Summary
सेलुलर prion प्रोटीन की एक नई प्रजाति (पीआरपी
Protocol
1. मस्तिष्क Homogenate और डिटर्जेंट (S2) घुलनशील और अघुलनशील Fractions (P2) की तैयारी
- 100 मिलीग्राम जमे हुए मानव मस्तिष्क के ऊतकों लो और 100 μl lysis बफर (10 मिमी Tris, 150 मिमी NaCl, 0.5% P-40 Nonidet (एनपी 40), 0.5% EDTA, 7.4 पीएच).
- यह एक ताररहित मोटर द्वारा संचालित मूसल का उपयोग कर बर्फ पर homogenize, यह सूखी बर्फ में 5 मिनट के लिए और फ्रीज इसे फिर homogenize हाथों से पहले और बाद में मोटर द्वारा संचालित मूसल का उपयोग, और 300 μl या 800 μl lysis बफर (जोड़ने या तो 20 % या 10% कुल मस्तिष्क homogenate, क्रमशः).
- 1000 XG पर 4 बजे 10 मिनट डिग्री सेल्सियस (S1) तैरनेवाला एक benchtop अपकेंद्रित्र का उपयोग इकट्ठा करने के लिए के लिए 20% या 10% कुल मस्तिष्क homogenate अपकेंद्रित्र.
- एक SW55 रोटर में 35,000 (100,000 XG) rpm (Beckman कल्टर, Fullerton, CA) में 10% S1 4 डिग्री सेल्सियस से कम 1 घंटा के लिए ultracentrifuge स्थानांतरण (S2) supernatants कि एक साफ ट्यूब में डिटर्जेंट में घुलनशील अंश होते हैं. छर्रों कि डिटर्जेंट अघुलनशील शामिल Resuspend(P2) या 5 गुना केंद्रित तैयारी - 100 μl या 200 μl lysis बफर से 10 बनाने में अंश.
- PK पाचन के लिए, पी के समान मात्रा के साथ दोनों S2 और p2 भागों के लिए 1 घंटे के लिए 50 ग्राम / मिलीलीटर नमूना सेते हैं 37 डिग्री सेल्सियस. 5 मिमी और एसडीएस नमूना बफर (3% एसडीएस, 2 मिमी EDTA, 4% β mercaptoethanol, 10% ग्लिसरॉल, 50 मिमी Tris, पीएच 6.8) के बराबर मात्रा पीके पाचन को समाप्त करने की अंतिम एकाग्रता में phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड जोड़ें. 10 मिनट के लिए नमूनों को उबाल लें और उन्हें कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए शांत. वे पश्चिमी सोख्ता के लिए तैयार कर रहे हैं.
2. सुक्रोज कदम gradients में वेग अवसादन
- बर्फ पर 30 मिनट के लिए एच 2 हे में 2% sarkosyl की एक समान मात्रा के साथ 450 μl 20% S1 सेते हैं.
- 0.5 मिलीलीटर 60% की प्रत्येक, 30%, 25%, 20%, 15%, और एक अधिक से अधिक 5 मिलीग्राम क्षमता के साथ एक Beckman ट्यूब में 10% sucrose जोड़ें.
- S1 के 0.4 मिलीलीटर लोड 10-60% sucrose कदम gradients के शीर्ष पर.
- 4 में अपकेंद्रित्र1 घंटा के लिए 8,000 rpm (200,000 XG SW55 रोटर), 4 डिग्री सेल्सियस
- 283 μl अंश ले लीजिए एक ट्यूब के ऊपर से और कुल में 12 fractions प्राप्त.
- एक नया Eppendorf ट्यूब प्रत्येक अंश के 20 μl लो, 10 मिनट के लिए 20 μl नमूना बफर और फोड़ा जोड़ें.
- हुड में 4 मिनट के लिए शांत नमूने, 1 मिनट और उन्हें भंवर के लिए 1,000 XG पर अपकेंद्रित्र. एक पूर्व डाली जेल पर नमूने लोड.
3. आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी
- PRP अणुओं की oligomeric राज्य निर्धारित Superdex 200 एक 1 x 30 सेमी स्तंभ में मानव संसाधन (मनकों फार्मेशिया, अपसला, स्वीडन) का प्रयोग करें.
- Dextran नीले (2,000 केडीए), thyroglobulin (669 केडीए), एक प्रोटीन जो लोहे से संयुक्त होकर फेरोटिन बनाती है (443 केडीए), β amylase (200 केडीए), शराब dehydrogenase (150 केडीए), albumin सहित सात आणविक जन मार्कर (सिग्मा, सेंट लुइस, एमआई) ( 66) केडीए, और कार्बोनिक anhydrase (29 केडीए) स्वतंत्र रूप से 200 μl नमूना संस्करणों में सिग्मा द्वारा सिफारिश की सांद्रता में लोड कर रहे हैं.
- नीले dext क्षालन मात्राभागा शून्य (0 वी = 8.45 मिलीलीटर) की मात्रा और कुल मात्रा (वी टी = 24 मिलीलीटर) उत्पाद अनुदेश द्वारा प्रदान की जाती है का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है. शिखर क्षालन संस्करणों (वी ई) chromatogram और आंशिक retentions से गणना कर रहे हैं. - / कश्मीर (वी टी - वी 0) = av (0 वी ई): कश्मीर av, विभाजन गुणांक (नमूना व्यवहार परिभाषित), समीकरण का उपयोग कर की गणना है. अंशांकन वक्र कश्मीर av 8 मानकों के लॉग मेगावाट के खिलाफ प्रोटीन मानकों की साजिश रचने के द्वारा निर्धारित किया जाता है.
- आणविक वजन (मेगावाट) विभिन्न पीआरपी विभिन्न FPLC भागों में बरामद प्रजातियों में से एक अंशांकन विभिन्न मानकों के जेल निस्पंदन के साथ उत्पन्न की अवस्था के अनुसार मूल्यांकन किया है.
- Lysis बफर में प्रत्येक रन के लिए स्तंभ 1% sarkosyl में युक्त 200 μl S1 इंजेक्षन.
- क्रोमैटोग्राफी एक FPLC प्रणाली (जीई हेल्थकेयर) में 0.25 मिलीग्राम / मिनट और अंश के एक प्रवाह दर पर किया जाता है0.25 मिलीलीटर की प्रत्येक एक अंश कलेक्टर (Amersham बायोसाइंसेज, RediFrac) का उपयोग कर एकत्र कर रहे हैं.
- 2 घंटे के लिए 0.5 मिलीग्राम पूर्व ठंडा ° -20 सी में मेथनॉल के साथ 0.125 मिलीग्राम प्रत्येक अंश सेते हैं.
- 4 में 30 मिनट ° एक benchtop microcentrifuge में सी के लिए 13,000 XG में नमूने अपकेंद्रित्र. तैरनेवाला त्यागें और 20 μl एसडीएस नमूना बफर के रूप में ऊपर उल्लेख किया है में गोली resuspend, 10 मिनट, शांत करने के लिए कमरे के तापमान के लिए उबलते, उन्हें एक जेल पूर्व डाली पर लोड.
4. G5p द्वारा पीआरपी की कैद
- . g5p (100 ग्राम) अणु (कृपया पोर्ट्समाउथ, ब्रिटेन के विश्वविद्यालय से डीआरएस. ज्योफ Kneale और जॉन McGeehan द्वारा प्रदान की) 7 संयुग्मित है x 10 8 1 मिलीलीटर में 100 ग्राम g5p और 350 μl g5p मोती incubating द्वारा tosyl चुंबकीय मोतियों सक्रिय फॉस्फेट बफर (पीबीएस) 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 घंटे के लिए खारा. Eppendorf ट्यूबों के बाहरी चुंबकीय बल द्वारा sidewall g5p मोती आकर्षित करने और तो सभी समाधान निकालने. पीबीएस के 1 मिलीलीटर युक्त साथ मोती धोने0.1% गोजातीय albumin तीन बार के लिए सीरम (BSA).
- 0.2 एम Tris एचसीएल, पीएच 7.4 37 में 0.1% BSA युक्त डिग्री सेल्सियस के 1 मिलीलीटर में g5p संयुग्मित मोती 5 घंटा के लिए गैर विशिष्ट बंधनकारी ब्लॉक और सेते हैं तो पीबीएस के 1 मिलीलीटर 0.1% के लिए BSA युक्त मोती धोने तीन बार के रूप में ऊपर उल्लेख किया. समाधान निकालें और माला में पीबीएस के 1 मिलीलीटर जोड़ने. तैयार g5p मोती कम से कम 3 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर रहे हैं
- पीआरपी की g5p द्वारा कब्जा बाध्यकारी बफर के 1 मिलीलीटर में 60 μl g5p संयुग्मित मोती (10 ग्राम प्रोटीन / 6 एक्स 10 7 मोती) (3% Tween-20, 3% एनपी - साथ 100 μl S1 fractions या p2 incubating द्वारा किया जाता है पीबीएस, 7.5 पीएच में) 40.
- कमरे के तापमान पर 3 घंटे के लिए निरंतर रोटेशन के साथ ऊष्मायन के बाद, पीआरपी युक्त g5p मोती Eppendorf ट्यूब के sidewall बाहरी चुंबकीय बल द्वारा आकर्षित कर रहे हैं, समाधान में सभी अनबाउंड अणुओं की आसान हटाने के लिए अनुमति देता है.
- धोने बफर में तीन washes (2% बीच 20 और 2% पीबीएस में NP-40, 7 पीएच.5), G5p मोती एकत्र कर रहे हैं और 95 में गर्म ° एसडीएस नमूना बफर में 5 मिनट (3% एसडीएस, 2 मिमी EDTA, 10% ग्लिसरॉल, 50 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 6.8) के लिए सी.
- कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए नमूने को ठंडा करने के बाद, नमूने 1000 XG पर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए centrifuged हैं. supernatants पश्चिमी सोख्ता के लिए तैयार कर रहे हैं.
5. सोख्ता पश्चिमी
- SDS नमूना बफर में लोड नमूने 15% Tris - एचसीएल मानदंड पूर्व डाली जैल (जैव रेड) पर ~ 80 मिनट के लिए 150 वी पर उबला हुआ.
- जैल पर प्रोटीन 2 घंटे के लिए 70V पर PVDF स्थानांतरित कर रहे हैं.
- 5% में दूध में झिल्ली अवरुद्ध करने के बाद Tris-buffered खारा 0.01% युक्त बीच 20 (टीबीएस टी), झिल्ली 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर incubated प्राथमिक मोनोक्लोनल या पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी 3F4 (1:40,000) के साथ, 1E4 (1 : 1,000), 8 विरोधी एन (1:6,000), या पीआरपी अणु की जांच करने के लिए (1:6,000) 8 विरोधी सी.
- एचआरपी संयुग्मित भेड़ विरोधी माउस आईजीजी साथ ऊष्मायन बाद1:3000, या गधा विरोधी खरगोश आईजीजी 1:3,000 में पीआरपी बैंड कोडक ईसीएल प्लस का उपयोग कर फिल्म पर कल्पना निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार कर रहे हैं.
6. प्रतिनिधि परिणाम
छिटपुट CJD नमूनों की तुलना में, इस p2 अंश में iPrP सी की एक छोटी राशि सामान्य दिमाग में पता लगाया था, हालांकि अधिकांश पीआरपी सी S2 अंश (1 चित्रा) में बरामद किया गया था. जैसा कि पहले कुल पीआरपी के लगभग 5-25% के लिए पूर्ण लंबाई और एन टर्मिनली छोटा कर दिया प्रजातियों सहित 8, iPrP खातों संकेत.
Sucrose कदम ढाल अवसादन का उपयोग विश्लेषण से पता चला है कि जबकि गैर CJD दिमाग से पीआरपी सी के अधिकांश शीर्ष 1-3 भागों में बरामद किया गया था, पीआरपी की छोटी मात्रा भी नीचे 9-11 fractions है कि आम तौर पर बड़े समुच्चय 8 (चित्रा होते में पाया गया ) 2.
पीआरपी एससी प्रजातियों की एक किस्म बजीmonomers से आईएनजी, बड़ा समुच्चय के लिए छोटे oligomers Creutzfeldt-Jakob रोग (चित्रा 3A) के साथ दिमाग में जेल निस्पंदन से अलग थे. हालांकि, आणविक वजन 2000 केडीए से अधिक के साथ बड़ा समुच्चय की एक छोटी राशि भी सामान्य दिमाग के अघुलनशील भिन्न (चित्रा 3C) में पाया गया था. इसके अलावा, dimers और पीआरपी सी के tetramers केवल अघुलनशील भागों में भी लेकिन घुलनशील भिन्न (चित्रा 3B और 3C) में नहीं पाया गया.
पीके और PNGase उपचार के बाद, g5p द्वारा कब्जा कर लिया पीआरपी 1E4 एंटीबॉडी के साथ 8 PrP97-105 के विरुद्ध पाया गया था. PK-तीन प्रतिरोधी कोर टुकड़े पीआरपी * 20 * 19 पीआरपी, और पीआरपी * 7 का पता चला रहे थे, ~ 20 केडीए, ~ 19 केडीए और ~ 7 केडीए, क्रमशः (4 चित्रा, बाएं पैनल) में पलायन. करार दिया हालांकि, कोई पीआरपी का पता चला था जब 1E4 एंटीबॉडी एक सिंथेटिक पेप्टाइड कि एक अनुक्रम अध्यक्ष है साथ पूर्व incubatedराजनैतिक 1E4 (4 चित्रा, मध्य पैनल) मिलान, यह दर्शाता है है कि 1E4 द्वारा पता लगाया बैंड पीआरपी टुकड़े कर रहे हैं. इसके अलावा, एंटीबॉडी विरोधी सी दो अलग पीआरपी टुकड़े ~ 18 केडीए में पलायन का पता चला (पीआरपी 18 *) और ~ 12-13 केडीए (PrP-CTF12/13) पीआरपी के अलावा, 20 (4 चित्रा, सही पैनल).
चित्रा 1 iPrP सी और iPrP सुप्रीम कोर्ट की जांच. 1 / प्रतिक्रिया की कुल मात्रा के 10 में 37 डिग्री सेल्सियस से कम 1 घंटा के लिए PNGase एफ के साथ उपचार के बाद प्रोटीन, पूर्ण लंबाई या N-टर्मिनली घुलनशील और अघुलनशील भागों में पीआरपी प्रजातियों छोटा (S2 और p2) पृथक से glycans को हटाने के लिए PrP106-112 (बाएं पैनल), विरोधी एन के खिलाफ सामान्य नियंत्रण (सीटीएल) और छिटपुट CJD (एस सी जे डी) से मस्तिष्क के नमूने में ultracentrifugation द्वारा 3F4 साथ पाया गया PrP23 40 (मध्य पैनल) के खिलाफ और पीआरपी के खिलाफ विरोधी C220-231 (सही पैनल). सीटीएल के नमूने में p2 में पीआरपी की एक छोटी राशि का पता चला है, जबकि एक बड़ी राशि S2 में मौजूद है. इसके विपरीत, अधिक पीआरपी p2 में एस सी जे डी नमूनों में S2 में से पता चला है.
चित्रा 2 पीआरपी sucrose कदम gradients में अवसादन. अलग - अलग भागों में 1 से 11 गैर CJD मस्तिष्क नमूना S1 पीआरपी पश्चिमी 3F4 साथ सोख्ता द्वारा पाया गया था. हालांकि पीआरपी सी के सबसे शीर्ष 1-3 भागों में पाया गया था, पीआरपी की छोटी मात्रा भी नीचे 9-11 भागों में मनाया गया. इसके अलावा, ऊपर और नीचे से पीआरपी के बैंडिंग पैटर्न अलग है: शीर्ष भागों में बरामद पीआरपी एक प्रमुख ऊपरी बैंड है, जबकि नीचे भागों में बरामद पीआरपी प्रमुख कम बैंड है. PK-इलाज पीआरपी एससी धब्बा सही पक्ष पर एक नियंत्रण के रूप में भरी हुई थी.
4 आंकड़ा विभिन्न पीके प्रतिरोधी सामान्य मानव दिमाग से g5p समृद्ध तैयारी में iPrP टुकड़े की जांच. G5p से समृद्ध नमूने पीके और PNGase एफ के साथ इलाज किया गया पहले पश्चिमी 1E4 (बाएं पैनल), 1E4 एक सिंथेटिक पेप्टाइड एक 1E4 मिलान (मध्य पैनल) के समान दृश्य था के साथ पूर्व incubated के साथ जांच सोख्ता, और (विरोधी सी सही पैनल). 1E4 का पता चला तीन पीके प्रतिरोधी PRP टुकड़े करार दिया पीआरपी * 20, पीआरपी 7 19 *, और पीआरपी * (बाएं पैनल). पेप्टाइड के साथ 1E4 के अवरुद्ध करने के बाद, कोई पीआरपी को छोड़कर (मध्यम पैनल) पाया गया है, यह दर्शाता है है कि 1E4 के साथ पाया बैंड पीआरपी टुकड़े कर रहे हैं. एंटी - सी से पता चला दो अलावा पीके प्रतिरोधी PRP टुकड़े करार दिया * 18 पीआरपी और / PRP CTF1213, पीआरपी 20 * इसके अलावा में.
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Discussion
दृष्टिकोण के संयोजन यहाँ की सूचना लगातार अघुलनशील पीआरपी सी और सामान्य मानव मस्तिष्क से समुच्चय घुलनशील पीआरपी सी oligomers आइसोलेट्स. एक घंटे के लिए 100.000 XG ultracentrifugation एक क्लासिक तरीका है कि व्यापक रूप से किया गया है घुलनशील पीआरपी सी 14 के से अघुलनशील पीआरपी एससी की जुदाई के लिए प्रयोग किया जाता है. हालांकि यह बहुत ही कुशल है, एक चेतावनी देते हैं की centrifugation के बाद सतह पर तैरनेवाला (S2) खींच के दौरान संक्रमण से बचने के लिए है. चूंकि जेल iPrP सी प्रोफाइल है कि पीआरपी सी से अलग है, यह संभावना नहीं है कि इस p2 अंश में पाया पीआरपी S2 के संक्रमण से हुई. sucrose ढाल अवसादन परख विभिन्न पीआरपी एससी प्रजातियों उनके घनत्व, आकार, और 15 आकृतियों के आधार पर अलग किया गया है. हमने देखा है कि अंश 12 अक्सर कुछ कण कि इस अंश ग़ैरजिम्मेदार सकता है. 10 अंश अक्सर एक है कि greates शामिल हैfractions बीच पीआरपी समुच्चय के टी मात्रा 8 एकत्र की. विभिन्न पीआरपी सी conformers (मेगावाट) के आणविक भार आगे जेल निस्पंदन (भी बुलाया आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी) का उपयोग विशेषता थे. हम पहले सात आणविक जन मार्कर (नहीं दिखाया डेटा) के साथ एक अंशांकन वक्र उत्पन्न और फिर सामान्य नियंत्रण और एस सी जे डी रोगियों के दिमाग से पीआरपी मेगावाट की जांच. हम ने कहा है कि पीआरपी समुच्चय की एक छोटी राशि सेलुलर मलबे साथ साथ S1 अंश की तैयारी के दौरान उपजी. वसूली की दर में वृद्धि करने के लिए, मस्तिष्क के ऊतकों में अच्छी तरह से homogenized किया जाना चाहिए और sarkosyl समाधान साथ मस्तिष्क homogenate के ऊष्मायन 4 डिग्री सेल्सियस पर आधे घंटे या एक घंटे के लिए बढ़ाया जाना चाहिए यद्यपि वहाँ iPrP सी के g5p पर कब्जा करने के लिए कोई मात्रा सीमा है, तो हम एक प्रयोग के लिए माला और 100 से 200 μl नमूने का 60 से 80 μl का उपयोग करने की सलाह देते हैं.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों मानव मस्तिष्क और सामान्य मस्तिष्क के नमूने उपलब्ध कराने के लिए रीढ़ की हड्डी में तरल पदार्थ संसाधन केंद्र (लॉस एंजिल्स, CA) के लिए आभारी हैं. इस अध्ययन के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) R01NS062787, CJD फाउंडेशन, एलायंस BioSecure, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उम्र बढ़ने पर विश्वविद्यालय के सेंटर और स्वास्थ्य McGregor फाउंडेशन के समर्थन और राष्ट्रपति के विवेकाधीन कोष (केस वेस्टर्न रिजर्व विश्वविद्यालय) के साथ समर्थन किया था .
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P7626 | 72 mM in 2-propanol |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | 2 mg/ml in H2O |
| PNGase F | New England Biolabs | MWGF200 | |
| Ultracentrifuge LE-80K, SW55 rotor | Beckman Coulter | Part No. 365668, 356860 | |
| Superdex 200 HR beads | GE Healthcare | 17-1088-01 | |
| AKTA FPLC system | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
| Molecular weight markers | Sigma-Aldrich | MWGF200 | Varied |
| Dynabeads M-280 magnetic beads | Invitrogen | 143-01 | |
| 3F4 antibody | Covance | SIG-39600 | |
| 1E4 antibody | Cell Sciences | M1840 | |
| Ready gel 15% Tris-HCl pre-cast gels | Bio-Rad | 345-0020 |
References
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