Summary
Recentes avanços em 2-fotão microscopia permitiram em tempo real
Abstract
Os gânglios linfáticos (LNS) são órgãos linfóides secundários, os quais são estrategicamente localizados ao longo do corpo para permitir a captura e apresentação de antigénios estranhos dos tecidos periféricos para prime a resposta imunitária adaptativa. Justapostos entre inata e adaptativa respostas imunes, a LN é um local ideal para estudar células imunes 1,2 interações. Linfócitos (células T, células B e células NK), células dendríticas (DCS), e macrófagos compreendem a maior parte das derivadas da medula óssea elementos celulares do LN. Estas células estão estrategicamente posicionados na LN para permitir uma eficiente fiscalização antígenos próprios e potenciais antígenos estranhos 3-5. O processo pelo qual os linfócitos com sucesso encontrar antígenos cognatas é um assunto de investigação intensa nos últimos anos, e envolve uma integração de contactos moleculares, incluindo receptores de antigénios, moléculas de adesão, quimiocinas, e estruturas do estroma, tais como a rede de fibro-reticular 2,6-12 .
Antes do desenvolvimento de alta resolução em tempo real fluorescente in vivo de imagens, os pesquisadores contavam com imagem estática, que só oferece respostas sobre morfologia, posição e arquitetura. Enquanto essas questões são fundamentais na nossa compreensão do comportamento de células imunes, as limitações intrínsecas com esta técnica não permite uma análise de decifrar o tráfico de linfócitos e pistas ambientais que afetam o comportamento dinâmico da célula. Recentemente, o desenvolvimento de intravital dois fótons de microscopia de varredura a laser (2P-LSM) permitiu que os investigadores para ver os movimentos dinâmicos e interações de células individuais dentro LNs ao vivo em 12-16 situ. Em particular, nós e outros têm aplicado esta técnica para o comportamento da imagem celular e interacções dentro do LN poplítea, onde a sua natureza, compacto denso oferece a vantagem de aquisição de dados multiplex ao longo de um grande área de tecido com o tecido diversas sub-estruturas 11,17-18 . É iÉ importante notar que esta técnica oferece benefícios adicionais sobre as técnicas tecido explantado de imagem, as quais requerem a interrupção do sangue, fluxo linfático, e, finalmente, a dinâmica celulares do sistema. Além disso, os tecidos explantados têm uma janela de tempo muito limitado em que o tecido permanece viável para geração de imagens após explante. Com a hidratação adequada e monitoramento das condições ambientais do animal, o tempo de imagens pode ser significativamente ampliado com esta técnica intravital. Aqui, apresentamos um método detalhado de preparação LN rato poplítea com a finalidade de realizar imagens intravital.Protocol
1. Assembléia Titular do mouse
- Sobrepor a tampa de um 100-mm placa de Petri de vidro no topo de uma tampa prato de 100 mm de plástico Petri virado para baixo. O vidro deve ser quase sem tocar no ponto central do prato de plástico. Usar o vidro como um estêncil, traçar uma marca para o prato de plástico.
- Usar uma broca de mão (isto é, Dremel) para remover uma porção de uma tampa prato de 100 mm de plástico para criar uma plataforma em forma de crescente. Esta tampa de plástico em forma de crescente irá servir como um suporte para a parte superior do tronco do rato (Figura 1a). Faça dois furos na tampa em forma de crescente para garantir a máscara de gás com um laço de torção metal. Fixar a tampa de plástico para a borda da placa de Petri de vidro usando super cola ou um adesivo equivalentemente forte (Figura 1b).
- Cole as tampas de duas abobadado-tampão de PCR tubos (cortado na dobradiça) 1 cm de distância do centro do prato de fundo para o propósito de ancoragem retalhos poplíteos.
2. Preparação do mouse
3. Cirurgia 4. 2-Photon Aquisição de imagem ** ** Este procedimento cirúrgico pode também ser útil para outras formas de imagiologia intravital com excepção 2P-LSM. 5. Os resultados representativos Várias células imunológicas circulantes são recrutados para o LN em taxas diferentes após a transferência adotiva. Para T CD4 + e CD8 +, estas células começam a chegar no LN através das altas endoteliais vénula (HEV) minutos após iv de transferência com números substanciais que chegam à LN poplítea após 2 a 4 horas 6,17-18. Para B cells, um número substancial irá acumular-se depois de 8 a 24 horas 19. DCs ativadas devem começar a aparecer nos drenagem poplítea LN 8 a 16 horas após a injeção pata 3,11,16-17. Figura 2a mostra que, mesmo sem outros marcos, estruturas como folículos de células B pode ser percebido facilmente pelo acúmulo de células redondas esférico visível sob 2P-LSM 19. Usando um repórter fluorescente endógeno, tais como os esplenócitos ubiquitina-GFP (Figura 2, videos Suplementar 1 e 2), pode-se controlar estas migrações de linfócitos e comportamentos de dias até uma semana sob-estimulatórias não condições fisiológicas. Com multi-canal detectores de alta sensibilidade, é possível adquirir um conjunto de dados de imagem multiplex que engloba informações estruturais, bem como a dinâmica de interação entre os vários parceiros celulares 17,19. Quando as técnicas cirúrgicas estão devidamente executadas e as condições ambientais cuidadosamente monitorizados lymphocy,TES deve exibir velocidade de migração característica, como demonstrado na Figura 2c, 2d e noutros locais 13-14,16. Os linfócitos também podem apresentar diferenças na velocidade de migração em função das sub-regiões da imagem LN passando, assim marcos adicionais, tais como vasos sanguíneos (como destaque para a apresentação de corantes de navios) vai ajudar a determinar a qualidade de imagem global (ou seja, controle de temperatura adequada , um mínimo de trauma para LN, etc) 3,6,20. Suplementar vídeo 1. Tempo-lapso intravital imagiologia 2P-LSM de um rato LN poplítea como descrito na Figura 2. Um total de 1x10 7 linfócitos foram isolados from um ubiquitina-GFP do rato dador + e adotivamente transferido por via intravenosa em um rato receptor C57BL / 6 24 horas antes de imagem. Uma série de xy (750 uM x 750 mm) imagens de fluorescência foram tomadas através fixo z pilhas (5 passos mM, 13 passos) para se obter um xyz pilha de imagem (750 uM x 750 uM x 65 mm), que foi repetido a cada 20 segundos para um total de 60 minutos, resultando numa sequência de imagens xyzt para análise de velocidade (Figuras 2c, 2d). Reprodução = velocidade 450X. Barra de escala = 50 mM. Carimbo de tempo = min: seg. Clique aqui para assistir vídeo suplementar . Suplementar vídeo 2 Zoomed-, tendo em conta a sequência de imagens de vídeo em suplementar 1 no folículo célula B -. T fronteira da zona de célula. Reprodução = velocidade 450X. Barra de escala = 25 mM. Carimbo de tempo = min:. Seg Clamber aqui para assistir ao vídeo suplementar.
Figura 1. Construção de um titular do mouse para mouse poplítea LN imagem a) Esquema de montagem titular rato;. B) Representante de preparação do mouse intravital; c) montagem titular Concluído mouse; d) Close-up vista para o LN poplítea após a exposição cirúrgica.
Figura 2. Análise de migração de GFP + linfócitosno LN poplítea. (a) instantâneo 3D tomadas a partir de 2P-LSM sequência de imagens da LN poplítea em um rato receptor C57BL / 6 adotivamente transferida com 1x10 GFP + 7 linfócitos 1 dia antes da criação de imagens. Linha traço indica a fronteira de folículos das células B, (b) Faixas de migração de linfócitos durante 1 hora de imagiologia contínua; Distribuição c) da velocidade de migração global de linfócitos. Velocidade média = 10,04 ± 4,26 mM / min (total de 15,125 faixas analisadas), d) Diferencial de distribuição velocidade celular migração de células encontradas no folículo de células B (bares abertos; velocidade média = 8,79 ± 3,90 mM / min; total de 1.525 faixas analisadas ) e células T de zona (bares fechados, a velocidade média = 13,77 ± 5,93 mM / min; total de 1.250 faixas analisadas). Barra de escala = 50 mM.
Discussion
Recentes avanços em alta resolução nas técnicas de imagem in situ, em especial 2P-LSM, têm sido acompanhadas por um interesse crescente no estudo do comportamento celular dinâmica in vivo. A técnica de imagem 4D no LN poplítea de um rato vivo permite que tais análises do comportamento dinâmico de células imunes no tecido ininterrupto micro-ambiente. A utilização de 2P-LSM com detectores múltiplos abrangendo todo o espectro visível permite simultânea de imagens de recolha de dados de populações de células múltiplas. Isto pode agora ser alcançado através da utilização de in vivo de células específicas ratinhos repórter fluorescentes (por exemplo, ubiquitina-EGFP,-RFP, ou-eCFP) combinados com a utilização de transferência adoptiva de populações de células diferencialmente rotulados com orgânicos corantes de células fluorescentes (por exemplo, CFSE , Snarf-1, e Cell Rastreador Orange) para examinar os mecanismos celulares e função dentro da LN. Além da observação direta das interações entre c diferencialmente rastreadopopulações ell, o conjunto de dados de imagem multiplex pode sofrer uma análise mais aprofundada com o comercialmente disponíveis programas de processamento de imagem de software (por exemplo Imaris, BitPlane Inc.) para elucidar o comportamento das células e função. Uma ampla gama de possibilidades existe para estudar mecanismos de interação celulares usando estes in vivo e in silico técnicas.
A principal limitação da abordagem experimental aqui descrito é a complexidade técnica inerente à abordagem da cirurgia. Esta técnica requer um rigoroso treinamento para se familiarizar com a anatomia relevante e os procedimentos técnicos precisos e habilidades exigidos por este protocolo. Outros factores que complicam incluem a dificuldade em minimizar danos nos tecidos durante a exploração LN, optimizar a estabilidade do tecido durante a imagem, e prevenir a lesão térmica e de laser para o LN antes e durante a experimentação de imagem. Perturbação de qualquer um desses fatores irá resultar em menos do que ideal linfamotilidade ocyte e, portanto, interferir com a correcta interpretação do resultado de análises de dados de imagem.
Disclosures
Os autores não têm nada para revelar.
Acknowledgments
Este trabalho é suportado por concessões do NCI 1R01CA154656, NIAID 1R21AI092299, Cancer Research Institute, da Fundação St. Baldrick, a Fundação Dana, Gabrielle Angel Foundation, e Hyundai Motors da América "esperança sobre rodas" Programa.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Isoflurane, USP | Baxter Internationl Inc. | NDC 10019-773-60 | |
Vetbond | 3M | 1469SB | |
Nair - hair removal lotion | Nair | ||
PBS, 1X | Cellgro | 21-040-CV | |
Heating pad | Watlow | ||
Heating Pad Controller | Watlow | ||
Air and O2 | Airgas | ||
Temperature probe | Harvard Apparatus | ||
Tweezers Dumont #5 | World Precision Instruments, Inc. | 14101 | |
Forceps, Graefe Iris, 7 cm curved | World Precision Instruments, Inc. | 14141 | |
Scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5880 | |
Cover of 100x20 mm glass cell culture dish | Corning | 70165-102 | |
Cover of 100x20 mm polystyrene cell culture dish | Corning | 430167 | |
Betadine Solution (10% Povidine-Iodine Topical Solution) | Purdue Products L.P. | NDC 67618-150-08 |
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