Summary
Detta dokument beskriver ett protokoll för hela kroppen hypertermi hos möss som kan stimulera feber som villkor upp till 12-24 timmar.
Abstract
Hypertermi är en allmän term som används för att definiera den ökning av kroppstemperaturen över det normala. Det används ofta för att beskriva den ökade kroppstemperaturen som observeras under feber. Användningen av hypertermi som ett adjuvans har framträtt som ett lovande förfarande för tumörregression inom cancerbiologi. För detta ändamål, är det viktigaste kravet för att få tillförlitliga och likformig uppvärmning protokoll. Vi har utvecklat ett protokoll för hypertermi (hela kroppen) hos möss. I detta protokoll djuren utsätts för cykler av hypertermi under 90 min följt av en viloperiod på 15 minuter. Under denna period möss har enkel tillgång till mat och vatten. Hög kroppstemperatur spikar i mössen under första cyklerna hypertermi exponering förhindras genom immobilisering av djuret. Dessutom är normal saltlösning administrerades i första cyklerna för att minimera effekterna av uttorkning. Detta protokoll kan simulera feber liknande förhållanden hos möss upp till 12-24 timmar. Vi haranvänds 8-12 veckor gamla BALB / CJ honmöss att visa protokollet.
Protocol
1. Djuretik
Innan den långa tid hypertermi på möss kontrollera att förfarandet har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén. Alla förfaranden som diskuteras i detta dokument och visas i den medföljande videon godkändes av Institutional Animal etikkommitté National Institute of Immunology.
2. Förstå Hypertermi
Whole Body Hypertermi (WBH) levereras genom att placera djuren i förvärmda burar som är placerade i inkubator som hölls vid 39,5 ° C. Under standardisering av protokollet, har en temperatursensor kirurgiskt implanteras i möss och deras kroppstemperatur övervakades under olika experimentella förhållanden. Det observerades att vid placering av djuren i uppvärmd miljö, deras temperatur gradvis ökas från 37 ° C till upp till 42 ° C under den tid av 100 minuter (Figur 1). The resulterande "spik" i temperatur är intressant eftersom den inre kroppstemperaturen sköt ännu högre än den yttre omgivningens temperatur.
När kroppstemperaturen översteg 40 ° C, skulle djuret visar tecken på stress och uttorkning, såsom vätning runt nosen. Öka kroppstemperaturen över 40 ° C kommer att leda till vätning och irreversibel stress eller till och med död av djur på grund av värmestress. Därför är det viktigt att förhindra att temperaturen spikar under loppet av hypertermi.
Detta fenomen av hög temperatur spikar är associerad med den fysiska hyperaktivitet hos djuret under hypertermi exponering. Liknande temperatur spikar observerades av andra grupper också och var förknippade med den fysiska hyperaktivitet av djuret när införs till miljö med högre temperaturer 10.
I vår protokoll, möss immobiliseras under hypertermi exponeringen. Somvisas i figur 2, förhindrar immobilisering av djur temperaturen spikar.
Vi har använt 8-12 veckor gamla BALB / CJ möss för att visa detta protokoll. Protokollet är inte begränsad till en viss typ / stam av mössen.
3. Förbereda för experimentet
3,1 Inkubator
Detta experiment kan utföras i en normal CO-2-inkubator eftersom de har en bra temperaturreglering. Koppla CO 2 gasförsörjning och avlägsna vatten som håller bricka av CO 2 inkubator. I vissa modeller av inkubatorer är det möjligt att stänga av CO 2-styrenheten. Ordna hyllor i skåpet så att en mus bur kan placeras bekvämt inuti. Ställ in temperaturen på inkubatorn vid 39,5 ° C.
3,2 Burar
Typiskt hypertermi experimentet utfördes på 4 möss vid en tidpunkt. Två burar krävs, påe är placerad inuti inkubatorn och den andra är placerad utanför vid rumstemperatur. Sängkläder burar undviks, eftersom fläckar av strö blir våt med tiden vilket resulterar i icke-jämn temperatur inne i buren. Den yttre bur ska ha mat pellets och vattenflaska.
3,3 Möss immobilisering rör
Under loppet av de första 4 cyklerna av hypertermi möss immobiliseras i perforerade rör. Dessa immobilisering rör kan göras från 50 ml 'centrifugrör "rör genom piercing 3 mm hål över sin kropp och fyra sådana tuber kommer att krävas. Den 50 ml röret kan lämpligen immobilisera BALB / Cj-möss som är äldre än 8 veckor. Rör av lämplig storlek kan krävas för vissa ovanligt annan stam av möss eller möss som är mycket unga eller äldre än 50 veckor.
Placera immobilisering rör och en bur inuti inkubatorn hålls vid 39,5 ° C. Vänta minst 2 timmar, så att buren och jagmmobilization rör uppnå temperaturen i inkubatorn.
4. Första cykel av hypertermi
Möss kan uppleva uttorkning under hypertermi exponeringen. Därför innan experimentet, administrera 0,5 ml fysiologisk koksaltlösning intraperitonealt till varje mus. Använd en 26 G-nål med 1 ml spruta.
Snabbt ta ut buren placeras i inkubatorn, plats ett djur i varje immobilisering rör och placera buren tillbaka i inkubatorn. Anteckna tiden. Det är viktigt att hålla buren på samma plats i inkubatorn varje gång.
Efter 90 minuter, ta ut buren ur inkubatorn. Släpp djur från immobilisering rören och placera dem i buren vid normal temperatur med enkel tillgång till mat och vatten. Placera tomma immobilisering rör tillbaka i inkubatorn.
Efter 15 minuter, är den andra cykeln av hypertermi startades genom att leverera 0.5 ml saltlösning intraperitonealt till varje mus.
De därefter immobiliseras i 50 ml perforerade immobilisering rör och placerades i inkubatorn.
5. Efterföljande Hypertermi cykler
För första 4, är det viktigt att immobilisera möss under hypertermi exponering och för de första två cyklerna är koksaltlösning injektion ges innan börjar hypertermi perioden.
Efter dessa cykler av hypertermi följt av vila är klara möss blir acklimatisera och inte blir hyperaktiva under hypertermi exponeringen. Den intraperitoneal injektion av saltlösning kan vara nödvändig om möss lätt ta mat och vatten under vilotid.
6. Efter alla cykler avslutats är det sista steget för att undersöka djuren
Det bör inte vara någon död under hypertermi cyklerna. Varje djur måste ses mycket noggrant under den förstanågra cykler. Snabbt leta efter någon vätning runt nosen. Detta symptom är en signatur av uttorkning. Möss med sådana symtom bör omedelbart ges 0,5 ml fysiologisk koksaltlösning ip och vila i rumstemperatur. De flesta av de immobiliserade mössen kommer inte att kräva någon ytterligare vård och kommer att lyckas bära betonar hypertermi.
Efter avslutad erforderliga cykler får djuren ser svag och uttorkad, men de kommer snabbt tillfrisknar inom några timmar.
Figur 1. Variation av kroppstemperaturen på möss när buren placerades i en inkubator vid 39,5 ° C. Efter 90 minuter buren avlägsnades från inkubatorn och placerades vid 25 ° C. Röda cirklar indikerar hög temperatur spikar.
Figur 2. Variation av kärnkroppen temperaturerre av en immobiliserad möss under hypertermi cykler. Efter immobilisera djuret har höga temperaturer spikar observera inte när buren placerades vid 39,5 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Så långt tillbaka som 5000 f.Kr., behandlas egyptiska läkare tumörer med värme. Grekerna insåg värdet av värme i vissa medicinska behandlingar. De äldsta texterna Mose lag nämner Hot Springs (Mos 36:24) för att terapeutiskt höja kroppstemperaturen.
De tidigare teknikerna används antingen använda pyrogena mikrobiella extrakt för induktion av feber eller varma bad vatten för induktion av hypertermi 1. Men ingen av dessa tillvägagångssätt kan lätt övervakas eller kontrolleras. I våra protokoll möss exponeras för hypertermi på ett kontrollerat och reproducerbart sätt.
I detta förfarande är det viktigt att hålla ett öga på möss under de första två cykler av hypertermi. I fall pälsen finns våt eller överdriven vätning observeras runt nosen, ska de omedelbart få vila och ge fysiologisk koksaltlösning intraperiotoneally att förhindra uttorkning vid rumstemperatur.
tält "> Efter återhämtning, kan sådana djur utsättas för hypertermi igen. Det är intressant att konstatera att efter 3-4 cykler av hypertermi flesta möss inte blir hyperaktiva och de aktivt konsumera vatten och mat under viloperioden.Några kliniska protokoll för att använda artificiellt inducerad hypertermi vid cancerbehandling har utvecklats på senare tid 4,9,11. Det finns några rapporter om användning av hypertermi är i förhållande till tumörregression 3,5-8,12. I en nyligen papper, Jia et al. har använt mikrovågsugn värmare för att exponera djur kort varaktighet (30 min) hela kroppen hypertermi 5. Den långa tid (som varar i några timmar) hela kroppen hypertermi är en mer utmanande förfarande. Vi har beskrivit ett mycket enkelt och billigt protokoll för lång tid hypertermi exponering. Det är ett mycket lovande verktyg för att utveckla en övergripande strategi för behandling av cancer. Med större medvetenhet om enkelhet och användbarhet of hypertermi procedur, kan det bli mer populärt bland forskare och kliniker 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermistor | RS components | 528-8558 | |
| CO2 Incubator | Heraeus | B5060 EK-CO2 | |
| Mice cages | Citizen industries ltd. | Type B 365X207X190 cm | |
| Animal feed | Provimi India | ||
| Water bottle for cage | Local supplier | Glass bottle | |
| Soldering iron | Solderon, India | ||
| 50 ml Centrifuge tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| Timer | Local supplier | ||
| 1 ml Syringe with 26G needle | BD Biosciences | 309602 | |
| Saline | Local supplier |
References
- Braude, A. I., Beck, J., Zalesky, M. Febrile response to bacterial pyrogens in leukemia. Blood. 16, 1279 (1960).
- Dovern, E. Hyperthermic intraperitoneal chemotherapy added to the treatment of ovarian cancer. A review of achieved results and complications. Eur. J. Gynaecol. Oncol. 31, 256 (2010).
- Gaworek, J., Mayer, C. T. Systemic whole body hyperthermia in oncology: fatal heat for tumor cells. Pflege. Z. 56, 15 (2003).
- Hegewisch-Becker, S. Effects of whole body hyperthermia (41.8 degrees C) on the frequency of tumor cells in the peripheral blood of patients with advanced malignancies. Clin. Cancer Res. 9, 2079 ( ).
- Jia, D. Inhibition of B16 murine melanoma metastasis and enhancement of immunity by fever-range whole body hyperthermia. Int. J. Hyperthermia. 27, 275 (2011).
- Maluta, S., Dall'oglio, S., Nadalini, L. Treatment for intermediate and high-risk prostate cancer: controversial issues and the role of hyperthermia. Int. J. Hyperthermia. 26, 765 (2010).
- Moyer, H. R., Delman, K. A. The role of hyperthermia in optimizing tumor response to regional therapy. Int. J. Hyperthermia. 24, 251 (2008).
- Muthana, M., Multhoff, G., Pockley, A. G. Tumour infiltrating host cells and their significance for hyperthermia. Int. J. Hyperthermia. 26, 247 (2010).
- Ostberg, J. R., Repasky, E. A. Comparison of the effects of two different whole body hyperthermia protocols on the distribution of murine leukocyte populations. Int. J. Hyperthermia. 16, 29 (2000).
- Pritchard, M. T. Protocols for simulating the thermal component of fever: preclinical and clinical experience. Methods. 32, 54 (2004).
- Repasky, E. A. Characterization of mild whole-body hyperthermia protocols using human breast, ovarian, and colon tumors grown in severe combined immunodeficient mice. Infect. Dis. Obstet. Gynecol. 7, 19 (1999).
- Willnow, U. Treatment of otherwise incurable tumor diseases in childhood using whole-body hyperthermia and chemotherapy. Dtsch. Med. Wochenschr. 114, 208 (1989).
