Summary
Het algemene doel van deze video is te laten zien hoe je doelgericht retinale injectie uit te voeren en
Abstract
Kip embryonale netvlies is een uitstekend hulpmiddel om retinale ontwikkeling te bestuderen in hogere gewervelde dieren. Vanwege de grote omvang en externe ontwikkeling, is het relatief zeer makkelijk te manipuleren het kuiken embryonale netvlies met behulp van recombinant-DNA / RNA-technologie. Elektroporatie van DNA / RNA-constructen in het embryonale netvlies hebben een groot voordeel voor genregulatie in het netvlies stam / voorlopercellen tijdens het netvlies ontwikkeling te bestuderen. Verschillende soorten van testen, zoals reporter-gen-test, gen over-expressie, gene knock down (shRNA) enz. kan worden uitgevoerd met behulp van de elektroporatie techniek. Deze video demonstreert gericht retinale injectie en in-ovo elektroporatie in het embryonale kuiken netvlies aan de Hamburger en Hamilton stadium 22-23, dat is ongeveer embryonale dag 4 (E4). Hier laten we een snelle en handig in ovo electroporatie techniek waarbij een plasmide DNA dat green fluorescent protein (GFP) expressie brengt als een marker wordt rechtstreeks geleverd in dechick embryonale subretinale ruimte en gevolgd door elektrische pulsen aan DNA-opname te vergemakkelijken door het netvlies stam / voorlopercellen. De nieuwe methode van retinale injectie en elektroporatie op E4 laat de visualisatie van alle retinale typen cellen, inclusief de late-geboren neuronen 1, die moeilijk is geweest met de conventionele methode van injectie en elektroporatie op E1.5 2.
Protocol
Aangezien sommige delen van het protocol worden uitgevoerd zoals eerder beschreven in andere Jupiter video's 2 en papers 3 met minor modificatie we zullen niet bespreken die in detail hier.
1. Egg Handling en Naald Voorbereiding
- Eieren kunnen worden opgeslagen in een wijnkoeler bij ongeveer 13 ° C maximaal 1 week. Als de temperatuur te hoog is, zal embryo's abnormaal begint te ontwikkelen, terwijl lagere temperatuur veroorzaakt een hoge mortaliteit. Zodra u klaar bent om te broeden haal de eieren uit de wijnkoeler en verticaal zet de eieren met de grotere eindigen. Houd de eieren in de kamertemperatuur gedurende ten minste 2 uur voordat ze in de 37,5 ° C incubator.
- Incubeer de eieren 96 tot 100 uur, die over de embryonale dag 4 te verkrijgen embryo's die aan de Hamburger en Hamilton het podium 22 4-5.
- Bereid micropipet naalden van getrokken glas capillaire buizen en breek de punt onder een dissectie micromogelijkheden met een pincet om een tip opening ongeveer 0,1 micrometer in doorsnede en een 20 mm conus te krijgen. Naalden met grotere tips moeite hebben met het doorprikken van de vitelline membraan terwijl de kleinere tips moeite hebben met het laden en het leveren van de DNA-oplossing.
- Bevestig de naald aan een 0,1 ml Hamilton Gasdichte spuit gemonteerd op een micromanipulator. Gebruik een klein stukje van Masterplex siliconen buis voor het bevestigen van de naald op de spuit. Omdat de aansluitingen goed vast zitten geen behoefte aan minerale olie toe te voegen aan deze bijlage af te dichten.
- Mix 2 pi reporter plasmide-DNA oplossing met een concentratie variërend 3-6 pg / pl en 0,2 ul van snelle groen (0,025%) op een stuk parafilm. Snel groene kleurstof zal helpen om de injectie te visualiseren. Langzaam, laadt u de naald met het mengsel.
- Om de vitelline membraan te bevrijden van de binnenste membraan voorzichtig draai het ei ongeveer 180 ° en wacht enkele minuten en draai het vervolgens terug in de oorspronkelijke stand en stel het voor elektroporatie.
- Veeg de Forceps en eischaal met 70% ethanol om infectie te voorkomen dat het embryo.
- Maak een klein gaatje op het ei direct boven de lucht cel met een paar AA tang. Zorg ervoor dat u de eischaal te kraken. Verwijder de stukjes een voor een om een klein venster te maken. Verwijder voorzichtig het binnenste membraan met behulp van de tang, zonder het aanraken van de vitelline membraan.
2. Injectie en Elektroporatie
- Om schade aan de hersenen of het hart, de positie van de naald contra lateraal van de belangrijkste bundel van de bloedvaten in het oog en wijst naar de snavel te voorkomen.
- Prik door de vitelline membraan, sclera, netvlies en glasvocht door een plotselinge milde druk op de naald. Als de naald doorboort via het andere uiteinde van het oog moet goed komt tenzij beschadigt elke belangrijke bloed ader.
- Langzaam trek de naald terug aan de rand van de opening en plaats het bijna raken aan de buitenranden wand van de oogbol.
- Insertiet de naald in de sub netvlies ruimte tussen de sclera en retina.
- Injecteer het DNA tot je de 'groene oplossing' het vullen van de kant van de oogbol en duwen het netvlies naar binnen door het creëren van een uitstulping te visualiseren.
- Als uw naald plaatsen is niet juist dan zie je de DNA-oplossing zich verspreidt binnen het glasachtig lichaam het opvullen van de midden van de oogbol. Ook als u schade aan het netvlies te veel dan zie je de DNA-oplossing komt uit de oogbol.
- Verwijder langzaam de naald en onmiddellijk de elektroden te plaatsen in parallel in het ei na weken in een PBS. Duw de elektroden onder te dompelen in het vruchtwater een manier zodat de geïnjecteerde oog ligt tussen de elektroden. Vermijd het aanraken van een groot bloedvat of het hart met de elektroden bij het plaatsen van hen. De negatieve elektrode moet op de injectieplaats kant, zodat DNA kan worden vervoerd van sub retinale ruimte in het netvlies naar positieve elektrode. Electroporate het netvlies met 5 pulsen van 15V voor 50 ms met 950 ms intervallen.
- Verwijder voorzichtig de elektroden en verzegelen het raam van het ei met stukjes duidelijke plakband.
- Label en de datum waarop de geïnjecteerde eicel voordat het terug naar de incubator. Normaal gesproken duurt het ongeveer 3 tot 5 minuten dat u de gehele elektroporatie proces.
- GFP expressie kan worden gezien als Reeds 8 uur na elektroporatie. U kunt echter wachten tot het embryo op de gewenste stadium voor de oogst.
3. Representatieve resultaten
In ons onderzoek maken we gebruik van diverse plasmide constructies om de regulatie van genexpressie dat de betrokken retinale cel ontwikkeling te bestuderen. In deze video pCAG-GFP (transfectie controle) werd gebruikt om een succesvolle injectie en elektroporatie volgen. Niettemin mogen plasmide construct met reportergen (GFP, RFP etc.) worden gebruikt. Hoewel GFP expressie kan worden gezien als Reeds 8 uur na electroporation, we meestal beginnen met het oogsten het ei op dag 6 (E6) en daarna. Geëlektroporeerd netvlies werden ontleed uit van het embryo en geanalyseerd onder tl-dissectie microscoop voor het inbedden en snijden. Doorgaans kunnen reporter genexpressie worden gezien ten minste in een kwart van de retina na een succesvolle elektroporatie (Fig 1). De getransfecteerde netvlies weefsels werden verder geanalyseerd door middel van snijden voor een duidelijke weergave van de cel morfologie. Immunohistochemie met celtype specifieke markers (Brn3a, PAX6 etc.) toegestaan karakterisering van cel-specifieke GFP expressie (Figuur 2).
Figuur 1. Succesvolle elektroporatie van reporterplasmide resultaten positief GFP expressie. Chicken embryonale netvlies werden geïnjecteerd en geëlektroporeerd op embryonale dag 4 en geoogst op embryonale dag 6. Tenminste 25% van de retina werd succesvol getransfecteerde (A = Bovenaanzicht, B= Onderaanzicht). Schaal Bar = 1 mm.
Figuur 2. Karakterisering van GFP expressie retinale cellen met behulp van immunohistochemie. GFP uiten retinale weefsel in E7 stadium waren vaste en coupes. Deze secties werden vervolgens gekleurd met verschillende cel specifieke merkers. Brn3a werd gebruikt om ganglioncellen (A) te bepalen, terwijl PAX6 werd gebruikt om horizontale, amacrine en ganglioncellen (B) te bepalen. Schaal bar = 50 urn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gerichte retinale injectie en in-ovo elektroporatie in embryonale netvlies aan E4 stadium kan specifiek zijn gericht op het netvlies stamcellen resulteert in de mogelijkheid om alle zes grote netvlies celtypen te visualiseren op het cel-niveau. In ovo elektroporatie op HH10 (~ E1.5) gericht op de optic vesicle kan cellen die ontwikkelen om het oog vormen transfecteren. Echter deze cellen hebben een zeer hoge omzet bij deze tijd en deze methode is niet specifiek voor retinale cellen. Het kan zijn dat de hoge cel omloopsnelheid aanhoudende stabiele expressie voorkomt. Door E4, wordt de embryo voldoende ontwikkeld dat de belangrijkste structuren van het oog alle worden gevormd maar jong genoeg dat de meerderheid van cellen in het netvlies zijn nog retinale stamcellen. Deze methode kan ook worden toegepast op / verlies van functie studies waar een gen van belang kunnen worden gericht op normale ontwikkeling en / of ziekte van de retina bestuderen krijgen.
Na publiceerden we deze techniek in onzevorige artikel 1, een aantal wetenschappers op dit gebied contact met ons op voor meer hulp bij deze techniek. Dus besloten we om deze video voor visualisatie te produceren. In Bovendien worden de voorschotten in onze techniek beschreven in dit video.
Om deze techniek met succes uit te voeren, na kritische factoren zijn de moeite waard beschrijven.
De meest kritische factor is om de naald precies te plaatsen in de subretinale ruimte. Ten eerste moet men voorzichtig zijn om de naald af te stemmen contra-lateraal van de belangrijkste bundel van de bloedvaten in het oog en de richting van de snavel. Deze positie is bijna parallel aan het hart en vermindert de kans om de hersenen en het hart kunnen beschadigen. Wanneer piercing door vitelline membraan, sclera, netvlies en glasvocht, moet de naald niet ver en prik reizen door geen bloed ader. Als de naald is scherp genoeg dan kan dit heel eenvoudig met weinig praktijken. De volgende stap is om langzaam terug te trekken ee naald en positie aan de rand van de opening van de retina. Er is altijd een kans om het trekken helemaal uit. Als dat zou gebeuren, dan kan men weer proberen om de naald terug te zetten bij de opening. Het plaatsen van de naald in de subretinale ruimte (tussen de sclera en retina) vereist oefening en geduld. In het begin ziet het er erg moeilijk, maar met wat oefening wordt het gemakkelijk. Bij het injecteren van de DNA-oplossing in de subretinale ruimte, is het zeer belangrijk om te observeren de bult formatie. Daarna de groene oplossing begint vullen de omtrek van het oog, duidt op een succesvolle injectie. Als de oplossing diffundeert weg of begint vulling in de midden van het oog, die aangeeft een onjuiste injectie die geen zal opleveren een succesvolle elektroporatie.
De tweede factor is de vervaardiging van een optimale naald die gemaakt is via warmte-pulling een glazen capillaire buis en breken van de tip. Naalden met grote tips hebben moeite piercing thrdoorgedreven de vitelline membraan dat de kans op beschadiging het netvlies verhoogt. Meestal scherpste naald tips zijn het beste voor dit doel. Echter, de naald met een zeer kleine tips moeite hebben met het laden en het leveren van de DNA en hebben een verhoogde kans om af te breken binnen in de oogbol. Om deze reden maken we naalden met een tip opening aan ongeveer 0,1 micrometer in doorsnede en een 20 mm taper 1. Ook, terwijl het laden van de DNA-mengsel uit een druppel op een stuk parafilm, is het zeer belangrijk om niet het laatste beetje van de vloeistof te laden als het verhoogt de kans op het krijgen van lucht in de naald.
Slot de van de elektroden is zeer kritisch tot succesvolle elektroporatie bereiken. De elektroden moeten worden geplaatst in parallel zodat de ontwikkelingslanden oog ligt tussen de elektroden. Extra voorzichtigheid is geboden bij het aanraken van alle grote bloedvaten of het hart met de elektroden. Het beschadigen van een van deze kan leiden tot de dood van het embryo, zelfs na een succesvolle injectiop. Verder zijn de twee ogen zijn verschillend georiënteerde. Het heeft dus worden gehouden in geest de elektrode oriëntatie (positieve vs negatieve) veranderen zodat de negatieve elektrode altijd moet ten de injectie kant naar de DNA diffuse toe in de retinale cellen onder de elektrische stroom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en faciliteiten Comite aan de Rutgers University.
Acknowledgments
We willen graag aan de heer Maaz Enver bedanken voor het gebruik van zijn HD-camera (Cannon VIXIA HFS100). Dit werk werd mede ondersteund door subsidies van NIH (EY018738), New Jersey Commissie op het ruggenmerg Onderzoek (08 tot 3074-SCR-E-0 en 10 tot 3.091-SCR-E-0), en Busch Biomedical Research Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized pathogen-free (SPF) white leghorn chicken eggs | Sunrise Farms (Catskill, NY) | ||
| Chicken egg incubator | GQF Manufacturing | Model-1550 | Set to 60% humidity and 37.5°C. |
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | TW150F-4 | |
| 0.1 ml syringe | Hamilton Co | Gastight 1710 | Alternatively 1ml syringe can be used as well |
| Masterflex Silicone (peroxide) Tubing | Cole-Parmer | HV-96400-13 | Cut a small piece (1 cm) for attaching the glass needle to the syringe |
| Tweezers | Dumont | AA | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301-M3 | |
| Plasmid DNA | pCAG-GFP was borrowed from Dr. Connie Cepko | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Dilute it to 0.025 % with PBS |
| Pulse generator | Harvard Apparatus | BTX ECM 830 | Square wave generator |
| Electrodes | Harvard Apparatus | BTX model 514 | Our electrodes were spaced 3-5 mm apart |
| Monochrome Digital Camera | Carl Zeiss, Inc. | Axiocam MRM | |
| Fluorescent Dissection Microscope | Leica Microsystems | Leica MZ16FA | |
| Upright Fluorescence Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Zeiss Axio Imager A1 |
References
- Doh, S. T. Analysis of retinal cell development in chick embryo by immunohistochemistry and in ovo electroporation techniques. BMC. Dev. Biol. 10, (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408-e408 (2007).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Hamburger, V. The stage series of the chick embryo. Dev. Dyn. 195, 273-275 (1992).
