Summary
Een nieuwe soort cellulaire prion eiwit (PrP
Abstract
De centrale gebeurtenis in de pathogenese van prionziekten omvat een omzetting van de gastheer gecodeerde prion eiwit cellulair PrP C in zijn pathogene isovorm PrP Sc 1. PrP C is detergent-oplosbaar en gevoelig voor proteinase K (PK)-spijsvertering, terwijl PrPSc vormt detergent-onoplosbare aggregaten en is gedeeltelijk resistent tegen PK 2-6. De omzetting van PrP C PrP Sc bekend is dat conformationele overgang van α-β naar helix-sheet structuur van het eiwit omvatten. Echter, de in vivo route nog slecht begrepen. Een voorzichtige endogene PrPSc, intermediair PrP * of "stille prion", moet nog worden vastgesteld in de niet-geïnfecteerde hersenen 7.
Met behulp van een combinatie van biofysische en biochemische methoden, we onoplosbare PrP C aggregaten (aangeduid iPrP C) geïdentificeerd van niet-geïnfecteerde zoogdieren hersenen en gekweekte neuronalecellen 8, 9. We beschrijven gedetailleerde procedures van deze methoden, waaronder ultracentrifugatie in detergens buffer, sucrose stapgradiënt sedimentatie, size exclusion chromatografie, iPrP verrijking door gen 5-eiwit (G5p) die specifiek binden aan structureel veranderde PrP vormen 10 en PK-behandeling. De combinatie van deze methoden isolaten niet alleen onoplosbare PrP Sc en PrP C aggregaten ook oplosbare PrP C oligomeren van de normale menselijke hersenen. Aangezien de protocollen hier beschreven zijn gebruikt om zowel PrP Sc isoleren van geïnfecteerde hersenen en iPrP C uit ongeïnfecteerde hersenen, ze ons de mogelijkheid om verschillen in fysisch eigenschappen, neurotoxiciteit, en infectiviteit tussen de twee isovormen vergelijken. Een dergelijk onderzoek zal sterk verbeteren van ons begrip van de besmettelijke eiwitachtige pathogenen. De fysiologie en pathofysiologie van iPrP C zijn onduidelijk op dit moment. Met name in een nieuw identified menselijke prionziekte genoemd variabel protease-gevoelige prionopathy, vonden we een nieuwe PrPSc dat de immunoreactieve gedrag en fragmentatie met iPrP C 11, 12 deelt. Bovendien hebben we recent aangetoond dat iPrP C is de belangrijkste soorten die interageert met amyloid-β-eiwit in Alzheimer disease 13. In dezelfde studie werden deze methoden om Abeta aggregaten en oligomeren isoleren ziekte van Alzheimer 13, suggereert de toepassing ervan niet prion eiwit aggregaten betrokken bij andere neurodegeneratieve aandoeningen.
Protocol
1. Bereiding van hersenhomogenaat en Detergent oplosbaar (S2) en onoplosbaar (P2) Fractions
- Neem 100 mg bevroren menselijk hersenweefsel en voeg 100 ul lysis buffer (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5% Nonidet P-40 (NP-40), 0,5% EDTA, pH 7,4).
- Meng op ijs met stamper aangedreven door een motor draadloze, bevriezen in droog ijs gedurende 5 minuten en opnieuw gehomogeniseerd met behulp stamper aangedreven door handen en vervolgens door een motor, en voeg 300 ul of 800 ul lysis buffer (dit is ofwel de 20 % of 10% totale hersenhomogenaat, respectievelijk).
- Centrifugeer van 20% en 10% totale hersenhomogenaat bij 1000 g gedurende 10 min bij 4 ° C tot supernatant (S1) met een benchtop centrifuge verzamelen.
- Ultracentrifuge 10% S1 bij 35.000 rpm (100.000 xg) in een SW55 rotor (Beckman Coulter, Fullerton, CA) gedurende 1 uur bij 4 ° C. Breng de supernatanten (S2) de detergent-oplosbare fractie in een schone buis bevatten. Resuspendeer de pellets die bevatten detergent-oplosbarefractie (P2) in 100 ul of 200 ul de lysis buffer tot 10 maken - of 5-voudig geconcentreerd preparaat.
- Voor PK-digestie incuberen van het monster met dezelfde hoeveelheden PK bij 50 ug / ml bij 37 ° C gedurende 1 uur voor zowel S2 en P2 fracties. Voeg fenylmethylsulfonylfluoride de eindconcentratie van 5 mM en gelijke volumes van SDS monsterbuffer (3% SDS, 2 mM EDTA, 4% β-mercaptoethanol, 10% glycerol, 50 mM Tris, pH 6,8) om de PK spijsvertering beëindigen. Kook de monsters gedurende 10 min en te koelen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Ze zijn klaar voor Western blotting.
2. Velocity Sedimentatie in Sucrose Stap Verlopen
- Incubeer 450 pi 20% S1 met een gelijk volume van 2% sarkosyl in H 2 O 30 min op ijs.
- Voeg 0,5 ml van 60%, 30%, 25%, 20%, 15% en 10% sucrose in een Beckman buis met een maximaal 5 ml.
- Plaats 0,4 ml van S1 naar de top van 10-60% sucrose stap verlopen.
- Centrifugeer bij 48000 rpm (200.000 xg, SW55 rotor) gedurende 1 uur bij 4 ° C.
- Elke verzamel 283 ul deel van de top van de buis en heeft 12 fracties in totaal.
- Neem 20 pi van elke fractie in nieuw eppendorfbuisje, voeg 20 ui monsterbuffer en kook 10 min.
- Koel de monsters gedurende 4 min in kap gecentrifugeerd bij 1000 xg gedurende 1 min en vortex ze. Plaats monsters op een prefab gel.
3. Size exclusion chromatografie
- Gebruik Superdex 200 HR parels (Pharmacia, Uppsala, Zweden) in een 1 x 30 cm kolom oligomere toestand van PrP moleculen te bepalen.
- Zeven molecuulmassa markers (Sigma, St. Louis, MI) met Dextran blauw (2000 kDa), thyroglobuline (669 kDa), apoferritin (443 kDa), β-amylase (200 kDa), alcohol dehydrogenase (150 kDa), albumine ( 66 kDa), en koolzuuranhydrase (29 kDa) onafhankelijk geladen op de aanbevolen concentraties Sigma in 200 pl monster volumes.
- De elutie volume van de blauwe DEXTran wordt gebruikt om het void volume (V 0 = 8,45 ml) en het totale volume (V t = 24 ml) wordt door de instructie product bepalen. De piek elutievolume (V e) worden berekend op basis van het chromatogram en fractionele retenties. K av de verdelingscoëfficiënt (definiëren sample gedrag) wordt berekend met de vergelijking: K = av (V e - V 0) / (V t - V 0). De kalibratiecurve wordt bepaald door het uitzetten van de K av van de eiwitstandaarden tegen de log van de standaard MW 8.
- Het molecuulgewicht (MW) van de verschillende species PrP teruggewonnen in verschillende fracties FPLC wordt geëvalueerd volgens een kalibratiecurve gegenereerd met gelfiltratie van verschillende standaarden.
- Injecteer 200 ui S1 in lysisbuffer die 1% sarkosyl in de kolom voor elke run.
- Chromatografie wordt uitgevoerd in een FPLC systeem (GE Healthcare) bij een debiet van 0,25 ml / min en fracties van 0,25 ml elk worden verzameld met behulp van een fractie collector (Amersham Biosciences, RediFrac).
- Incubeer 0,125 ml elke fractie met 0,5 ml methanol voorgekoeld bij -20 ° C gedurende 2 uur.
- Centrifugeer monsters 13.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C in een benchtop microcentrifuge. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 20 ul SDS-monsterbuffer zoals hierboven vermeld, koken gedurende 10 min, afkoelen tot kamertemperatuur, laden op een prefab gel.
4. Capture van PrP door G5p
- De G5p molecule (100 ug) (vriendelijk verschaft door Dr. Geoff Kneale en John McGeehan van de Universiteit van Portsmouth, UK) geconjugeerd aan 7 x 10 8 tosyl geactiveerde magnetische korrels door het incuberen 100 ug en 350 ul G5p G5p beads in 1 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) bij 37 ° C gedurende 20 uur. Attract G5p-kralen aan de zijkant van Eppendorf buizen door externe magnetische kracht en verwijder vervolgens alle oplossing. Was de kralen met 1 ml PBS dat0,1% bovine serum albumine (BSA) driemaal.
- Incubeer de G5p-geconjugeerde kralen in 1 ml 0,2 M Tris-HCl, pH 7,4 die 0,1% BSA bij 37 ° C gedurende 5 uur om niet-specifieke binding te blokkeren en de kralen wassen met 1 ml PBS dat 0,1% BSA drie keer zoals hierboven vermeld. Verwijder de oplossing en voeg 1 ml van PBS in de korrels. De bereide G5p kralen zijn stabiel gedurende ten minste 3 maanden bij 4 ° C.
- De vangst van PrP door G5p wordt uitgevoerd door het incuberen 100 ul fracties S1 of P2 met 60 ul G5p geconjugeerde kralen (10 ug eiwit / 6 X 10 7 beads) in 1 ml bindingsbuffer (3% Tween-20, 3% NP- 40 in PBS, pH 7,5).
- Na incubatie met constante rotatie gedurende 3 uur bij kamertemperatuur worden de PrP bevattende G5p beads aangetrokken de zijwand van Eppendorf buizen door externe magnetische kracht, waardoor het eenvoudig verwijderen van alle ongebonden moleculen in de oplossing.
- Na driemaal wassen in wasbuffer (2% Tween-20 en 2% NP-40 in PBS, pH 70,5) worden G5p kralen verzameld en verwarmd bij 95 ° C gedurende 5 min in de SDS monsterbuffer (3% SDS, 2 mM EDTA, 10% glycerol, 50 mM Tris-HCl, pH 6,8).
- Na afkoelen monsters gedurende 5 min bij kamertemperatuur worden de monsters gecentrifugeerd bij 1000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. De supernatanten klaar voor Western blotting.
5. Western blotting
- Laad monsters gekookt in SDS monsterbuffer de op 15% Tris-HCl Criterion prefab gels (Bio-Rad) bij 150 V gedurende 80 min ~.
- De eiwitten op de gels worden overgebracht naar PVDF gedurende 2 uur bij 70V.
- Na het blokkeren membranen in 5% melk in Tris-gebufferde zoutoplossing die 0,01% Tween-20 (TBS-T) worden de membranen gedurende 2 uur bij kamertemperatuur met primaire monoklonaal of polyklonaal antilichaam 3F4 (1:40,000), 1E4 (1 : 1.000), anti-N 8 (1:6,000) of anti-C8 (1:6,000) voor het sonderen van het PrP-molecuul.
- Na incubatie met HRP-geconjugeerd schaap anti-muis IgG aan1:3000, of ezel anti-konijn IgG bij 1:3,000 het PrP banden worden gevisualiseerd op Kodak film met behulp van ECL Plus, in overeenstemming met het protocol van de fabrikant.
6. Representatieve resultaten
Vergeleken met sporadische CJD monsters werd een kleine hoeveelheid iPrP C gedetecteerd in de P2 fractie in normale hersenen, hoewel de meeste PrP C werd in de fractie S2 (figuur 1). Zoals eerder 8, iPrP vertegenwoordigt ongeveer 5-25% van de totale PrP waaronder volledige lengte en N-terminaal verkorte species.
Analyses met sucrose stapgradiënt sedimentatie bleek dat het merendeel van PrP C van niet-CJD hersenen werd in de top fracties 1-3, kleine hoeveelheden PrP ook gedetecteerd in de bodem fracties 9-11 bevatten die normaal grote aggregaten 8 (fig. 2).
Een verscheidenheid van PrP Sc species ginging van monomeren, oligomeren werden kleine grotere aggregaten geïsoleerd door gelfiltratie in de hersenen Creutzfeldt-Jakob (Figuur 3A). Echter een kleine hoeveelheid grotere aggregaten met molecuulgewicht groter dan 2000 kDa ook gedetecteerd in onoplosbare fracties van normale hersenen (figuur 3C). Bovendien werden dimeren en tetrameren van PrP C niet alleen gedetecteerd in onoplosbare fracties maar ook in oplosbare fracties (Fig. 3B en 3C).
Na PK en PNGase behandeling werd het PrP gefotografeerd door G5p gedetecteerd met het 1E4 antilichaam tegen PrP97-105 8. Drie PK-resistente kern-fragmenten genoemd PrP * 20 * 19 PrP en PrP * 7 gedetecteerd, migreren bij ~ 20 kDa, 19 kDa en ~ ~ 7 kDa (Figuur 4, linkerpaneel). Echter geen PrP gedetecteerd wanneer het 1E4 antilichaam gepreïncubeerd met een synthetisch peptide dat een sequentie heeft identical de 1E4 epitoop (figuur 4, middelste paneel), wat aangeeft dat banden gedetecteerd door 1E4 zijn PrP fragmenten. Bovendien is de anti-C-antilichaam toonde twee verschillende PrP fragmenten migreren bij ~ 18 kDa (PrP * 18) en ~ 12-13 kDa (PrP-CTF12/13) naast PrP * 20 (figuur 4, rechter paneel).
Figuur 1. Detectie van iPrP C en iPrP Sc. Na behandeling met PNGase F op 1/10 van het totale reactievolume bij 37 ° C gedurende 1 uur van glycanen uit het eiwit van volledige lengte of N-terminaal verkorte PrP species in de oplosbare en onoplosbare fracties (S2 en P2) isolated door ultracentrifugatie in hersenmonsters van normale controle (CTL) en sporadische CJD (sCJD) werden gedetecteerd met 3F4 tegen PrP106-112 (linker paneel), anti-N tegen PrP23-40 (middelste paneel), en anti-C tegen PrP220 tot 231 (rechter paneel). In CTL samples, wordt een kleine hoeveelheid gedetecteerd in PrP P2, terwijl een grote hoeveelheid aanwezig in S2. Daarentegen wordt meer PrP gedetecteerd in P2 dan S2 in sCJD monsters.
Figuur 2. Sedimentatie van PrP in sucrose stap gradiënten. PrP in afzonderlijke fracties van 1 tot 11 van niet-CJD hersenmonster S1 werd gedetecteerd door Western blotting met 3F4. Hoewel de meeste van PrP C werd gedetecteerd in topfracties 1-3, werden kleine hoeveelheden PrP ook waargenomen in bodem fracties 9-11. Bovendien is de banding patroon van PrP van boven-en onderkant is anders: PrP teruggevonden in de top fracties heeft een dominante bovenste band, terwijl PrP teruggevonden in de bodem fracties een dominante onderste band. A PK behandelde PrP Sc werd geladen als een controle op de rechterkant van blot.
Figuur 3. Detectie van oplosbare en onoplosbare PrP C oligomeren. Oplosbare en onoplosbare PrP C uit normale humane hersenen werden gescheiden door ultracentrifugatie en vervolgens onderworpen aan gelfiltratie respectievelijk. De molecuulgrootte van individuele fracties werden gemeten door het uitvoeren van een groep moleculaire massa markers. (A) PrP Sc species van sCJD hersenmonsters. Twee populaties van PrP soorten werden gedetecteerd: gelfiltratie fracties 49 tot 65 bevatten monomeren en oligomeren kleine, terwijl fracties zevenentwintig-drieëndertig bevatten grote aggregaten. Het PrP C species oplosbare fractie (S2) (B) en onoplosbare fractie (P2) (C) van normale controles werden gedetecteerd. PrP werd onderzocht met de 3F4 antilichaam. Dimeren (fractie 55) en tetrameren (fractie 51) van PrP gedetecteerd niet alleen P2 maar ook in S2 van normale hersenen samples (B en C). Grote aggregaten werden alleen gedetecteerd in normale monsters van P2 (C).
Figuur 4. Detectie van verschillende PK-resistente iPrP fragmenten in G5p verrijkte preparaten van normale menselijke hersenen. Monsters verrijkt door G5p behandeld met PK en PNGase F voor Western blotting aftasting met 1E4 (linker paneel), 1E4 gepreïncubeerd met een synthetisch peptide dat een sequentie identiek is aan de 1E4 epitoop (middelste paneel) had en anti-C ( rechter paneel). 1E4 ontdekt drie PK-resistente PrP fragmenten genoemd PrP * 20 * 19 PrP en PrP * 7 (linkerpaneel). Na blokkering van de 1E4 peptide werden geen PrP res gedetecteerd (middelste paneel), aangeeft dat de banden gedetecteerd met 1E4 zijn PrP fragmenten. Anti-C onthulde twee naast PK-resistente PrP fragmenten genoemd PrP * 18 en PrP-CTF12 /13, naast PrP * 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De combinatie van benaderingen hier beschreven isolaten vaste onoplosbare aggregaten PrP C en oplosbare oligomeren PrP C van de normale menselijke hersenen. Ultracentrifugatie bij 100.000 xg gedurende een uur is een klassieke methode die veelvuldig gebruikt wordt voor het afscheiden van het onoplosbare PrP Sc van de oplosbare PrP C 14. Hoewel het efficiënt een van de waarschuwingen te voorkomen tijdens het trekken van de supernatant (S2) na centrifugeren. Aangezien de gel profiel van iPrP C verschilt van die van PrP C, is het onwaarschijnlijk dat de PrP gedetecteerd in de P2 fractie gevolg van verontreiniging van S2. De sucrose gradiënt sedimentatie test werd gebruikt om verschillende PrP Sc species op basis van hun dichtheid, grootte en vorm 15 scheiden. We hebben gemerkt dat de fractie 12 vaak enige deeltje dat kan deze fractie onverklaarbare bevat. Fractie 10 vaak degene die de greates bevatt hoeveelheden PrP aggregaten van de fracties verzameld 8. De molecuulgewichten (MW) van verschillende PrP C conformeren werden verder gekarakteriseerd met gelfiltratie (ook wel size exclusion chromatografie). Eerst een kalibratiecurve gegenereerd met zeven molecuulgewicht markers (data niet getoond) en vervolgens onderzocht MW PRP van hersenen van normale controles en sCJD patiënten. Wij stelden vast dat een kleine hoeveelheid PrP aggregaten kan worden versneld met celafval tijdens de voorbereiding van S1 fractie. Om het herstel te verhogen, moet hersenweefsel goed worden gehomogeniseerd en de incubatie van hersenhomogenaat met de sarkosyl oplossing dient te worden uitgebreid tot een half uur of een uur bij 4 ° C. Hoewel er geen beperking voor volume G5p vastleggen van iPrP C raden wij aan 60 tot 80 pi van kralen en 100 tot 200 ui monsters voor elk experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs zijn dank verschuldigd aan het menselijk brein en Spinal Fluid Resource Center (Los Angeles, Californië) voor het verstrekken van normale hersenen monsters. Dit onderzoek werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) R01NS062787, de CJD Foundation, Alliance biologisch veilig, evenals het Universitair Centrum on Aging en Gezondheid met de steun van de McGregor Foundation en de President's Discretionary Fund (Case Western Reserve University) .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | 72 mM in 2-propanol |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | 2 mg/ml in H2O |
| PNGase F | New England Biolabs | MWGF200 | |
| Ultracentrifuge LE-80K, SW55 rotor | Beckman Coulter | Part No. 365668, 356860 | |
| Superdex 200 HR beads | GE Healthcare | 17-1088-01 | |
| AKTA FPLC system | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
| Molecular weight markers | Sigma-Aldrich | MWGF200 | Varied |
| Dynabeads M-280 magnetic beads | Invitrogen | 143-01 | |
| 3F4 antibody | Covance | SIG-39600 | |
| 1E4 antibody | Cell Sciences | M1840 | |
| Ready gel 15% Tris-HCl pre-cast gels | Bio-Rad | 345-0020 |
References
- Prusiner, S. B.
- Oesch, B., Westaway, D., Wälchli, M., McKinley, M. P., Kent, S. B. H., Aebersold, R., Barry, R. A., Tempst, P., Teplow, D. B., Hood, L. E., Prusiner, S. B., Weissmann, C. A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein. Cell. 40, 735-746 (1985).
- Bolton, D. C., McKinley, M. P., Prusiner, S. B. Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. Science. 218, 1309-1311 (1982).
- Prusiner, S. B., McKinley, M. P., Bowman, K. A., Bolton, D. C., Bendheim, P. E., Groth, D. F., Glenner, G. G. Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods. Cell. 35, 349-358 (1983).
- Hope, J., Morton, L. J., Farquhar, C. F., Multhaup, G., Beyreuther, K., Kimberlin, R. H. The major polypeptide of scrapie-associated fibrils (SAF) has the same size, charge distribution and N-terminal protein sequence as predicted for the normal brain protein (PrP). EMBO J. 5, 2591-2597 (1986).
- Prusiner, S. B., Groth, D. F., Bolton, D. C., Kent, S. B., Hood, L. E. Purification and structural studies of a major scrapie prion protein. Cell. 38, 127-134 (1984).
- Hall, D., Edskes, H. Silent prions lying in wait: a two-hit model of prion/amyloid formation and infection. J. Mol. Biol. 336, 775-786 (2004).
- Yuan, J., Xiao, X., McGeehan, J., Dong, Z., Cali, I., Fujioka, H., Kong, Q., Kneale, G., Gambetti, P., Zou, W. Q. Insoluble aggregates and protease-resistant conformers of prion protein in uninfected human brains. J. Biol. Chem. 281, 34848-34858 (2006).
- Yuan, J., Dong, Z., Guo, J. P., McGeehan, J., Xiao, X., Wang, J., Cali, I., McGeer, P. L., Cashman, N. R., Bessen, R., Surewicz, W. K., Kneale, G., Petersen, R. B., Gambetti, P., Zou, W. Q. Accessibility of a critical prion protein region involved in strain recognition and its implications for the early detection of prions. Cell. Mol. Life Sci. 65, 631-643 (2008).
- Zou, W. Q., Zheng, J., Gray, D. M., Gambetti, P., Chen, S. G. Antibody to DNA detects scrapie but not normal prion protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1380-1385 (2004).
- Gambetti, P., Dong, Z., Yuan, J., Xiao, X., Zheng, M., Alshekhlee, A., Castellani, R., Cohen, M., Barria, M. A., Gonzalez-Romero, D., Belay, E. D., Schonberger, L. B., Marder, K., Harris, C. A novel human disease with abnormal prion protein sensitive to protease. Ann. Neurol. 63, 697-708 (2008).
- Zou, W. Q., Puoti, G., Xiao, X., Yuan, J., Qing, L., Cali, I., Shimoji, M., Langeveld, J. P., Castellani, R., Notari, S., Crain, B., Schmidt, R. E., Geschwind, M. Variably protease-sensitive prionopathy: A new sporadic disease of the prion protein. Ann. Neurol. 68, 162-172 (2010).
- Zou, W. Q., Xiao, X., Yuan, J., Puoti, G., Fujioka, H., Wang, X., Richardson, S., Zhou, X., Zou, R., Li, S., Zhu, X. Amyloid-beta42 interacts mainly with insoluble prion protein in the Alzheimer brain. J. Biol. Chem. 286, 15095-15105 (2011).
- Zou, W. Q., Colucci, M., Gambetti, P., Chen, S. G. Characterization of prion proteins. Methods in Molecular Biology-Neurogenetics: Methods and Protocols. Potter, N. T. , Humana Press Inc. Totowa. 305-314 (2002).
- Tzaban, S., Friedlander, G., Schonberger, O., Horonchik, L., Yedidia, Y., Shaked, G., Gabizon, R., Taraboulos, A. Protease-sensitive scrapie prion protein in aggregates of heterogeneous sizes. Biochemistry. 41, 12868-12875 (2002).
