Summary
Bu videonun genel amacı hedef retina enjeksiyon nasıl gerçekleştirileceği göstermek için ve
Abstract
Tavuk embriyonik retinada yüksek omurgalılarda retina gelişimini incelemek için mükemmel bir araçtır. Çünkü büyük ölçekli ve dış gelişme, rekombinant DNA / RNA teknolojisi kullanarak civciv embriyonik retinanın işlemek için nispeten çok kolaydır. Embriyonik retinaya DNA / RNA yapıları Elektroporasyon retina gelişimi sırasında retina kök / progenitör hücrelerin gen regülasyonu incelemek için büyük bir avantaj var. , Bu tür bir reporter gen assay,,-expression üzerinden, gen,, vb.. (ShRNA.) Aşağı doğru için üstüne vurmayın gen gibi deneyleri of Farklı bir type,,, elektroporasyon tekniktir kullanarak gerçekleştirilir uygulanmaz edebilirsiniz. Bu video hedeflenen retina enjeksiyon gösterir ve embriyonik civciv retinaya embriyonik gün 4 (E4) hakkında Hamburger ve Hamilton evre 22-23, ovo elektroporasyon. Bir belirteç olarak yeşil floresan proteininin (GFP) ifade eden bir plazmid DNA doğrudan teslim edilir; Burada, ovo elektroporasyonu tekniği hızlı ve rahat gösterircivciv embriyonik subretinal alan ve retina kök / progenitör hücrelerin DNA alımını kolaylaştırmak için elektrik dalgaları izledi. E4 retina enjeksiyon ve elektroporasyon yeni bir yöntem, E1.5 2 enjeksiyon ve elektroporasyon geleneksel yöntem ile zor olmuştur geç doğumlu nöronlar 1, dahil olmak üzere tüm retinal hücre türleri, görselleştirme sağlar.
Protocol
,, Daha önceden olarak, minor modifikasyonu ile birlikte,, diğer jove videos 2 ve kağıtlar 3, in açıklanan gibi protokol of, bazı parçalar, gerçekleştirilir uygulanır yılından bu yana, biz, buraya detail in olanlar tartışmak değil edecektir..
1. Yumurta Taşıma ve İğne Hazırlık
- Yumurta, yaklaşık 13 ° C'de 1 hafta kadar serin bir şarap muhafaza edilebilir. Sıcaklık çok yüksek ise daha düşük sıcaklık, yüksek mortalite neden olurken, embriyolar anormal geliştirmeye başlayacaktır. Sonra şarap soğutucusu yumurta ve yumurta büyük ucunu dikey kurmak inkübe hazır. 37.5 ° C inkübatör koymadan önce en az 2 saat oda sıcaklığında yumurta tutun.
- Hamburger ve Hamilton aşamada 22 4-5 embriyolardan elde embriyonik 4. günde yaklaşık 96-100 saat yumurta inkübe edin.
- Çekti cam kapiller tüplerin, mikropipet iğne hazırlayın ve mikro altında bir kesme ucu kırmakçapı 0.1 mm ve 20 mm konik hakkında bir ipucu açılış almak için bir cımbız ile kapsamı. İğneler büyük ipuçları ile küçük ipuçları DNA solüsyonu yükleme ve teslim zorluk varken vitellin zarı delerek zorluk var.
- , Bir micromanipulator üzerine monte edilmiş 0.1 ml Hamilton Gaz geçirmez şırınga iğnesi takın. Şırınga, iğne takmak için Masterplex silikon tüp küçük bir parça kullanın. Sıkı herhangi bir bağlantıları olduğundan bu ek mühürlemek için mineral yağ eklemek gerekir.
- 2 ul muhabiri plazmid DNA solüsyonu 3-6 mg / ml ve 0.2 ul bir parça parafilm hızlı yeşil (% 0.025) arasında değişen bir konsantrasyon ile karıştırın. Hızlı yeşil boya enjeksiyon görselleştirmek için yardımcı olacaktır. Daha Yavaşça, sorunun giderilip giderilmediğini, karışım, ile birlikte, iğne yüklenemedi.
- Yumurta, 180 ° hakkında hafifçe döndürün ve birkaç dakika sonra orijinal konumuna geri döndürmek ve elektroporasyon için ayarlamanız için bekleyin iç zarı, vitellin zarı boşaltmak için.
- Forc silin, embriyoya bulaşmasını önlemek için% 70 etanol ile eps ve yumurta kabuğu.
- Yumurta hemen AA boyutu forseps bir çift hava hücresi üzerinde küçük bir delik açın. Yumurta kabuğu kırmak için değil dikkatli olun. Küçük parçalara küçük bir pencere yapmak için bir anda birini çıkarın. Dikkatle,, vitellin membran dokunmadan forcepsi iç zarı çıkarın.
2. Enjeksiyon ve elektroporasyon
- Göze giren ve gaga yönelerek, kan damarlarının ana paket lateral beyin ya da kalp, pozisyon iğne kontra zarar görmesini önlemek için.
- Delip iğne ani bir hafif basarak vitellin membran, sklera, retina ve vitreus. İğne gözün diğer sonuna kadar deler Eğer herhangi bir büyük kan damarına zarar vermemek yolunda olmalıdır.
- Yavaş yavaş açılma kenarında iğne geri çekin ve gözün dış duvarına neredeyse teğet yerleştirin.
- Insert iğne alt sklera ve retina arasındaki retina uzaya.
- Yan gözün doldurma ve bir çıkıntı oluşturarak retina içeri iterek yeşil çözüm görselleştirmek kadar DNA enjekte edilir.
- Senin iğne yerleştirilmesi doğru değilse, o zaman DNA solüsyonu gözün ortasına kadar dolum vitreus içine yayılan göreceksiniz. Ayrıca, retinaya zarar olmadığını çok sonra DNA solüsyonu gözün geliyor göreceksiniz.
- Yavaşça iğneyi çıkarın ve hemen PBS içinde ıslatıldıktan sonra yumurta içinde paralel elektrotlar yerleştirmek. Amniyotik sıvı, enjekte göz elektrotlar arasında yer alır, böylece bir şekilde inmeye elektrotlar aşağı doğru itin. Elektrotlar yerleştirerek sırasında herhangi bir büyük kan damarı ya da kalp dokunmaktan kaçının. DNA'nın alt retina uzaydan gelen pozitif elektrot doğru retinaya taşınacak, böylece negatif elektrot, enjeksiyon tarafında olmalıdır. Elektro950 ms aralıklarla 50 ms için 15V 5 darbeleri ile retinanın kadardir.
- Dikkatli bir şekilde elektrotlar kaldırmak ve, net seloteyip adet yumurta pencere mühürlemek.
- Etiket ve inkübatör geri koymadan önce enjekte yumurta güncel. Tipik olarak, bütün elektroporasyon işlemini tamamlamak için yaklaşık 3 - 5 dakika sürer.
- GFP, elektroporasyon sonra 8 saat olarak erken görülebilir. Ancak, embriyo Hasattan önce istenen aşamada ulaşıncaya kadar bekler.
3. Temsilcisi Sonuçlar
Bizim çalışmamızda, retinal hücre gelişimi içerdiğini gen ifadesinin düzenlenmesinde çalışmak için çeşitli plazmid yapıları kullanın. Bu videoda pCAG-GFP (transfeksiyon kontrolü) başarılı bir enjeksiyon ve elektroporasyon izlemek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, reporter gen (GFP, RFP,, vb.) Ile birlikte herhangi bir plasmid bir bir bir construct, da kullanılan uygulanmaz edebilirsiniz. GFP 8 saat olarak ele sonra erken olarak görülebilir olsactroporation, biz genellikle gün 6 yumurta (E6) ve sonrasında hasat başlatmak. Electroporated retina embriyo çıkarılmış ve gömme ve kesit önce floresan diseksiyon mikroskobu altında incelendi. Tipik olarak olarak, reporter gen ekspresyon,,, bir başarılı bir bir elektroporasyon (Fig 1) sonra,,,, en azından retinaya of, bir çeyreğinde, in görülme tarihi uygulanmaz edebilirsiniz. Transfekte retina dokularında daha fazla hücre morfolojileri net bir görünüm için kesit aracılığıyla incelendi. Kullanılarak immünohistokimyasal hücre tipine özgü belirteçleri (Brn3a, Pax6 vb.) Hücre spesifik GFP izin karakterizasyonu (Şekil 2).
Şekil 1. Başarılı muhabiri plazmid sonuç pozitif GFP elektroporasyon. Tavuk embriyonik retina enjekte edilir ve embriyonik gün 4 electroporated ve embriyonik günlük 6 hasat edildi. 25,% (,, retinanın of en azından At) başarılı bir şekilde (A = Sayfanın başına dön view, Yatak-olarak transfekte edilmiş edildi= Alt görünümü). Ölçeği Bar = 1mm.
Şekil 2. GFP Karakterizasyonu immunhistokimya ile retina hücreleri dile getirdi. E7 aşamada retina dokularında ifade GFP sabit ve kesitler alındı. Bu bölümler daha sonra çeşitli hücre özel işaretleri ile boyandı. Brn3a,, Pax6,,, yatay bir, amacrine ve ganglion hücreleri (Yatak-) belirlemek etmek kullanılan edildi ederken, belirlemek: ganglion hücreleri (A) 'kullanıcılar için kullanılan edildi. Ölçek çubuğu = 50 mikron.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hedefli retina enjeksiyon ve E4 aşamada embriyonik retinanın ovo elektroporasyon özellikle altı büyük retina hücre tipleri tek hücre düzeyinde görselleştirme becerisi ile sonuçlanan retina progenitör hücreleri hedef. HH10 de ovo elektroporasyon (~ E1.5) hedefleme optik vezikül gözü oluşturacak geliştirmek hücreleri transferinde. Ancak, bu hücreler şu anda çok yüksek bir ciro ve bu yöntemin retina hücreleri için spesifik değildir. Bu yüksek hücre devir hızı, sürekli ve kararlı bir ifade engeller olabilir. E4, By, embriyo,,,, gözün of major yapıları, all aşağıdakilerle olarak olarak oluşmuş, ancak,, retinaya in hücreleri of büyük çoğunluğu,, hala retinal stem hücreleri şunlardır olduğunu, yeteri kadar konuklar genç uygulanır olduğunu, yeteri kadar olarak geliştirilen edilir. Bu, yöntemini,, aynı zamanda,,,, ilgi çekici of, bir gen,,,, retinaya of tarafindan: Normal bir kalkınma ve / ya da hastalığı incelemek etmek hedeflenmiş uygulanmaz edebilirsiniz fonksiyon çalışmaları of, toplam / kaybı kazanmak etmek de de uygulanmış uygulanmaz edebilirsiniz.
Biz bu tekniği yayınladıktan sonraönceki kağıt 1, bu alanda çeşitli bilim adamları, bu tekniği hakkında daha fazla yardım almak için bizimle temasa. Bu yüzden, görselleştirme için bu videoyu üretmeye karar verdi. Buna ek In,, bizim tekniktir in avansları,,, this video in açıklanan uygulanır.
Bu tekniğin başarılı bir şekilde gerçekleştirmek için, izleyerek kritik faktörler açıklayan değer.
En çok kritik bir faktör,,,,, subretinal bir uzay in hassas bir biçimde iğne yerleştirebilirsiniz etmek konumundadır. Öncelikle, bir kontra-lateral göze giren ve gaga yönelerek, kan damarlarının ana paket iğne hizalamak için dikkatli olmak gerekiyor. Bu pozisyonda kalp neredeyse paralel ve beyin ve kalbin zarar verme olasılığını azaltır. , Vitellin membran, sklera, retina ve vitreus ile delerek, iğne herhangi bir kan damar yoluyla uzak ve delip seyahat olmamalıdır. Daha sonra bu iğne yeterince keskin değilse birkaç uygulamaları ile çok kolay bir şekilde yapılabilir olabilir. Sonraki adım, yavaş yavaş th geri çekmee iğne ve retinanın açılış kenarında konumu. Tamamen dışarı çekin bir şans her zaman vardır. Bunun gerçekleşmesi durumunda, daha sonra bir açılış geri iğne ucu koymak için tekrar deneyebilirsiniz. Iğnenin uygulama, subretinal alanı (sklera ve retina arasında) ve sabır gerektirir. Başlangıçta çok zor görünüyor, ancak bazı uygulama ile kolay olur. ,: DNA bir çözüm:, subretinal bir uzay içeride enjekte etme iken,,,, it,, şişiklik formasyonu gözlemlemek etmek very önemli bir konumundadır. Daha sonra, yeşil bir çözüm, anahat göz doldururken, başarılı bir enjeksiyon belirten başlar. Bir çözüm uzağa yayılır ya da ortasına göz doldurarak başlar, bu yanlış bir enjeksiyon başarılı bir elektroporasyon vermeyecektir gösterir.
İkinci faktör, optimal bir iğne imalat cam kılcal borulu ısı çekerek ve ucu kırarak üzerinden yapılır. İğneler büyük ipuçları ile zorluk piercing thr varough vitellin membran retina zarar verme şansı artar. Genellikle keskin iğne uçları bu amaç için en iyi olan. Ancak, çok küçük ipuçları ile iğne zorluk yükleme ve teslim DNA var ve göz küresi içindeki yıkmak için daha fazla şansı var. Bu nedenle, bir ucu açılışı ile iğne çapı yaklaşık 0.1 mm ve 20 mm konik 1 olun. Ayrıca, bir damlacık parafilm bir parça DNA karışımı yüklerken, iğne içi hava alma şansını artırır sıvı son bit yüklemek için çok önemlidir.
Nihayet,, elektrotlar of yerleştirerek,,,,, başarılı bir elektroporasyon başarmak etmek very kritik bir konumundadır. Bu elektrotlar bütün pozisyonlardaki, bu yüzden, gelişmekte olan eye,, elektrotlar tarihleri arasında situated edilir, olduğunu,, paralel olarak in yerleştirilir uygulanmaz gerektiğini. Elektrotlar ile herhangi bir büyük kan damarı ya da kalp dokunmadan ekstra dikkatli alınmalıdır. Bunlardan herhangi birinin zarar bile başarılı bir enjeksiyon sonrası embriyo ölüme neden olabilirgör. Farklılığı Dahası, bu iki gözleri,,, farklı şekillerde olarak yönelimli şunlardır. So olarak, it,,, negatif bir elektrot,,,,, elektrikli bir cari altında retinal hücreleri içine DNA diffuse izin vermek etmek, enjeksiyon tarafı at, her zaman olarak olmak iletişim bilgilerini bütün kullanıcılar gerektiğini olduğunu, bu yüzden,: elektrot oryantasyon hizmeti (pozitif bir vs. Negatif), değiştirmek için, zihin in tutulur uygulanmaz etmek daha zamanımız sahiptir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Tüm hayvan deneyleri Rutgers Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Tesisler Komitesi tarafından kabul edildi.
Acknowledgments
Biz onun HD kamera kullanımı (Cannon Vixia HFS100) Sayın Maaz Enver teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NIH (EY018738), New Jersey Omurilik Araştırma Komisyonu (08-3074-SCR-E-0 ve 10-3091-SCR-E-0), Busch ve Biyomedikal Araştırma Ödülü hibeler kısmen desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized pathogen-free (SPF) white leghorn chicken eggs | Sunrise Farms (Catskill, NY) | ||
| Chicken egg incubator | GQF Manufacturing | Model-1550 | Set to 60% humidity and 37.5°C. |
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | TW150F-4 | |
| 0.1 ml syringe | Hamilton Co | Gastight 1710 | Alternatively 1ml syringe can be used as well |
| Masterflex Silicone (peroxide) Tubing | Cole-Parmer | HV-96400-13 | Cut a small piece (1 cm) for attaching the glass needle to the syringe |
| Tweezers | Dumont | AA | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301-M3 | |
| Plasmid DNA | pCAG-GFP was borrowed from Dr. Connie Cepko | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Dilute it to 0.025 % with PBS |
| Pulse generator | Harvard Apparatus | BTX ECM 830 | Square wave generator |
| Electrodes | Harvard Apparatus | BTX model 514 | Our electrodes were spaced 3-5 mm apart |
| Monochrome Digital Camera | Carl Zeiss, Inc. | Axiocam MRM | |
| Fluorescent Dissection Microscope | Leica Microsystems | Leica MZ16FA | |
| Upright Fluorescence Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Zeiss Axio Imager A1 |
References
- Doh, S. T. Analysis of retinal cell development in chick embryo by immunohistochemistry and in ovo electroporation techniques. BMC. Dev. Biol. 10, (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (9), e408-e408 (2007).
- Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Hamburger, V. The stage series of the chick embryo. Dev. Dyn. 195, 273-275 (1992).
