Summary
重要的是理解大脑功能和指导安置途径示踪染料神经反应的电特性。然而，许多研究都在麻醉动物。理解没有麻醉药的脑功能，我们开发了一种方法来记录神经元的反应特性，并在清醒小鼠注入染料。
Abstract
这是众所周知的麻醉，神经反应特性改变在大脑的不同区域。13。在听觉系统，脑干神经元，包括阈值，频率特异性，抑制边带根本性的响应特性，在麻醉下1-2显着的方式被改变。这些观察提示生理学家设法从单个神经元的记录，没有麻醉的污染影响。其结果之一是去大脑的准备，完全是在中脑4水平横断脑干。该制剂的弊端，是一项艰巨的手术，消除降的预测从脑，无法用感官刺激，检查以上的脑结构。不同的策略已植入电极阵列，长期记录单个神经元和多单元集群，而动物是清醒和/或行为5,6 10-12蝙蝠7-9头部约束技术。使用这种方法，我们能够在麻醉的小鼠进行了几天的电生理记录。我们可以在录音结束，然后注入一种染料，重建电极位置和记录点，或注入示踪剂，所以可确定，并从记录位点的途径。这种方法无需使用麻醉剂以及隔离多天的单神经元记录。
Protocol
1。头部约束概述
- 组装一个定制的头后 ，插入1/16“不锈钢辊针直刺入钻了一个洞在3/32”不锈钢杆形成一个十字架。头后的垂直一块应该是约20毫米和跨一块约15毫米的水平。点击垂直杆的一端接受＃1-72螺钉。 （ 图1）。
- 在手术过程中及录音，头后固定在一个定制的黄铜或铝安装酒吧 ＃1-72螺丝（ 图2）。安装杆的长片，应该是约90毫米长和宽5-10毫米。适合对开长条，角度为45度15毫米扩展成槽切头后。为了防止头部转动，头部后紧贴横梁上安装杆底部的小槽。
- 越来越多的酒吧，然后连接到一个特制的铝安装集团K（ 图3）。安装块大约为30毫米×30毫米×25毫米。这种安装块附着到微操作机器人，使头后的位置，可以准确地沿中线放置于前囟门。两件一起安装用螺丝安装块。一个块中切出允许安装杆滑动，并用螺钉固定。安装酒吧台面平行。在录制过程中，争取在一个定制的立体框架（ 图4）酒吧。设计stereotax是安装在相同的位置在手术过程中在安装块吧。这样的安排，确保鼠标将始终对准跨越实验会话立体框架。
- 钨棒（直径0.010“），以削减约5毫米的长度，约1毫米弯曲45°。这杆为接地脚（ 图1）。
2。立体铝ignment为开颅手术
注意：下面列出的所有程序按照标准的无菌手术技术已经由华盛顿州立大学动物护理和使用委员会和加尔文研究所动物伦理委员会批准。
- 在感应室内放置5％异氟醚麻醉的小鼠。尾巴和/或脚趾掐反应缺乏确保该动物是完全麻醉。
- 将鼠标鼠标适配器（Stoelting）的装备在啮齿类动物立体框架。鼠标的方向正确，将里面的牙齿咬栏孔，并拧紧，所以它是紧贴鼻夹。将鼠标作为直咬酒吧和鼻钳可能。将制成的乳胶手套，一块鼠标的鼻子，口罩，并保持在5％的异氟醚，直到鼠标的呼吸率约为1呼吸/秒。关闭异氟醚1.5 - 2.0％。固定头，采用t他耳酒吧小心不要刺破耳膜。酒吧应该是贴身但不渗入耳道太深。
- 鼠标下方放置一个加热垫。
- 申请眼药膏，以防止眼睛干燥。
- 剃的头皮之间的耳朵小剃须刀或细点的剪刀眼睛。
- 清洗和消毒氯碱hexidine（或优碘），然后用酒精擦洗冲洗3次重复擦拭头皮。
- 来打开颅骨顶部的皮肤做一个切口，沿中线从后脑勺眼睛。
- 用手术刀刮去骨膜切口边缘。 （根据实验目标）如果需要的话，仔细地收回镊子颈部背面的肌肉，使肌肉沿束撕裂，以减少出血。适用于头皮组织下面的明胶海绵，以减少水分，防止皮肤从头骨。
- 干颅骨表面用棉签蘸异丙醇，以提高可视化颅骨地标。
- 将头骨标准立体坐标13。罚款点探针插入电极支架和重视它的立体定向显微操作。一个尖锐的金属棒工作以及为此目的（ 图5）。
- 使用点，以确定头骨上的囟门（ 图5A）和Lambda（ 图5B）。这些点之间来回移动探头，检查每个位置的内侧外侧不超过50微米的坐标不同。需要仔细松动耳酒吧，横向转移的头部和耳朵酒吧，并重新拧紧耳酒吧定位头部。
- 确认在每个位置的背腹的高度不超过50微米的不同。调整鼻钳的高度，这将旋转轴耳酒吧周围的头骨，平的头骨，如果有必要的间距。耳杆的高度，可能还需要进行调整。
- 使用地图集13日确定利益的目标（ 图5C）相对囟坐标。上述目标的头骨（例如，一个“X”标记，或用墨汁点四方形的角落）将开颅手术（ 图5D）。
3。头后和接地引脚安装
- 使用蚀刻凝胶清洁头骨。使用撒施擦洗和遍布表面蚀刻胶（10秒）。用清水洗净，完全晾干。适用底漆牙科水泥颅骨表面采用撒施。传播新喷头的粘合剂。固化胶UV光枪（1周期）。
- 选择一个远端目标站点的接地引脚的位置。孔在地面p的短端使用一个＃65 miniblade手术刀的一角，也足够宽头骨仔细一小孔在进入和休息后，脑膜。接地引脚应为导向，以便它指向前囟门和未来的头后（ 图6A）。
- 头后固定安装的酒吧和封锁和附加的微操作机器人。移动的微操作机器人在三个层面上，定位在头后，前囟门刚刚接触的头骨（ 图6B）。基地的头后应该趴在颅骨平。
- 使用解剖探头，适用于头后和接地引脚（ 图6C），周围有少量的牙科水泥。按水泥，以确保良好的接触与头骨。注意：不要使用过多的水泥或不会变硬均匀。防治紫外光枪（3-4周期从多个角度）的水泥。
- 适用于水泥的第二阶段和周围的头部后建立的基础和覆盖的头后的沟槽（ 图6D）。
4。开颅手术
- 找到了开颅手术的参考标志，这将部分底漆掩盖。使用65＃手术刀，以纪念3毫米×3平方毫米围绕这个站点和应用利多卡因下降，降低灵敏度，以减少出血。
- 使每个广场的一侧（多达10个）多得分，小心不要通过骨骼和削减到大脑（ 图7A）。
- 一旦骨瓣松动，使用手术刀的一角撬起来，离开硬脑膜完好（ 图7B）。
- 用骨蜡覆盖。
5。手术后
- 关闭气体麻醉和从鼠标的立体框架。
- 用棉签申请周围裸露的皮肤利多卡因软膏，以缓和伤口周围的轰动。使用另一种棉签应用抗生素软膏裸露的皮肤。注入酮洛芬（5毫克/公斤的IM或IP基于个人IACUC兽医偏好的）手术后镇痛。鼠标一般会和天然气停止分钟内移动。
- 将鼠标在一个温暖的笼子和显示器直到它准备返回到动物的住房。
- 动物应每天检查至少一次后，它已经从手术中恢复。观看不良的饮食和/或饮酒和无精打采行为的迹象。如果怀疑疼痛，直到缓解酮洛芬每24小时（在手术后相同剂量）。利多卡因局部可应用的伤口，如果动物被刮伤或显示不适的迹象。动物一般恢复手术，无并发症或疼痛。
6。录音和染料注射液
- 等待后，头部手术后至少一天前使用鼠标录音。
- 塑造地方在泡沫束缚设备的鼠标鼠标的身体。鼠标已经被改编到该设备，从而减少其焦虑。典型的适应断奶后大约一个星期前，手术和实验小鼠每天处理，放置在发泡设备鼠标，时间为1-5分钟。暂停在立体框架（ 图4）的设备。
- 安全的头后安装吧，这是现在固定的立体框架（ 图4）。
- 用生硬的22号注射器针头尖端终止线连接到接地引脚。
- 在开颅取出骨蜡。取出硬脑膜如果有必要使用一个miniblade手术刀尖端。
- 驱动电极，以适当的立体位置，并开始录制（ 图8）。只有电生理记录，各种电极都可以使用。电极的选择是需要录音的位置和类型的依赖。清醒鼠标录音电极的选择将是什么研究员在麻醉鼠标使用相同。对于合并的电生理记录染料/示踪剂注射，微量电极使用10。微量充满染料/示踪剂的选择，以便它可以被微电泳注入的电生理实验结束。电极也可用于多管，这样可以药理操纵。多管电极安装在一个单一的录音微量（ 图8）。这些技术标准文献和麻醉与清醒的录音是不是不同。
- 录音可为4-5个小时，连续超过3-4天。
- 在录制会议结束时，染料/示踪剂可以注射。因为有没有在大脑疼痛受体，离子导入或进入大脑的染料示踪注射是不可能造成的不适。然而，一次注射是该地区的电反应特性的特点，动物，可能是麻醉异氟醚f或注射。这将消除任何潜在的不必要的感觉。因为染料/示踪已经在微管，可以主动和地线接通的电生理记录设置的电流发生器，微电泳注入染料/示踪。使用适当的协议，在电极的染料/示踪。删除从headpost克制和身体克制的动物，并返回到其家乡笼。
- 在实验结束后，按照适当的协议安乐死和组织处理，以恢复注射部位和标签。
7。代表结果
成功安装的头后，允许实验者记录单，多单元的响应，从麻醉的，清醒的鼠标多天。约束系统可以稳定在大脑中单个神经元的电生理记录。极好的隔离单的单位和强烈反响ţØ刺激，可记录多天从相同的大脑结构，例如在小鼠下丘（ 图9A，日图9B，一天两）。带了一个好头安装后，将始终对准每个鼠标的立体定位仪和鼠标立体定向图谱，13，特别是脑细胞的可靠定位。这个可靠的定位，使染料和示踪剂注入后多个录音天的具体结构。例如，评估降预测从听觉中脑听觉脑干，生物素葡聚糖胺（可视作为chromagen使用的二氨基联苯胺）后，在注射部位的神经元的反应特性电生理识别，可以注射到小鼠下丘（ 图10A） （ 图10A，一个神经元与最佳频率为51千赫），组织处理后，对侧耳蜗核背侧nterograde标签可以被可视化和策划（ 图10B）。显微照片也可以得到更高的分辨率，查看顺标轴突和终端（ 图10C）。
图1。
图2。
图3。
图4。
图5。
图7。 
图8。 
图9。 
图10。
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Discussion
后头部约束系统的电生理及神经解剖实验小鼠的优势是可以进行麻醉的，清醒小鼠实验，消除潜在的响应由于麻醉药品的污染。此外，一套最多可以使用多天，以便更有效地使用动物。
头后的大部分组件是可用的现成的。只有头部后和安装设备的定制，这两者是相对简单的建设，是可以重复使用。如果一台机器的店是不是在一个机构，研究者可能使用http://www.emachineshop.com/编造的必要组成部分。
熟练的手术技巧是必要的。外科医生必须熟练精细的手术技术，其中一些最好做显微镜下。 “手术必须在无菌条件下进行。去除颅骨瓣的过程中最微妙的点。颅骨瓣仔细，轻轻地用手术刀沿矩形的4个方面寻找，而通过手术显微镜的多个分数，可以“弹出”以最少的流血，留下完整的硬脑膜。熟悉底层的血管是必不可少的，作出以上的大血管切造成不良出血的危险。因为我们的听觉系统的研究重点，我们已经避免使用钻头进行开颅手术，以减少骨进行内耳外伤的潜力。
重要的是要得到立体对准连接头后前前后飞机的水平和。这种防范措施，确保头将保持整个实验试验水平和促进脑用脑图谱的位点的位置。
帐篷“>录音，它是有用的，在手术前几天，每天处理的鼠标。刚刚暴露在泡沫设备处理和克制的鼠标，有利于大大降低应力和运动更长的录音鼠标。关键是有鼠标适合紧贴在泡沫夹心。如果过分动物可以移动，它往往不断奋斗。如果鼠标开始奋斗，这是最好的终止录制会议和回升，未来这些日子。在不受刺激诱发的录音biopotentials鼠标的运动。一般都是更大的振幅，是间歇性的动作电位和运动工件，也可通过录音线接触动物产生重要的是以确保有没有电线接触的动物。总体而言，这项技术已经允许我们进行多个研究听觉处理和解剖，没有使用麻醉药。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
0920060 NSF资助，NIH资助DC004395 NHMRC赠款1009482，科学和医学研究的新南威尔士州办事处，加内特过时和罗德尼·威廉斯纪念基金会的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Etch gel for cleaning skull prior to dental cement | Henry Schein | 101-5396 | 12/pk with 1.2 mL syringes |
| Primer for dental cement | Kerr Optibond | 25881 | 8 mL bottle |
| Adhesive for dental cement | Kerr Optibond | 25882 | 8 mL bottle |
| Applicators for dental cement | Kerr Optibond | 24680 | 200/pk |
| Dental Cement | Charisma, Heraeus Kulzer | 66000085 | 4gm Syringe Refill |
| Tungsten Rod (Ground Pin) | A-M Systems | 717200 | 0.010" diameter |
| Economy UV Curing Light | Henry Schein | CU-80 | |
| Head-post | Built in-house | ||
| Mounting bar | Built in-house | ||
| Mounting block | Built in-house | ||
| Stereotaxic Frame | David Kopf Instruments | 902 | |
| Mouse and Neonatal Rat Adaptor | Stoelting Co. | 51625 | |
| Deltaphase Isothermal Pad | Braintree Scientific, Inc. | 39DP |
References
- Evans, E. F., Nelson, P. G. The responses of single neurones in the cochlear nucleus of the cat as a function of their location and the anaesthetic state. Exp. Brain Res. 17, 402-427 (1973).
- Joris, P. X. Response classes in the dorsal cochlear nucleus and its output tract in the chloralose-anesthetized cat. J. Neurosci. 18, 3955-3966 (1998).
- Populin, L. C. Anesthetics change the excitation/inhibition balance that governs sensory processing in the cat superior colliculus. J. Neurosci. 25, 5903-5914 (2005).
- Young, E. D., Brownell, W. E. Responses to tones and noise of single cells in dorsal cochlear nucleus of unanesthetized cats. J. Neurophysiol. 39, 282-300 (1976).
- Donoghue, J. P. Contrasting properties of neurons in two parts of the primary motor cortex of the awake rat. Brain Res. , 333-3173 (1985).
- Westby, G. W., Wang, H. A floating microwire technique for multichannel chronic neural recording and stimulation in the awake freely moving rat. J. Neurosci. Methods. 76, 123-133 (1997).
- Suga, N., O'Neill, W. E., Manabe, T. Cortical neurons sensitive to combinations of information-bearing elements of biosonar signals in the mustache bat. Science. 200, 778-781 (1978).
- O'Neill, W. E., Suga, N. Target range-sensitive neurons in the auditory cortex of the mustache bat. Science. 203, 69-73 (1979).
- Suga, N., O'Neill, W. E., Manabe, T. Harmonic-sensitive neurons in the auditory cortex of the mustache bat. Science. 203, 270-274 (1979).
- Portfors, C. V., Felix, R. A. 2nd Spectral integration in the inferior colliculus of the CBA/CaJ mouse. Neuroscience. , 136-1159 (2005).
- Felix, R. A. 2nd, Portfors, C. V. Excitatory, inhibitory and facilitatory frequency response areas in the inferior colliculus of hearing impaired mice. Hear Res. 228, 212-229 (2007).
- Portfors, C. V., Jonson, K. G., Roberts, P. D. Over-representation of species-specific vocalizations in the awake mouse inferior colliculus. Neuroscience. 162, 486-500 (2009).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , 3rd edn, Academic Press. NY. (2007).
