisk celle atferd. Nylig har utviklingen av intravital to-foton laser scanning mikroskopi (2P-LSM) har gjort etterforskere for å vise dynamiske bevegelser og vekselvirkninger enkelte celler i løpet av live LNS in situ 12-16. Spesielt har vi og andre brukt denne teknikken til bildet mobilnettet atferd og interaksjoner innen popliteal LN, hvor den kompakte, tette naturen byr på fordelen av multipleks datainnsamling over et stort vev område med ulike vev sub-strukturer 11,17-18 . Det jeger viktig å merke seg at denne teknikken gir ekstra fordeler over eksplanterte vev imaging teknikker som krever forstyrrelser av blod, lymfe flyt, og til slutt de cellulære dynamikken i systemet. I tillegg eksplanterte vev har en svært begrenset tidsvindu der vev forblir levedyktig for avbildning etter eksplantering. Med riktig fuktighet og overvåking av dyrets miljøforhold, kan bildebehandling tid bli betydelig lengre med denne intravital teknikken. Her presenterer vi en detaljert metode for å forberede mus popliteal LN for utøvelse av intravital bildebehandling.Protocol
1. Mus Holder Montering
- Overlappe cover av en 100-mm glass petriskål på toppen av en 100-mm plast petriskål lokket vendt nedover. Glasset bør være knapt berøre midtpunktet av plast parabolen. Bruke glasset som en sjablong, spore et merke på plast fatet.
- Bruk en hånd drill (dvs. Dremel) for å fjerne en del av en 100-mm plast rett lokk for å lage en halvmåneformet plattform. Dette halvmåneformede plastlokk vil fungere som en støtte for overkroppen av musen (Figur 1a). Bor to hull på den halvmåneformede lokk til fester gassmaske med en metall vri slips. Fest plastlokk til kanten av glasset petriskål med superlim eller en ekvivalent sterkt lim (Figur 1b).
- Lim lokkene av to hvelvet-cap PCR rør (kuttet på hengslet) 1 cm fra hverandre på midten av den nederste fatet for å forankre knehasecyste hud klaffer.
2. Mus Forberedelse
3. Kirurgi 4. 2-Photon Imaging Acquisition ** ** Det kirurgiske inngrepet kan også være nyttig for andre former for intravital bildebehandling annet enn 2P-LSM. 5. Representative Resultater Ulike sirkulerende immunceller blir rekruttert til LN på ulike priser etter adoptiv overføring. For CD4 + og CD8 + lymfocytter, disse cellene begynner å komme i LN gjennom de høye endotelceller venule (HEV) minutter etter iv overføring med et betydelig antall som ankommer i popliteal LN etter 2 til 4 timer 6,17-18. For B cells, vil et betydelig antall hope etter 8 til 24 timer 19. Aktiverte utviklingsland bør begynne å vises i de drenering knehasecyste LN 8 til 16 timer etter footpad injeksjon 3,11,16-17. Figur 2a viser at selv uten andre landemerker, kan strukturer som B-celle follikler skjelnes enkelt ved det runde sfæriske cellen opphopning synlig under 2P-LSM 19. Bruke en endogen fluorescerende reporter eksempel ubiquitin-GFP splenocytes (figur 2, supplerende Videos 1 og 2), kan man spore disse lymfocytt vandring og atferd i flere dager opptil en uke under ikke-stimulerende fysiologiske forhold. Med multi-channel høy følsomhet detektorer, er det mulig å få en multiplex tenkelig datasett som omfatter strukturell informasjon samt samhandling dynamikk mellom flere cellulære partnere 17,19. Når de kirurgiske teknikkene er riktig utført og de miljømessige forholdene nøye overvåket, lymphocyTES skal fremvise karakteristisk migrasjon hastighet, som demonstrert i figur 2c, 2d og andre steder 13-14,16. Lymfocytter kan også vise forskjeller i migrasjon hastighet avhengig av sub-regioner av LN gjennomgår bildebehandling, så vil flere landemerker som blodkar (som fremhevet av innføring av fartøyets fargestoffer) bidrar til å bestemme den totale bildekvalitet (dvs riktig temperatur kontroll , minimal traumer til LN, etc.) 3,6,20. Supplemental Video 1. Time-lapse intravital 2P-LSM avbildning av en mus popliteal LN som beskrevet i figur 2. Totalt 1x10 7 lymfocytter ble isolert from en ubiquitin-GFP + donor mus og adoptively overført intravenøst inn i en C57BL / 6 mottaker mus 24 timer før bildebehandling. En rekke xy (750 mikrometer x 750 mm) fluorescens bildene ble tatt gjennom fast z stabler (5 mikrometer trinn, 13 trinn) å gi en xyz avbildning stack (750 mikrometer x 750 mikrometer x 65 mm), som ble gjentatt hvert 20. sekund til sammen 60 minutter, noe som resulterer i en xyzt tenkelig sekvens for fart analyse (Tall 2c, 2d). Avspillingshastigheten = 450x. Scale bar = 50 mikrometer. Tidsangivelse = min: sek. Klikk her for å se supplerende video . Supplemental Video 2 Zoomet-i lys av den bildebehandling sekvensen i Supplemental Video 1 på B celle hårsekken -. T-celle sone grensen. Avspillingshastigheten = 450x. Scale bar = 25 mikrometer. Tidsangivelse = min:. Sek Cslikke her for å se supplerende video.
Figur 1. Bygging av en mus holder for mus popliteal LN Imaging a) Skjematisk av mus monteringsholderen;. B) Representant intravital mus forberedelse, c) Fullført mus monteringsholderen, d) Nærbilde utsikt over popliteal LN etter kirurgisk eksponering.
Figur 2. Migrasjon analyse av GFP + lymfocytteri popliteal LN. (a) 3D øyeblikksbilde tatt fra 2P-LSM avbildning sekvens av popliteal LN i en C57BL / 6 mottaker mus adoptively overført med 1x10 7 GFP + lymfocytter en dag før bildebehandling. Dash linje betegner grensen av B-celle follikler, (b) Tracks av lymfocytt migrasjon under en time med kontinuerlig avbildning, c) Fordeling av samlet lymfocytt migrasjon hastighet. Mean hastighet = 10,04 ± 4,26 mikrometer / min (totalt 15,125 spor analyserte), d) Differensial cellulær migrasjon hastighet distribusjon av celler som finnes i B-celle hårsekken (åpen bar; bety hastighet = 8.79 ± 3.90 mikrometer / min; totalt 1,525 spor analysert ) og T-celle sone (lukkede barer; bety hastighet = 13,77 ± 5.93 mikrometer / min; totalt 1250 låter analysert). Scale bar = 50 mikrometer.
Discussion
Nylige fremskritt i høy oppløsning i situ imaging teknikker, særlig 2P-LSM, har blitt ledsaget av en økende interesse for studiet av dynamiske mobilnettet oppførsel in vivo. Den 4D avbildningsteknikk på popliteal LN av en live mus tillater slike analyser i den dynamiske oppførselen til immunceller innenfor uforstyrret vev mikro-miljø. Bruken av 2P-LSM med flere detektorer som dekker hele synlige spekteret tillater simultan avbildning datainnsamling av flere celle populasjoner. Dette kan nå oppnås gjennom bruk av in vivo celle-spesifikke fluorescerende reporter mus (f.eks ubiquitin-eGFP,-RFP eller-eCFP) kombinert med bruk av adoptive overføring av differensielt merket celle populasjoner ved bruk av organiske fluorescerende fargestoffer celle (f.eks CFSE , SNARF-1, og Cell Tracker Orange) for å undersøke cellulære mekanismer og funksjon i LN. I tillegg til direkte observasjon av samspill mellom ulikt spores cell populasjoner, kan multipleks tenkelig datasett gjennomgå ytterligere analyse med kommersielt tilgjengelige bildebehandlingsmotoren programmer (f.eks Imaris, BitPlane Inc.) til ytterligere belyser celle atferd og funksjon. Et bredt spekter av muligheter som finnes for å studere cellulære mekanismer samhandling med disse in vivo og i silico teknikker.
Den viktigste begrensningen av eksperimentell tilnærming som beskrives her er den tekniske kompleksiteten som ligger i kirurgi tilnærming. Denne teknikken krever hardtrening for å bli kjent med relevant anatomi og de presise tekniske prosedyrer og ferdigheter som kreves av denne protokollen. Ytterligere kompliserende faktorer er vanskeligheten i å minimere vevskade under LN leting, optimalisere vev stabilitet under bildebehandling, og hindre termisk og laser skade på LN før og under bildebehandling eksperimentering. Perturbasjon til noen av disse faktorene vil føre til mindre enn optimal lymfeocyte motilitet og vil derfor forstyrre riktig tolkning av resulterende imaging dataanalyser.
Disclosures
Forfatterne har ikke noe å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet er støttet med tilskudd fra 1R01CA154656 NCI, NIAID 1R21AI092299, Cancer Research Institute, St. Baldrick stiftelse, Dana Foundation, Gabrielle s Angel Foundation, og Hyundai Motors of America "Hope-on-Wheels" Program.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Isoflurane, USP | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-773-60 | |
Vetbond | 3M | 1469SB | |
Nair - hair removal lotion | Nair | ||
PBS, 1X | Cellgro | 21-040-CV | |
Heating pad | Watlow | ||
Heating Pad Controller | Watlow | ||
Air and O2 | Airgas | ||
Temperature probe | Harvard Apparatus | ||
Tweezers Dumont #5 | World Precision Instruments, Inc. | 14101 | |
Forceps, Graefe Iris, 7 cm curved | World Precision Instruments, Inc. | 14141 | |
Scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5880 | |
Cover of 100x20 mm glass cell culture dish | Corning | 70165-102 | |
Cover of 100x20 mm polystyrene cell culture dish | Corning | 430167 | |
Betadine Solution (10% Povidine-Iodine Topical Solution) | Purdue Products L.P. | NDC 67618-150-08 |
References
- Bousso, P. T-Cell activation by dendritic cells in the lymph node: lessons from the movies. Nat. Rev. Immunol. 8, 675-684 (2008).
- Germain, R. N. Making friends in out-of-the-way places: how cells of the immune system get together and how they conduct their business as revealed by intravital imaging. Immunol. Rev. 221, 163-181 (2008).
- Huang, A. Illuminating the landscape of in vivo immunity: insights from dynamic in situ imaging of secondary lymphoid tissues. Immunity. 21, 331-339 (2004).
- Stefanova, I. Self-recognition promotes the foreign antigen sensitivity of naive T lymphocytes. Nature. 420, 429-434 (2002).
- Stefanova, I. On the role of self-recognition in T cell responses to foreign antigen. Immunol. Rev. 191, 97-106 (2003).
- Bajenoff, M. Fibroblastic reticular cells guide T lymphocyte entry into and migration within the splenic T cell zone. J. Immunol. 181, 3947-3954 (2008).
- Celli, S. Decoding the dynamics of T cell-dendritic cell interactions in vivo. Immunol. Rev. 221, 182-187 (2008).
- Mempel, T. R., Junt, T., von Andrian, U. H. Rulers over randomness: stroma cells guide lymphocyte migration in lymph nodes. Immunity. 25, 867-869 (2006).
- Worbs, T. CCR7 ligands stimulate the intranodal motility of T lymphocytes in vivo. J. Exp. Med. 204 (3), 489-495 (2007).
- Bajenoff, M. byways and breadcrumbs: directing lymphocyte traffic in the lymph node. Trends Immunol. 28, 346-352 (2007).
- Mempel, T. R. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427, 154-159 (2004).
- Mempel, T. R. In vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues. Curr. Opin. Immunol. 16, 406-417 (2004).
- Miller, M. J. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 2604-2609 (2003).
- Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. Intravital microscopy: visualizing immunity in context. Immunity. 21, 315-329 (2004).
- von Andrian, U. H., Mempel, T. R. Homing and cellular traffic in lymph nodes. Nat. Rev. Immunol. 3, 867-878 (2003).
- Bousso, P., Robey, E. Dynamics of CD8+ T cell priming by dendritic cells in intact lymph nodes. Nat. Immunol. 4, 579-585 (2003).
- Castellino, F. Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction. Nature. 440, 890-895 (2006).
- Halin, C. In vivo imaging of lymphocyte trafficking. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 581-603 (2005).
- Qi, H. Extrafollicular activation of lymph node B cells by antigen-bearing dendritic cells. Science. 312, 1672-1676 (2006).
- Germain, R. N. An extended vision for dynamic high-resolution intravital immune imaging. Semin. Immunol. 17, 431-441 (2005).