Summary
यहाँ हम माउस tracheas से बेसल और submucosal ग्रंथि वाहिनी कोशिकाओं के अलगाव के लिए हमारे प्रोटोकॉल प्रदर्शित करता है. हम भी पृष्ठीय माउस वसा पैड में स्टेम कोशिकाओं को इंजेक्शन लगाने के लिए एक बनाने की विधि का प्रदर्शन
Abstract
बड़े वायुमार्ग सीधे वातावरण के साथ संपर्क में हैं और इसलिए विषाक्त पदार्थों और संक्रामक एजेंटों कि हम 1 में सांस से चोट करने के लिए अतिसंवेदनशील है. बड़े वायुमार्ग इसलिए एक कुशल मरम्मत तंत्र हमारे शरीर की रक्षा करने के लिए आवश्यकता होती है. यह मरम्मत की प्रक्रिया वायुमार्ग में स्टेम कोशिकाओं से होता है और वायुमार्ग से इन स्टेम कोशिकाओं को अलग मरम्मत और उत्थान के तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण है. यह भी असामान्य मरम्मत कि airway 2 रोगों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं समझने के लिए महत्वपूर्ण है. इस पद्धति का लक्ष्य माउस tracheal submucosal ग्रंथि नलिकाओं से एक उपन्यास स्टेम सेल की आबादी को अलग करने के लिए और इन विट्रो में और vivo मॉडल प्रणाली में इन कोशिकाओं जगह submucosal 3 ग्रंथियों की मरम्मत और उत्थान के तंत्र की पहचान है. यह उत्पादन विधियों कि वाहिनी और बेसल बड़े 3 वायुमार्ग से स्टेम कोशिकाओं को अलग करने और परख करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है पता चलता है कि यह हमें की अनुमति देगा.airway के सिस्टिक फाइब्रोसिस, अस्थमा और क्रोनिक प्रतिरोधी फुफ्फुसीय रोग जैसे रोगों का अध्ययन करने के लिए. वर्तमान में, वहाँ submucosal ग्रंथि वाहिनी कोशिकाओं के अलगाव के लिए कोई तरीके हैं और vivo मॉडल में कोई submucosal ग्रंथियों के उत्थान का अध्ययन.
Protocol
कदम के रेखांकित
1. ट्रेकिआ के विच्छेदन
2. ट्रेकिआ सफाई और इसे काटने
3. एनजाइम पाचन और एकल कक्ष निलंबन में प्रसंस्करण
4. FACS के लिए धुंधला हो जाना और छँटाई
5. प्रसंस्करण के लिए vivo में इन विट्रो मॉडल में क्रमबद्ध कोशिकाओं
1. ट्रेकिआ के विच्छेदन
- Pentobarbital की 0.1 mg/0.2 सीसी की एक intraperitoneal इंजेक्शन के साथ माउस euthanize.
- पेट की दीवार काट खुला, और ओर करने के लिए से आंतों को स्थानांतरित करने के लिए उदर महाधमनी बेनकाब और फिर यह काटना.
- और दोनों पक्षों पर पूर्वकाल छाती दीवार डायाफ्राम के माध्यम से काटने के लिए दिल और फेफड़े का पर्दाफाश करके छाती खोलें. गर्दन काटने वसा और लार ग्रंथियों को हटाने के लिए ट्रेकिआ बेनकाब जारी.
- थाइमस निकालें और नीचे और पीछे कनेक्शन बंद फेफड़ों में कटौती. Separघुटकी से उन दोनों के बीच एक संदंश डालने से ट्रेकिआ खाया तो गला के साथ अपने संबंध से ऊपर अपने सबसे ऊपरी हिस्से में ट्रेकिआ कटौती. फिर संदंश के साथ ट्रेकिआ पकड़ और यह अपने लगाव से काटना और यह दिल और एन ब्लॉक फेफड़ों के साथ दूर करने के लिए नीचे जारी रखने के. दूर कट और सही और बाएँ मुख्य ब्रांकाई की सबसे शामिल नाभिका पास दिल, फेफड़े.
- जगह एक छोटे पेट्री डिश में बर्फ पर मध्यम इकट्ठा युक्त ट्रेकिआ.
2. ट्रेकिआ सफाई और इसे काटने
- विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, बहुत अच्छी बात है (5 सं) संदंश और Vannas Tubingen कैंची (FST 15003-08 finescience.com) का उपयोग करने के लिए इसे से जुड़ी अन्य सभी ऊतकों से ट्रेकिआ साफ. लिम्फ नोड्स, आवर्तक laryngeal तंत्रिका, वसा, थायरॉयड ग्रंथि और शेष फेफड़े वाहिकाओं: यह भी शामिल है. ट्रेकिआ के ऊपरी भाग में विशेष ध्यान देने की जरूरत है, SMG का सबसे बड़ा गुच्छा समझौता किए बिना बड़ा laryngeal उपास्थि को हटानेकि मुद्रिका उपास्थि और 1 tracheal कार्टिलेजीनस अंगूठी 4 (C1) के बीच रखा गया है.
- ऊपरी भाग और C4 और C5 के बीच निचले हिस्से में ट्रेकिआ कट और फिर खुला ट्रेकिआ के लुमेन के माध्यम से दोनों भागों में कटौती.
3. एनजाइम और एकल कक्ष निलंबन (अनुसूचित जाति) में पाचन प्रसंस्करण
- एक Eppendorf ट्यूब में 16 कमरे के तापमान (आर टी) को 30 मिनट, जैसा कि पहले 5 वर्णित के लिए यू dispase 1 मिलीलीटर में ट्रेकिआ के निचले भाग से सेते हैं. फिर आरटी पर एक अतिरिक्त 20 मिनट के लिए 0.5 मिलीग्राम / मिलीलीटर DNase मैं DMEM में जोड़ने.
- ताजा एकत्रित माध्यम में पचा tracheas एक बाँझ पेट्री डिश में निकालें और विदारक माइक्रोस्कोप के तहत सतह उपकला पट्टी. एक विंदुक का प्रयोग करने के लिए एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब छीन उपकला युक्त मध्यम हस्तांतरण.
- 1000 XG में 4 डिग्री सेल्सियस नीचे छीन उपकला स्पिन तैरनेवाला निकालें, और 0.1% trypsin / EDTA और सेते जोड़ने जबकि वें मिलाते37 में एक ई ट्यूब ° C 30 मिनट के लिए इनक्यूबेटर (200 rpm) मिलाते हुए. ऊष्मायन के बाद, एक 1000 μl टिप का उपयोग, ऊपर पिपेट और नीचे तक clumps को तोड़ने और एक एकल कक्ष निलंबन फार्म.
- एक शंक्वाकार 0.15% pronase के 1 मिलीलीटर युक्त ट्यूब में ऊपरी ट्रेकिआ रखें. फिर 4 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
- धीरे भंवर ट्यूब और फिर ताजा एकत्रित करना मध्यम में ट्रेकिआ जगह और विदारक खुर्दबीन के नीचे पुष्टि करते हैं कि वहाँ सतह उपकला (एसई) की पूरी टुकड़ी है.
- ठीक कैंची से ट्रेकिआ क़ीमा SMG डिब्बों को खोलने के लिए और फिर आरटी पर एक pronase में अधिक घंटे के लिए धीमी गति से झटकों के साथ सेते हैं.
- स्पिन नीचे ट्रैकियल ऊतक, pronase निकालने के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर trypsin / EDTA और सेते ऊपर के रूप में मिलाते हुए के साथ 30 मिनट के लिए 0.1% जोड़ने.
- Passage कोशिकाओं पचा, clumps और ग्रंथियों की 23g 20G, और 26G सुई के माध्यम से किसी भी शेष विखंडू एक 10 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर. प्रत्येक सुई आकार के साथ passaging पहले कई बार दोहराएँनीचे कदम. अब, सबसे कोशिकाओं एक अनुसूचित जातियों में होना चाहिए.
- एक 40 सुक्ष्ममापी झरनी के माध्यम से निलंबन फ़िल्टर तो झरनी धोने और नीचे कोशिकाओं स्पिन. फिर माध्यम की उचित मात्रा में कोशिकाओं reconstitute, कोशिकाओं गिनती और धुंधला हो जाना और FACS छँटाई करने के लिए तुरंत आगे बढ़ना. 4 डिग्री सेल्सियस या कई घंटे के लिए बर्फ पर मत छोड़ो कोशिकाओं है क्योंकि हमने पाया कि इस व्यवहार्यता को प्रभावित करता है और गंभीर रूप से दक्षता के गठन क्षेत्र को कम कर देता है.
4. FACS के लिए धुंधला हो जाना और छंटनी
- अस्थिर और एकल दाग मुआवजा ट्यूबों की तैयारी तो आरटी पर 15 मिनट लिए प्राथमिक एंटीबॉडी, बकरी Trop2 और ITGA6 चूहे के साथ कोशिकाओं के बाकी दाग के लिए पर्याप्त कक्षों को ले लो. फिर पीबीएस के साथ धोने या माध्यम से इकट्ठा, पदच्युत तैरनेवाला बहुत ध्यान से और सेल गोली को तोड़ने के.
- उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी, आरटी पर 10 मिनट के लिए अंधेरे में सेते हैं साथ दाग धो, और सतह पर तैरनेवाला हटाने और फिर गोली को तोड़ने के.
- FACS परAria, मलबे, बहुत छोटे कोशिकाओं, सेल दोहरी और मृत कोशिकाओं को बाहर अपने वोल्टेज और मुआवजा, गेट समायोजित करने के बाद. फिर, एसई से सबसे कोशिकाओं TROP2 सकारात्मक हो सकता है जबकि SMG कोशिकाओं के 20-50% TROP2 + 6 होना चाहिए.
- अपने Trop2 के लिए फाटक छँटाई ITGA6 + + कोशिकाओं एसई से (बेसल सेल) और + कोशिकाओं Trop2 के लिए (+ / - ITGA6 पॉजिटिव कोशिकाओं) SMG (डक्ट कोशिकाओं) से. सेट
5. के आधार पर छाँटे गए प्रकोष्ठों के लिए प्रसंस्करण: इन विट्रो और vivo मॉडल में संस्कृति में
5.1 इन विट्रो 5-9 संस्कृति बनाने के क्षेत्र में
- मिश्रण के 100 μl "विकास फैक्टर कम Matrigel" पूरा मध्यम 10,11 (1 टेबल देखें) 50,000 क्रमबद्ध कोशिकाओं को फिर एक 24 अच्छी तरह से ट्रांस अच्छी तरह से ऊपरी सदन में इस मिश्रण डाल वाले 100 μl के साथ. निचले सदन में तो पूरा मध्यम के 400 μl डाला और 37 पर सेते हैं डिग्री सेल्सियस निचले सदन में हर दूसरे दिन मध्यम बदलें और Matrigel के अतिरिक्त 100 μl जोड़ेंहर हफ्ते या पहले अगर यह पतली हो जाती है.
5.2 vivo मॉडल में
- Reconstitute Matrigel साथ पूरा 1:01 50 μl प्रति 5,000-10,000 कोशिकाओं के एक एकाग्रता में मिश्रित मध्यम में क्रमबद्ध सेल गोली.
- प्राप्तकर्ता C57/BL6 चूहों anesthetize. एक एनाल्जेसिक के रूप में (5 मिलीग्राम / किग्रा) subcutaenously Carprofen प्रशासन. उनकी पीठ जीवाणुरहित और दाढ़ी तो पीठ के ऊपरी हिस्से में एक केंद्रीय अनुदैर्ध्य चीरा त्वचा. चीरा काफी बड़े के लिए वसा पैड इंजेक्शन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से छाला है कि इंजेक्शन के बाद रूपों साइट की पहचान होना चाहिए. कैंची के कुंद पक्ष का उपयोग करने के लिए त्वचा और छाती की दीवार के दोनों पक्षों पर करने के लिए उपयोग और दृश्य को अधिकतम वापस के बीच पाउच चौड़ा.
- माउस forelimb ऊपर और पीछे धकेलने के कंधे की हड्डी से चलती है देखने से कंधे की हड्डी के बीच सीमा को पहचानें. एक 300 μl बी.डी. इंसुलिन सिरिंज में सेल निलंबन के 50 μl लो और यह वसा पैड में सुई कंधे की हड्डी के लिए औसत दर्जे का है और पार्श्वकशेरुकाओं. आप के लिए एक छाला अन्यथा आप भी गहरी हैं देखने के लिए सक्षम होना चाहिए. दूसरी ओर तब क्लिप या सिलाई चीरा त्वचा पर एक ही दोहराएँ. चूहों की जाँच करें और Carprofen (5 मिलीग्राम / किग्रा, अनुसूचित जाति) 48 घंटे के लिए एक बार दैनिक दे.
- 3 सप्ताह के बाद, pentobarbatol (0.1 mg/0.2 सीसी, आईपी) के साथ चूहों euthanize, त्वचा के रूप में ऊपर खुला और किसी भी ऊतक संरचना का गठन किया है और हो सकता है चारों ओर बढ़ाया लापता से बचने के लिए एक सुरक्षा मार्जिन के साथ दोनों पक्षों से पूरे वसा पैड काटना. 12 पैराफिन में पीएफए और एम्बेड में ठीक. चरम देखभाल trimming और ब्लॉक को काटने के लिए नहीं बाईपास या एक संरचना की अनदेखी के दौरान नियोजित किया जाना चाहिए. सबसे अच्छा अभ्यास करने के लिए एक बार फिर एक 4 सुक्ष्ममापी टुकड़ा काट, यह एक गिलास स्लाइड पर जगह है और यह पुष्टि करने के लिए अगर वहाँ किसी भी ब्लॉक या नहीं के इस हिस्से में उपकला संरचनाओं "माइक्रोस्कोप के तहत जांच के लिए 40 सुक्ष्ममापी ट्रिम है. अगर वहाँ कुछ भी नहीं देखा है, तो एक बार और अधिक ट्रिम और इस कदम दोहराना.
6. प्रतिनिधि परिणाम
Striमाउस tracheas pping एक denuded ट्रेकिआ कि प्रकाश माइक्रोस्कोपी से दिखाई देता है के रूप में चित्र 1 ए में दिखाया में परिणाम चित्रा 1B एक ट्रेकिआ के submucosal ऊतकों और अंगूर के bunches जैसी से जारी किया जा रहा है ग्रंथियों के साथ उपकला विपठ्ठन के बाद brightfield देखने से पता चलता है. जाएगा.
Pronase ITGA6 मिलान को निकालता है और यह है कि क्यों वाहिनी TROP2 कोशिकाओं ITGA6 + और में अलग नहीं कर सकते हैं - आबादी. हालांकि, dispase, जो ITGA6 मिलान को बरकरार रखता है सभी उपकला सतह और बहुत ही कम ऊष्मायन समय के साथ भी वाहिनी कोशिकाओं, और इसलिए बेसल कोशिकाओं 3 से वाहिनी को अलग नहीं किया जा सकता हज़म. एकल कक्ष निलंबन के प्रवाह cytometry आगे तितर बितर और पक्ष तितर बितर भूखंडों है कि चित्रा 2A में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं दिखाना चाहिए. आराम से वाहिनी कोशिकाओं का अच्छा जुदाई अगर tracheal कोशिकाओं प्रवाह cytometry Trop2 एंटीबॉडी के साथ किया जाना चाहिए फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल sorti के लिए देखाएनजी (FACS) के रूप में चित्रा 2B में देखा. क्षेत्रों संस्कृति के बारे में 1 सप्ताह के बाद Matrigel में दिखाई हो सकता है और दिखने में घने हैं के रूप में 3 चित्र में दिखाया जाना चाहिए. इस प्रक्रिया की कार्यकुशलता 1-2% और एकल कक्षों के आदेश अभी भी Matrigel में उपस्थित हो जाएगा और संभावना submucosal ग्रंथि नलिकाओं कि आत्म नवीकरण के लिए क्षमता के अधिकारी नहीं से कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व. माउस submucosal ग्रंथि संरचनाओं की तरह है कि 4 चित्र दिखाए जाते हैं के गठन में वसा पैड परिणामों में वाहिनी स्टेम कोशिकाओं के इंजेक्शन. एच एंड ई धुंधला हो जाना बिना भी ब्लॉक में देखा जाता है. ये गोलाकार हैं और एक केंद्रीय लुमेन अधिकारी. कई पार वर्गों वसा पैड के माध्यम से किया जा क्रम में इन उपकला संरचना नहीं याद की जरूरत है.
चित्रा 1 tracheal उपकला के enzymatic पाचन. सतह उपकला कोशिकाओं के हटाने blac साथ दिखाया गया हैकश्मीर तीर, submucosal ग्रंथि नलिकाओं में कोशिकाओं को हटाने हरी तीर के साथ दिखाया गया है. प्रकाश माइक्रोस्कोपी से दिखाई दे रहे हैं Denuded tracheas dispase पाचन के 30 मिनट के बाद और pronase पाचन के 4 घंटे के बाद दिखाए जाते हैं.
चित्रा 2A मैं. एकल सेल माउस tracheas से प्रतिनिधि आगे तितर बितर और पक्ष तितर बितर भूखंडों दिखाने के बाद उपकला सतह विपठ्ठन निलंबन के प्रवाह cytometry. ii. माउस tracheas से वाहिनी कोशिकाओं में TROP2 अभिव्यक्ति के लिए प्रतिनिधि FACS भूखंडों.
चित्रा 2B मैं. कम माउस ट्रेकिआ दिखा प्रतिनिधि आगे तितर बितर और पक्ष तितर बितर भूखंडों के दो तिहाई से छीन सतह उपकला से एकल कक्ष निलंबन के प्रवाह cytometry. ii. ठेठ सु में ITGA6 अभिव्यक्ति के FACS साजिशउपकला rface. iii. बिखराव आगे और वापस हरे रंग में बेसल सेल की आबादी का gating दिखा सतह उपकला से पक्ष के एक अन्य प्रतिनिधि FACS साजिश. iv. ठेठ ITGA6 और TROP2 हरे रंग में सेल की आबादी व्यक्त.
चित्रा 3 क्षेत्रों के विकास के समय पाठ्यक्रम. ए वाहिनी क्षेत्रों. क्षेत्रों Matrigel में दिखाई संस्कृति के बारे में 1 सप्ताह के बाद हो सकता है और लगभग सभी उपस्थिति में घने हैं चाहिए. एकल कक्षों कि क्षेत्रों फार्म नहीं है यह भी देखा जाता है. (पैमाने बार = 50 सुक्ष्ममापी). बी बेसल क्षेत्रों बड़ा है और दिखने में luminal हैं. एकल कक्षों कि क्षेत्रों फार्म नहीं है यह भी देखा जाता है. (पैमाने बार = 50 सुक्ष्ममापी).
चित्रा 4 वाहिनी स्टेम कोशिकाओं के submucosal ग्रंथि की तरह संरचनाओं के गठन में माउस वसा पैड परिणामों में इंजेक्शन. प्रतिनिधि संरचनाओंवसा पैड में दिखाया गया है और कुछ Alcian नीले आवधिक एसिड Schiff दाग mucin (हल्का नीला) दिखाए जाते हैं.
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Discussion
इस तकनीक को वायुमार्ग से वाहिनी और बेसल कोशिकाओं को अलग airway की मरम्मत और उत्थान और airway रोगों के बारे में हमारी समझ में सुधार लाने के लिए महत्वपूर्ण है. यहाँ वर्णित तकनीक कुछ महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं. पहले अनुकूलित enzymatic पाचन अवधि है. 2 उत्तरोत्तर अधिक पण सुइयों के साथ passaging धारावाहिक सेल कर्तन को रोकने के लिए, लेकिन सेल clumps को तोड़ने के माध्यम से एक एकल कक्ष निलंबन की रचना है. 3 FACS विश्लेषण, और उपयुक्त एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं के gating है.
एंजाइमों पट्टी सतह epitopes के ITGA6 और NGFR की तरह, कुछ के रूप में, एक संभावित संशोधन के लिए एंजाइम पाचन प्रोटोकॉल को बदलने के लिए epitopes स्पेयर करने के लिए है. इस प्रोटोकॉल को भी सेल प्रकार पर मार्कर सतह विशिष्ट एंटीबॉडी फेरबदल द्वारा tracheal endothelial कोशिकाओं या अन्य mesenchymal कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
वाहिनी और बेसल कोशिकाओं के विभाजन की सीमाओंहमारे एक सतह मार्कर बेसल कोशिकाओं और सतह उपकला विपठ्ठन और कुछ बेसल कोशिकाओं को पीछे छोड़ने की संभावना के लिए जरूरत से वाहिनी कोशिकाओं भेद की मौजूदा कमी से संबंधित है. वाहिनी कोशिकाओं के लिए विशेष रूप से सतह मार्करों का भविष्य पहचान इस प्रक्रिया को आसान बनाने के लिए और सतह उपकला विपठ्ठन के लिए जरूरत नहीं रहेगी. यह भी शुद्ध बेसल सेल की तैयारी के लिए कम ट्रेकिआ के दो तिहाई का उपयोग करने की आवश्यकता नकारना होगा.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम ब्रॉड स्टेम सेल रिसर्च सेंटर FACS को स्वीकार करते हैं और विशेष रूप से उनकी मदद के लिए सेल छँटाई के साथ जेसिका स्कोल्स और Felicia Codrea धन्यवाद करना चाहते हैं. काम सीआईआरएम RN2 - +००९०४ 1, HL074229 K08, अमेरिकन सोसायटी छाती रोगों / सीओपीडी फाउंडेशन एटीएस - 06 ०६५, चिंता फाउंडेशन, UCLA Jonsson व्यापक कैंसर केंद्र छाती रोगों कैंसर विज्ञान कैंसर कार्यक्रम / फेफड़े बीजाणु, कैलिफोर्निया कैंसर के विश्वविद्यालय द्वारा वित्त पोषित किया गया था अनुसंधान समन्वय समिति और Gwynne Hazen चेरी मेमोरियल लेबोरेटरीज (बीजी).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Complete medium 10: DMEM-F-12 , 50/50, 1X) |
Mediatech | 15-090-CV | |
| Hepes (15 mM) | Invitrogen | 15630 | |
| Sodium bicarbonate (3.6mM or 0.03%) | Invitrogen | 25080 | |
| L-glutamine (4 mM) | Mediatech | 25-005-Cl | |
| Penicillin (100 U/ml) | Mediatech | 30-001-CI | |
| Streptomycin (100 μg/m) | Mediatech | 30-001-CI | |
| Insulin (10 μg/ml) | Sigma | I6634 | |
| Transferrin (5 μg/ml) | Sigma | T1147 | |
| Cholera toxin (0.1 μg/ml) | Sigma | C8052 | |
| Epidermal Growth Factor (25 ng/ml) | BD | 354001 | |
| Bovine Pituitary Extract (30 μg/ml) | Invitrogen | 13028-014 | |
| Fetal Bovine Serum (5%) | Fisher | SH3008803HI | |
| Retinoic acid (0.05 μM) | Sigma | R2625 | |
| Growth Factor Reduced Matrigel | BD | 354230 | |
Table 1. Complete media components. |
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| Pronase | Roche | 10165921001 | Used at 0.15%: -o/n at 4 °C digestion to isolate total tracheal cells (for ALI culture) -4 hr digestion 4 °C to isolate SMG |
| Dispase | BD Biosciences | 354235 | Used at 16 Units: 30 min at RT |
| DNase I | Sigma | DN25 | Used at 0.5 mg/ml: 20-30 min at RT |
Table 2. Enzymes used for enzymatic digestion of the trachea. |
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References
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