Summary
Det övergripande målet för den här videon är att visa hur man utför riktade retinal injektion och
Abstract
Kyckling embryonal näthinnan är ett utmärkt verktyg för att studera retinal utveckling i högre ryggradsdjur. På grund av storlek och extern utveckling, är det jämförelsevis mycket enkelt att manipulera ungen embryonala näthinnan med hjälp av rekombinant DNA / RNA-teknik. Elektroporering av DNA / RNA-konstruktioner i embryonala näthinnan har en stor fördel att studera genreglering i retinala stamceller / progenitorceller under retinal utveckling. Annorlunda typ av analyser såsom reportergen-analysen, gen över-uttryck,-genen knock ned (shRNA) etc kan utföras med användning den elektroporering tekniken. Denna video demonstrerar riktade retinal injektion och ovo elektroporation i embryonala kycklingen näthinnan på Hamburger och Hamilton steg 22-23, som handlar om embryonala Dag 4 (E4). Här visar vi en snabba och bekväma att in ovo-elektroporation teknik varigenom en plasmid-DNA som uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) i form av en markör levereras HlVl direkt in i denbrud embryonisk subretinala utrymmet och följt av elektriska pulser för att underlätta DNA-upptag genom att retinala stam / progenitorceller. Den nya metod för retinal injektion och elektroporering vid E4: an tillåter den visualisering av alla retinala celltyper, inklusive den sena-födda neuroner 1, vilket har varit svårt med den konventionella metoden för injektion och elektroporering vid E1.5 2.
Protocol
Eftersom vissa delar av protokollet utförs som tidigare beskrivits i andra Jové videor 2 och papper 3 med mindre modifiering vi inte kommer att diskutera dem i detalj här.
1. Ägg Hantering och nål Förberedelse
- Ägg kan lagras i ett vin svalare vid omkring 13 ° C under upp till 1 vecka. Om temperaturen är för hög, kommer embryon börja utveckla onormalt, medan lägre temperaturer orsakar hög dödlighet. När du är redo att inkubera ta ut ägg från vinkyl och ställ äggen vertikalt med den större hamnar. Förvara äggen i rumstemperatur i minst 2 timmar innan du lägger dem i 37,5 ° C inkubator.
- Inkubera ägg 96-100 timmar, vilket är ungefär embryonal dag 4 för att få embryon som är på Hamburger och Hamilton steg 22 4-5.
- Förbered mikropipettspetsar nålar från drog glas kapillärrör och bryta spetsen under ett dissekerande mikroräckvidd med en pincett för att få ett tips öppning ca 0,1 m i diameter och 20 mm koniska. Nålar med större spetsar har svårt att genomstickning av vitellinmembranet medan mindre tipsen har svårt att lastning och att leverera den DNA-lösningen.
- Fäst nålen till en 0,1 ml Hamilton gastät spruta monterad på en mikromanipulator. Använda en liten bit av Masterplex silikon tub för fäster kanylen till sprutan. Eftersom anslutningarna är täta ingen anledning att lägga mineralolja att täta den här bilagan.
- Blanda 2 il av reporter-plasmid-DNA-lösning med en koncentration som sträcker sig 3-6 | ig / | il och 0,2 | il av snabb grön (0,025%) på ett stycke av parafilm. Snabb grönt färgämne kommer att hjälpa att visualisera den injektionen. Sakta, ladda nålen med blandningen.
- Att frigöra vitellinmembranet från den inre membranet rotera ägget försiktigt ca 180 ° och vänta några minuter och vrid den sedan tillbaka till utgångsläget och ställ in den för elektroporering.
- Torka av konstruktöeps och ägg skal med 70% etanol för att undvika infektion embryot.
- Gör ett litet hål på ägget direkt ovanför luftcellen med ett par AA pincett. Var noga med att inte knäcka äggskalet. Ta bort små bitar i taget för att göra ett litet fönster. Tag försiktigt bort det inre membranet med användning av de peang utan att vidröra den vitellinmembranet.
2. Injektion-och Elektroporering
- För att förhindra skador på hjärnan eller hjärtat, placera nålen kontra sidled till den huvudsakliga bunt av blodkärl som kommer in i ögat och pekar mot näbben.
- Genomborra genom det vitellinmembranet, sklera, näthinnan och glaskroppen humorn genom att en plötslig milt push-av nålen. Om nålen genomborrar genom den andra änden av ögat det bör vara alright såvida inte det skadar sådant större blod ven.
- Sakta drar tillbaka nålen vid kanten av öppningen och placera det nästan tangerar den yttre väggen av ögongloben.
- Man för int in nålen i sub retinala utrymmet mellan sklera och näthinnan.
- Injicera DNA tills du kan visualisera den gröna lösningen fyller sidan av ögongloben och skjuta näthinnan inåt genom att skapa en bula.
- Om din nål släpps inte är korrekt så kommer du att se DNA-lösningen spridas i glaskroppen fylla upp mitt i ögongloben. Dessutom, om du skadar näthinnan för mycket så kommer du att se DNA-lösningen kommer ut ur ögongloben.
- Sakta ut kanylen och omedelbart placera elektroderna parallellt inuti ägget efter blötläggning i PBS. Push down de elektroderna för att ligga helt under vattenytan in i den fostervatten i ett sätt så att den injicerade ögat är beläget mellan elektroderna. Undvik att röra vid någon större blodkärl eller hjärta med elektroderna när du gör dem. Den negativa elektroden bör vara vid injektionsstället sidan så att DNA kan transporteras från sub retinal rymden i näthinnan mot positiva elektroden. Electrogens näthinnan med 5 pulser av 15V för 50 ms med 950 ms intervall.
- Tag försiktigt bort de elektroder och försegla det fönster av ägget med bitar av tydlig scotch tejp.
- Etikett och hittills injicerade ägget innan det tillbaka till inkubatorn. Normalt tar det cirka 3 till 5 minuter att fullfölja hela elektroporering processen.
- GFP-uttryck kan ses så tidigt som 8 timmar efter elektroporering. Du kan dock vänta tills embryot når önskad scenen före skörd.
3. Representativa Resultat
I vår studie använder vi olika plasmidkonstruktioner för att studera regleringen av genuttryck som involverade retinal celler utveckling. I till den här videon pCAG-GFP-(transfektion-kontroll) användes för att följa en framgångsrik injektion och elektroporering. Emellertid kan någon plasmid-konstrukt med rapportörgen-genen (GFP-, RFP etc) användas. Även om GFP-uttryck kan ses så tidigt som 8 timmar efter electroporation, börjar vi oftast skörda ägget på dag 6 (E6) och framåt. Elektro näthinnor dissekerades ut ur embryot och analyseras under fluorescerande dissektionsmikroskop före inbäddning och snittning. Typiskt, kan rapportörgen genuttryck ses åtminstone i kvart av näthinnan efter att ha en lyckad elektroporering (Fig. 1). De transfekterade retinala vävnaderna analyserades vidare genom sektionering för tydlig visualisering av cell morfologier. Immunohistokemi med användning av cell-typspecifika markörer (Brn3a, Pax6-osv) tillät karakterisering av cell-specifik GFP-uttryck (Fig. 2).
Klura 1. Framgångsrik elektroporering av reporterplasmid resultat positivt GFP uttryck. Kyckling embryonala näthinnor injicerades och elektroporerades vid embryonal dag 4 och skördades vid embryonal dag 6. Åtminstone 25% av näthinnan var framgångsrikt transfekterades (A = Överst vy-, B-= Underifrån). Skala Bar = 1 mm.
Siffra 2. Karakterisering av GFP-uttryckande retinala celler med immunohistokemi. GFP-uttryckande retinala vävnader vid E7 skede var fast och snittades. Dessa sektioner färgades sedan med olika cell specifika markörer. Brn3a användes för att bestämma ganglionceller (A) medan Pax6-användes för att bestämma horisontell, amakrina-och celler ganglionceller (B). Skala bar = 50 ^ m.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Riktade retinal injektion och ovo elektroporation i embryonal näthinnan i E4 skede kan specifikt rikta retinala stamceller resulterar i förmågan att visualisera alla sex huvudtyper näthinnan cell på en enda cell nivå. Ovo elektroporering vid HH10 (~ E1.5) riktade till optiken vesikel är i stånd att transfektera celler som utvecklas för att bilda den ögat. Emellertid, dessa celler har en väldigt hög omsättning vid denna tid och denna metod är inte specifik för retinala celler. Det kan vara att den höga cellen omsättningshastighet hindrar upprätthållas stabilt uttryck. Med E4 är embryot utvecklas nog att de stora strukturerna i ögat är alla bildade, men ung nog att majoriteten av celler i näthinnan är fortfarande retinala stamceller. Den här metod kan också appliceras att vinna / förlust av funktionsmutationer studier där en gen av intresse kan målinriktade för att studera normal utveckling och / eller sjukdom av näthinnan.
Efter att vi publicerade denna teknik i vårföregående papper 1, kontaktade flera forskare på detta område oss för ytterligare hjälp på denna teknik. Så vi beslutade att producera denna video för visualisering. I Dessutom väntas de framstegen inom vår beskrivna tekniken i den här videon.
För att utföra denna teknik framgångsrikt, efter kritiska faktorer är värt att beskriva.
Den mest kritiska faktorn är att placera nålen just i själva subretinala utrymmet. För det första måste man vara noga med att anpassa nålen kontra-laterala till den huvudsakliga bunt av blodkärl som kommer in i ögat och pekar mot näbben. Denna position är nästan parallell till hjärtat och reducerar den chansen att skada hjärnan och hjärtat. Då tränger igenom vitellinmembranet, sklera, näthinnan och glaskroppen, bör nålen inte resa långt och tränger igenom något blod ven. Om nålen är vass nog kan detta göras mycket enkelt med få praxis. Nästa steg är att långsamt dra tillbaka ee nålen och placera den vid kanten av öppningen av näthinnan. Det finns alltid en chans att dra ut den helt. Om detta skulle inträffa, så kan man försöka igen att sätta nålspetsen tillbaka till öppningen. Genom att placera nålen i subretinalområdet (mellan sklera och näthinnan) kräver övning och tålamod. I början ser det mycket svårt, men med lite träning blir det lätt. Medan du injicerar det DNA lösningen inuti det subretinala utrymmet, är det mycket viktigt att observera den bukta ut formationen. Efteråt, startar den gröna lösningen fyllning konturerna av den ögat, vilket indikerar en lyckad injektion. Om lösningen diffunderar away eller startar fyllning in i en mitt av ögat, indikerar att ett inkorrekt injektion vilket inte kommer att utbyte ge en lyckad elektroporering.
Den 2:a faktorn är den fabrikation av ett optimalt nål vilken är tillverkad via värme-dragande en glaskapillärrör och bryta spetsen. Nålar med stora tips har thr svårt piercinggrundlig den vitellinmembranet vilket ökar chansen för att skada näthinnan. Vanligtvis skarpaste handbroderade tips är bäst för detta ändamål. Men nål med mycket små tips har svårt att lasta och leverera DNA och har ökat chansen att bryta ner inne i ögongloben. Av denna anledning vi nålar med en spets öppning på ca 0,1 m i diameter och 20 mm koniska 1. Även vid lastning DNA blandning från en droppe på en bit parafilm, är det mycket viktigt att inte ladda den sista biten av vätska eftersom det ökar chanserna att få luften inne i nålen.
Slutligen, placering av elektroderna är mycket kritisk för att uppnå framgångsrika elektroporation. De elektroder bör placeras i parallellt, så att utvecklingsvärlden ögat är belägen mellan elektroderna. Extra försiktighet skall tas från att röra några större blodkärl eller hjärtat med elektroderna. Att skada någon av dessa kan resultera döden till embryot även efter en lyckad injectipå. Dessutom kan de två ögonen är olika orienterade. Så måste man hålla i minnet att ändra elektroden orienteringen (positiv kontra negativ) så att den negativa elektroden bör alltid vid injektionsstället sidan att tillåta DNA diffunderar in i de retinala celler under den elektriska strömmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla djurförsök godkändes av Institutional Animal Care och Faciliteter kommittén vid Rutgers University.
Acknowledgments
Vi vill tacka Mr Maaz Enver för användning av sin HD-kamera (Cannon VIXIA HFS100). Detta arbete stöddes delvis av bidrag från NIH (EY018738), New Jersey kommissionen om Spinal Cord forskning (08-3074-SCR-E-0 och 10 till 3091-SCR-E-0) och Busch biomedicinsk forskning Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized pathogen-free (SPF) white leghorn chicken eggs | Sunrise Farms (Catskill, NY) | ||
| Chicken egg incubator | GQF Manufacturing | Model-1550 | Set to 60% humidity and 37.5°C. |
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | TW150F-4 | |
| 0.1 ml syringe | Hamilton Co | Gastight 1710 | Alternatively 1ml syringe can be used as well |
| Masterflex Silicone (peroxide) Tubing | Cole-Parmer | HV-96400-13 | Cut a small piece (1 cm) for attaching the glass needle to the syringe |
| Tweezers | Dumont | AA | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301-M3 | |
| Plasmid DNA | pCAG-GFP was borrowed from Dr. Connie Cepko | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Dilute it to 0.025 % with PBS |
| Pulse generator | Harvard Apparatus | BTX ECM 830 | Square wave generator |
| Electrodes | Harvard Apparatus | BTX model 514 | Our electrodes were spaced 3-5 mm apart |
| Monochrome Digital Camera | Carl Zeiss, Inc. | Axiocam MRM | |
| Fluorescent Dissection Microscope | Leica Microsystems | Leica MZ16FA | |
| Upright Fluorescence Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Zeiss Axio Imager A1 |
References
- Doh, S. T. Analysis of retinal cell development in chick embryo by immunohistochemistry and in ovo electroporation techniques. BMC. Dev. Biol. 10, (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408-e408 (2007).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Hamburger, V. The stage series of the chick embryo. Dev. Dyn. 195, 273-275 (1992).
