Summary
朊蛋白（PrP的一新种
Abstract
朊病毒疾病的发病机制中的中心事件涉及的主机编码朊蛋白PrP的Ç转换成其致病亚型的PrP Sc的1。朊蛋白C是水溶性清洁剂和敏感的蛋白酶K（PK）消化的PrP Sc的 ，而形成不溶于洗涤剂的聚集和部分耐PK 2-6。朊病毒Ç的PrP Sc的转换是已知涉及的构象的蛋白的β-折叠片结构的α-螺旋结构的过渡。然而， 在体内的途径仍然是知之甚少。暂定内源性的PrP Sc的 ，中间的PrP *或“沉默的朊病 毒”，在未受感染的大脑还没有确定。
使用相结合的生物物理和生物化学的方法，我们发现不溶性的朊蛋白的Ç聚集（IPRP C）未感染的哺乳动物的大脑和培养的神经元单元8，9。在这里，我们将详细介绍这些方法的程序，其中包括超速离心法在洗涤缓冲液，蔗糖步骤梯度沉降，尺寸排阻色谱法，IPRP富集基因5蛋白（g5p）特异性结合的结构改变的PrP表格10，和PK-处理。这些方法的组合隔离：不仅不溶性的PrP Sc和朊病毒Ç聚集体，但也可溶性蛋白Ç从正常人类大脑的低聚物。由于这里描述的协议已被用于从受感染的大脑和未感染的大脑IPRP C的隔离双方的PrP Sc的 ，他们为我们提供了一个机会，比较两种异构体之间的物理化学特性，神经毒性，传染性。这样的研究将大大提高我们了解蛋白质病原体的感染。生理学和病理生理学IPRPÇ目前还不清楚。值得注意的是，在一个新的-id的可变entified人类朊病毒疾病被称为蛋白酶敏感的prionopathy，我们发现了一个新的PrP Sc的共享的免疫反应行为IPRP C 11，12和碎片。此外，我们最近表明，IPRP C是主要品种，与β-淀粉样蛋白在阿尔茨海默病13互动。在相同的研究中，这些方法被用来隔离Abeta聚合物和低聚物，在阿尔茨海默氏病13，提示它们的其他神经退行性疾病中涉及的非朊病毒蛋白聚集体中的应用。
Protocol
1。脑匀浆的制备和洗涤剂可溶性（S2）和不溶性的（P2）的馏分
- 取100毫克冷冻人脑组织中，并加入100μl裂解缓冲液中（10mM Tris，150mM的NaCl，0.5％NONIDET P-40（NP-40），0.5％EDTA，pH7.4）中。
- 均质在冰上，用杵由无绳马达驱动，在干冰中冷冻它为5分钟，并再次均质它使用杵先用手驱动，然后由马达，并加入300μl或800微升的裂解缓冲液（这是20 ％或10％总脑匀浆，分别）。
- 以1,000 xg离心10分钟，在4℃下，收集上清液（S1），用台式离心机离心20％或10％的总的脑匀浆。
- 超速离心机在4℃下1小时，在35,000转（100,000 xg离心）在SW55转子（Beckman Coulter公司，富勒顿，加利福尼亚州）的10％S1 （S2）的上清液转移到一个干净的试管中包含的洗涤剂可溶部分。重悬含有洗涤剂不溶性的颗粒馏分（P2）在100μl或200μl的裂解缓冲液中，使10 - 或5倍浓缩的制剂。
- PK消化，与相同量的PK孵育样品在50微克/毫升，在37℃下为1小时，S2和P2馏分。苯甲基磺酰氟添加至终浓度为5 mM的和相等体积的SDS样品缓冲液（3％SDS，2mM EDTA的，4％β-巯基乙醇，10％甘油，50mM的Tris，pH值6.8）终止的PK消化。煮沸10分钟的样品，并在室温下冷却5分钟。他们已经准备好为西方墨点法。
2。在蔗糖密度梯度的速度沉降
- 孵育450微升20％S1，用等体积的在冰上30分钟，在H 2 O 2％肌氨酸。
- 加入0.5毫升的60％，30％，25％，20％，15％，和10％的蔗糖成具有最大的5毫升容量的Beckman管。
- 将0.4毫升S1到10-60％的蔗糖密度梯度的顶部。
- 离心48000转（200,000 XG，SW55转子）1小时后，在4°C。
- 收集283微升馏分，各从管的顶部和获得总共12馏分。
- 20μl的每个级分取到新的Eppendorf管中，加20μl样品缓冲液中，煮沸10分钟。
- 酷样品遮光罩4分钟，1分钟和涡他们在1,000 xg下离心。装入样品到预铸凝胶。
3。尺寸排阻色谱法
- 使用Superdex 200 HR珠（Pharmacia公司，Uppsala，瑞典）中的1×30厘米柱，以确定的PrP分子的寡聚状态。
- 七分子量标记物（Sigma公司，圣路易斯，MI），包括葡聚糖蓝（2,000 kDa的），甲状腺球蛋白（669 kDa的），脱铁铁蛋白（443 kDa的），β-淀粉酶（200 kDa的），乙醇脱氢酶（150 kDa的），白蛋白（ 66 kDa的），碳酸酐酶（29 kDa）的独立装载的浓度由Sigma 200微升样品量的建议。
- 蓝色DEXT的洗脱体积然是用来确定的空隙体积（V 0 = 8.45毫升），总体积（ 的 V t = 24毫升）中所提供的产品的指令。峰的洗脱体积（V E）计算出的色谱图和分数保证金。 K表AV的分配系数（定义样的行为），计算公式：K AV =（V E - V-0）/（V T - V 0）。的校准曲线来确定通过绘制针对日志兆瓦的标准8的蛋白质标准的K AV。
- 分子量（MW）是在不同的FPLC馏分回收的各种的PrP物种根据与各种标准的凝胶过滤生成的校准曲线进行评价。
- 注入200μl的裂解缓冲液中含有1％肌氨酸成的列的每个运行中的S1。
- 在FPLC系统（GE Healthcare公司）的流速为0.25毫升/分钟和馏分进行色谱s的0.25毫升收集的一小部分收集器（Amersham Biosciences公司，RediFrac）。
- 孵育0.125毫升各馏分用0.5毫升预冷的甲醇在-20℃下2小时。
- 离心样品在13,000 xg离心30分钟，在4℃下在台式的离心。弃去上清液，将沉淀重悬于在20μl如上述的SDS样品缓冲液，煮沸10分钟，冷却至室温，将它们加载到一个预制凝胶。
4。捕获的PrP G5p以
- G5p以分子（100微克）（请提供由英国朴次茅斯大学的博士。杰夫Kneale和约翰·McGeehan）是共轭7×10 8对甲苯磺酰基活化磁珠孵化100的微克g5p和中加入350μlg5p珠1毫升的磷酸盐缓冲盐水（PBS），在37℃下20小时。 Eppendorf管的侧壁外部的磁力吸引G5p以珠，然后删除所有的解决方案。洗净珠，用1ml的PBS中含有0.1％牛血清白蛋白（BSA）为三次。
- 孵育g5p共轭珠在1毫升的0.2M Tris-盐酸，pH为7.4，含有0.1％BSA，37℃下5小时，以阻断非特异性结合，然后洗珠，用1ml的PBS中含有0.1％BSA的三次，如上所述。移除该溶液，并加入1毫升的PBS成珠。所制备的g5p珠为至少3个月是稳定的，在4℃下
- 捕获的PrP G5p以进行孵育100μl的S1馏分或P2与60微升g5p共轭珠（10微克蛋白质/ 6×10 7珠）在1毫升的结合缓冲液（3％的Tween-20，3％NP 40在PBS中，pH值7.5）。
- 孵育后，在室温下的3小时的恒定的旋转，含有的PrP G5p以珠被吸引到Eppendorf管的侧壁上，通过外部的磁力，允许所有未结合的分子在溶液中容易地取出。
- 继洗涤三次在洗涤缓冲液（2％Tween-20和2％NP-40在PBS中，pH值为70.5），G5p以珠被收集，并加热，在95℃下为5分钟在SDS样品缓冲液（3％SDS，2mM的EDTA，10％甘油，50 mM Tris-盐酸，pH为6.8）。
- 样品冷却后，在室温下5分钟，将样品离心分离以1,000 xg离心5分钟，在室温下。上清液准备Western印迹。
5。蛋白质印迹
- 负载样品在SDS样品缓冲液中煮沸15％的Tris-HCl判据的预制凝胶（Bio-Rad公司）上，在150 V〜80分钟。
- 2小时，将凝胶上的蛋白转移到PVDF 70V。
- 封闭后的膜在5％牛奶的Tris盐缓冲液含有0.01％Tween-20（TBS-T），将膜孵育2小时，在室温下用初级单克隆抗体或多克隆抗体3F4（1:40,000），1E4（1 1000），抗-N 8（1:6,000），或抗-C 8（1:6,000）进行探测的PrP分子。
- 与HRP标记的羊抗小鼠IgG温育后在1:3000，或驴抗兔IgG在1:3,000的PrP频带柯达膜用ECL Plus可视化，在根据制造商的协议。
6。代表性的成果
偶发性CJD的样品相比，在P2馏分检测IPRPÇ少量的在正常的大脑，虽然大多数的PrPÇ在S2的部分（ 图1）回收。正如前面所指出的8，IPRP帐户的约5-25％的总的PrP包括全长度和N-端截短的物种。
分析用蔗糖的步骤梯度沉淀透露，而大部分的PrPÇ非克雅二氏症的大脑中回收的顶端部分1-3，少量的PrP也被检测到的底部部分9-11，通常含有大量聚集（ 图2）。
各种的PrP Sc的物种范围ING从单体，小的低聚物更大的聚集体进行分离，凝胶过滤在大脑中与克雅氏病（ 图3A）。然而，正常的大脑的不溶组分（ 图3C）中也检测到少量的较大的聚集体的分子量大于2000 kDa的。此外，二聚物和四聚物的PrPÇ不仅检测不溶组分，而且在可溶性级 分（ 图3B和3C）。
PK和PNGase治疗后，G5p以所捕获的PrP与1E4抗体检测对PrP97-105 8。三PK性的核心片段，称为PrP的朊病 毒* 19，和PrP * 20，* 7〜20 kDa的，〜19 kDa的〜7 kDa的，分别为（ 如图4所示 ，左图）进行了检测，迁移。然而，没有被检测到的PrP时，1E4抗体预孵育的合成肽具有序列中身份ICAL 1E4的抗原表位（ 图4中 ，中间面板），表明检测1E4的频带是PrP的片段。此外，抗-C抗体揭示了两种不同的朊蛋白片段〜18 kDa的迁移（PRP * 18）〜12-13 kDa的“（PrP-CTF12/13），除了对朊病毒* 20（ 图4，右图）。
图1。IPRP C和IPRP SC的检测。 PNGase（糖肽酶）F在反应总体积的1/10，在37℃下1小时的处理后，以除去蛋白，全长或N-端截短PrP的物种中的可溶性和不溶性组分（S2和P2）孤立聚糖对PrP23-40（中间面板），正常对照组（CTL）和零星的克雅氏病（SCJD）的脑组织标本中检测到的超速离心3F4对PrP106-112（左），抗-N，和对朊蛋白的抗-C220-231（右图）。在CTL的样品中，有少量的PrP P2中被检测到，而大量存在在S2中。相反，更多的PrP P2中检测比S2 SCJD样品。
图2。蔗糖密度梯度离心沉淀的PrP。 PRP在个人分数从1到11的非CJD脑样品S1检测Western印迹3F4的。虽然大多数的PrPÇ中的顶级馏分1-3检测到，少量的PrP也观察到了在底部馏分9-11。此外，从顶部和底部的带型的PrP是不同的朊蛋白的顶部部分恢复上带的主导，而PrP的恢复的底部分数的一个占主导地位较低的带。一个PK处理的PrP Sc为加载控制右侧的印迹。
图4。G5p以富硒准备从正常人类大脑的各种抗PK-IPRP片段的检测。 G5p以富集样品与PK和PNGase F处理之前，Western印迹探测1E4（左面板），1E4预孵育有1E4抗原表位（中间面板）相同的序列的合成肽，和抗-C（右图）。 1E4检测到的三个PK抗性的PrP片段称为朊病毒* 20的PrP * 19，和PrP * 7（左面板）。朊病毒水库阻断1E4与肽后，没有进行检测（中间面板），表明检测到的频带与1E4 PrP的片段。抗-C发现除了PK抗朊蛋白片段称为PrP的18和PrP-CTF12的/13，除了朊病毒* 20。
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Discussion
报告相结合的办法，隔离始终不溶性的朊蛋白的Ç聚集和可溶性PrP的Ç从正常的人脑的低聚物。超速离心法是一个典型的方法，该方法已被广泛用于从可溶的PrP C 14的分离的不溶性的PrP Sc的一小时以100,000 xg离心。虽然它是有效的，其中之一的注意事项是拉离心分离后的上清液（S2）过程中，以避免污染。 IPRPÇ是不同的朊蛋白凝胶调，这是不可能的朊蛋白检测在P2部分造成污染的S2。蔗糖梯度沉淀实验已被用于分离不同的PrP Sc的物种基于它们的密度，尺寸和形状15。我们已经注意到了，这一部分12通常包含一些粒子可能使这部分不负责任的。分数往往是一个包含的的greates的吨的PrP金额之间的馏分收集了8。的分子量（MW）的各种的PrPÇ构象，其特征还在于，使用凝胶过滤法（也被称为尺寸排阻色谱法）。我们首先生成一个校准曲线与7的分子量标记物（数据未示出），然后检查在正常对照组和SCJD患者大脑的MW的PrP。我们注意到，少量的PrP可能与细胞碎片一起沉淀的制备过程中的S1的馏分。为了提高回收率，应均匀化以及脑组织和脑匀浆中的肌氨酸的解决方案的孵化应延长半小时或一小时，在4°C。 IPRPÇG5p以捕获虽然没有体积的限制，我们建议使用60至80微升珠子和100到200微升样品，每个实验。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
“ 作者感谢提供正常的脑组织样本的人的大脑和脊髓液资源中心（洛杉矶，CA）。这项研究是支持由美国国家卫生研究院（NIH）R01NS062787，的克雅氏病基金会，联盟生物安全，以及在大学中心老化和健康的支持麦格雷戈基金会和总统的全权委托基金（Case Western Reserve大学） 。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | 72 mM in 2-propanol |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | 2 mg/ml in H2O |
| PNGase F | New England Biolabs | MWGF200 | |
| Ultracentrifuge LE-80K, SW55 rotor | Beckman Coulter | Part No. 365668, 356860 | |
| Superdex 200 HR beads | GE Healthcare | 17-1088-01 | |
| AKTA FPLC system | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
| Molecular weight markers | Sigma-Aldrich | MWGF200 | Varied |
| Dynabeads M-280 magnetic beads | Invitrogen | 143-01 | |
| 3F4 antibody | Covance | SIG-39600 | |
| 1E4 antibody | Cell Sciences | M1840 | |
| Ready gel 15% Tris-HCl pre-cast gels | Bio-Rad | 345-0020 |
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