Summary
Изоляция первичной микроглии с сотового неоднородность мозга необходимо исследовать их роль как в физиологических и патологических состояниях. Этот протокол описывает механической изоляции, смешанная техника культуры клеток, что обеспечивает высокую производительность и высокую чистоту, жизнеспособных первичных клеток микроглии для
Protocol
1. Препарирование ткани мозга новорожденных крыс
- Холод Лейбовиц в L-15 условных СМИ (Лейбовиц L-15 + 0.1% BSA + 1% Pen / Strep) до 4 ° C. Теплый питательных сред (DMEM + 10% FBS + 1% пенициллин / стрептомицин) до 37 ° C. Подготовка 4 60x15 мм чашки Петри с 4-5 мл условно L-15 средств массовой информации на льду. Стерилизовать всех хирургических инструментов со 100% этанола.
- Промойте P2 новорожденных щенков рэп с 70% этанола. (Новорожденных крысят в возрасте от P1-P5 может быть использована в данном протоколе.)
- Быстро обезглавить крысу щенка стерильными острыми ножницами и удалить голову сразу на 70% этанола. Повторите эти действия для в общей сложности 5 крысят затем передать голову в физиологический раствор.
- Удалить все мозги из головы и место в чашку Петри с 4 - 5 мл L-15 решением (Лейбовиц L-15 + 0.1% BSA + 1% Pen / Strep) на льду.
- Повторите процедуры 1,2 - 1,4 для остальных щенков в помете.
- Удалить из оболочек головного мозга и передавать деIRED ткани головного мозга (например, кора головного мозга, мозжечок, весь мозг, и т.д.) в новую чашку Петри с 4-5 мл L-15 решением (Лейбовиц L-15 + 0.1% BSA + 1% Pen / Strep) на льду.
2. Подготовка смешанной популяции клеток глии
- Без повреждения мозговой ткани с помощью ножниц или лезвия, передает ткани с 10 мл пипетки на 50 мл стерильной коническую трубку.
- Центрифуга коническая в 2500 RCF в течение 5 мин при 4 ° C.
- Аспирируйте супернатант. Добавить 4-5 мл свежего L-15 средств массовой информации (Лейбовиц L-15 + 0.1% BSA + 1% Pen / Strep).
- Внесите ткань вверх и вниз 10 раз стерильной пипеткой 10 мл.
- Поставьте клетку фильтр (100 мкм поры) на новый 50 мл коническую трубку. Внесите ткань вверх и вниз один раз стерильной пипеткой 5 мл, с пипеткой вплотную к клетке сито, отказаться от материала через ячейку фильтр в конической трубе.
- Промойте ячейки фильтра с 4-5 мл свежего L-15 средств массовой информации (Лейбовиц L-15 + 0.1% BS+ 1% Pen / Strep).
- Центрифуга коническая с напряженными клеток в 2500 RCF в течение 5 мин при 4 ° C.
3. Покрытие и обслуживания смешанных глиальных культурах клеток
- Для каждого крысят мозг обработки приготовления 1 стерильный Т-75 колбу, добавляя 12 мл культуральной среды (DMEM + 10% FBS + 1% пенициллин / стрептомицин) в каждую колбу.
- Аспирируйте супернатант из гранулированных клеток и добавить 5-6 мл культуральной среды в осадок клеток. Пипетировать вверх и вниз 10 раз с 10 мл пипетки.
- Передача равный объем клеточной суспензии для каждого Т-75 колбу.
- Инкубируйте колбы в 5% СО 2 инкубатор при 37 ° С в течение всего 1-3 недели.
- Фляги должны быть сначала выдерживают в течение 5 дней, а на пятый день, заменить культуру средств массовой информации в каждую колбу с 12 мл свежей среды и вернуться в инкубаторе. Затем каждые 3 дня, заменить условный СМИ в каждую колбу с 12 мл свежей среды для достижения слияния. Это необходимо делатьпе очень осторожно, не касаясь дна колбы, где клетки придают.
4. Изоляция и покрытие первичных Микроглия
- После смешанной глиальных культурах полностью сливающиеся, удалите колбы из инкубатора и охватывают колбы с крышками для предотвращения парафильмом газообмен с окружающего воздуха.
- Встряхнуть колбы на 100 оборотов в секунду (Лаборатория Companion SI-600, Jeio Tech) в течение 1 часа при температуре 37 ° C.
- Сбор средств массовой информации из всех колбы с 10 мл пипетки, не нарушая астроцитов слоя на поверхности колбы. Место СМИ в 50 мл конические пробирки. Добавить свежие СМИ колб и возвращения колбы в инкубатор.
- Центрифуга конических труб в 2500 RCF в течение 5 мин при 4 ° C.
- Аспирируйте супернатант из всех конических труб. Сотовые гранулы клеток микроглии высокой чистоты. Ресуспендируйте гранул в 1 мл микроглии покрытие СМИ (DMEM + 10% FES + 1% пенициллин / стрептомицин).
- Подсчитайте плотность клеток в средах с помощью ресуспендированногогемоцитометра.
- Добавить соответствующий объем средства массовой информации микроглии покрытие для достижения 2-х 10e5 клеток на мл плотности. Пластина по мере необходимости для экспериментального анализа.
- Позвольте микроглии приложить на ночь.
5. Представитель Результаты
Протокол, описанный выше результаты в высокой степени чистоты первичных культур микроглии. Как определяется иммуногистохимии для макрофагов / микроглии клетки специфического маркера (Iba1), покрытие культур микроглии составляет> 90% чистой (рис. 2). Кроме того, для окрашивания астроцитов, олигодендроцитов и нейронов клетки специфических маркеров свидетельствует о минимальном загрязнении (рис. 2). После создания смешанных культурах клеток глии, микроглии могут быть выделены путем встряхивания до 4 раз подряд. Начальная изоляции микроглии даст примерно 2,2 х 106 клеток / мл или около 9 миллионов клеток на 10 колб и ожидаемую доходность уменьшается с каждым последующим шаке. Микроглия изолированы с помощью этого метода были успешно использованы для исследования фагоцитоза способности, функции, такие как продукцию оксида азота и токсичности нейронов (рис. 3) 13-14.
Рисунок 1. Обзор протокола для подготовки смешанных культурах клеток глии и изоляции первичной микроглии.
Рисунок 2. Изоляция высокой чистоты микроглии, что подтверждается иммуногистохимического анализа с использованием микроглии (МБА-1, красный), астроцитов (GFAP, зеленый), нейронов (NeuN, красный) и олигодендроцитов (СС1, красный) специфических маркеров. Окрашивание ДНК клеток в культуре DAPI (синий) также показано на рисунке.
Рисунок 3. Микроглия изолированы в методе ОПИСАНИЕкровати были использованы в ряде тестов, в том числе, но не ограничиваясь, фагоцитоз анализы, анализы функции и нейротоксичность исследований. В этих исследованиях мы обнаружили, что микроглии (МБА-1 позитивное, зеленый), при воздействии на управление (A) или LPS (B) рассматривается средствами массовой информации, повышение их фагоцитоз флуоресцентно меченных бисером латекса (красные), которые можно количественно ( C). Кроме того, ЛПС (1ng/ml) лечение может увеличить производство азотной окиси в микроглии (D). Наконец, как через Transwell вставки разделенных или прямой микроглии-нейронных культур, мы обнаружили, что микроглии инкубируют с LPS может вызывать гибель нейронов, как измеряется лактатдегидрогеназы (ЛДГ), выпуск (E, F).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В то время как этот протокол обычно используется для получения чистого и здорового микроглии для научных экспериментов, тщательного изучения технических аспектов в критических частях процедура позволит свести к минимуму различия в изолированных микроглии. Во-первых, во время рассечения ткани мозга от новорожденных крысят, работающих в своевременной необходимо минимизировать гипоксического и ишемического повреждения тканей. Тем не менее, важно также, чтобы полностью удалить менингеальные покрытия из головного мозга во время вскрытия, так как наличие мозговых оболочек, будет способствовать значительному загрязнению фибробластов в связи с их быстрым темпом распространения культуры в этих условиях.
Во-вторых, бережное обращение с тканью материала в процессе подготовки смешанной культуре клеток глии важно также ограничить повреждение клеток, смерть, или чрезмерной активации микроглии. При добавлении в культуру средств массовой информации, следует проявлять осторожность, чтобы не повредить астроцитов Пнolayer. Кроме того, при встряхивании колбы для изоляции микроглии, регулируя частоту тряски могут быть необходимы, чтобы предотвратить выплескивание или образование пузырьков воздуха в средствах массовой информации. Эти события могут увеличить астроцитов загрязнение или вызвать повреждение клеток в культуре. При разработке этой методики в лабораторных условиях, может быть необходимо, чтобы начать с низкой прочностью физических тряска (например, 100 оборотов в минуту) и заметим, культуры клеток и супернатант микроскопии до повышения качая силу и срок получить желаемую доходность микроглии без астроцитов загрязнения.
Еще одним фактором в процессе оптимизации этого протокола в лаборатории является определение периода времени смешанных культурах клеток глии должна быть сохранена до изоляции первичных микроглии для обшивки. Хотя первоначальные изоляции может произойти от 1 до 3 недель после создания культуры, слияния микроглии на астроциты монослой будет отличаться и могут ввлиянием микроглии биологии в нижнем течении эксперимента. Кроме того, последующие выделения из той же смешанной культуре клеток глии, возможно, должны быть основаны на слияния культуры по сравнению с указанной продолжительностью от тряски процедур. Кроме того, так как выход из последующего снижения изоляции, важно отметить, свойств клеток первичной микроглии может отличаться от первой до последней изоляции. Таким образом, эксперименты должны проводиться в технических повторяет с тщательным обозначения при микроглии изолированы.
Наконец, в то время как этот протокол рассматривает микроглии изоляции от крысят мозг, успешная изоляция микроглии может быть достигнуто с помощью мыши и других нервных тканей, таких как спинной мозг. Никаких существенных изменений в протокол необходимых для этих альтернативных источников микроглии, помимо увеличения начальной рацион покрытие для смешанных культур (например, 2 для мыши brains/T75 колбу или 3-4 спинного сотрудничествавыстрелов из P2 крысы pups/T75 колбы). Кроме того, как и следовало ожидать, мобильный выход имеет тенденцию к уменьшению в соответствии с уменьшением исходного материала. Однако, несмотря на получение более низкие урожаи с использованием ткани мозга мышей, одним из важных преимуществ является возможность исследовать молекулярные механизмы микроглии физиологии и реактивность использование тканей головного мозга трансгенных мышей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Финансируется очной программы в силовых университета Services.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm x 15 mm Petri dishes | Fisher brand | 0875713A | |
| Sharp dissecting scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | |
| Dumont #7b forceps- standard tips, curved, 11cm | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| Dumont #5 forceps-standard tips, straight, 11 cm | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| 50 ml conical centrifuge tubes | VWR | 89039-656 | |
| 5 ml serological pipettes | Grenier Bio One | 606180 | |
| 10 ml serological pipettes | Grenier Bio One | 607180 | |
| 100 μm sterile nylon cell strainer | Falcon | 35-2360 | |
| 75 cm2 tissue culture flasks | Corning | 430641 | |
| Dulbecco's minimal essential medium (DMEM) | Gibco (Invitrogen) | 31053-028 | |
| Leibovitz's L-15 medium | Gibco (Invitrogen) | 11415064 | |
| Fetal bovine serum | Gibco(Invitrogen) | 16000-036 | |
| Fetal equine serum | Fisher | SH3007402 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco (Invitrogen) | 15140163 | |
| 100% Ethanol | The Warner Graham Company | 64-17-5 | |
| Phosphate buffered saline solution, 10X, pH 7.4 | Quality Biological, inc. | 119-069-131 | 1X in sterile, distilled water |
| Biohazard bags | VWR | 14220-028 | |
| Haemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| 6-well cell culture plates with cellBIND surface | Corning | 3335 |
References
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Raivich, G., Bohatschek, M., Kloss, C. U., Werner, A., Jones, L. L., Kreutzberg, G. W. Neuroglial activation repertoire in the injured brain: graded response, molecular mechanisms and cues to physiological function. Brain Res. Brain Res. Rev. 30, 77-105 (1999).
- Loane, D. J., Byrnes, K. R.
- Glass, C. K., Saijo, K., Winner, B., Marchetto, M. C., Gage, F. H.
- Pocock, J. M., Liddle, A. C. Microglial signalling cascades in neurodegenerative disease. Prog. Brain Res. 132, 555-565 (2001).
- Block, M. L., Hong, J. S. Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity. Biochem. Soc. Trans. 35, 1127-1132 (2007).
- Barger, S. W., Basile, A. S. Activation of microglia by secreted amyloid percursor protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synpatic function. J. Neurochem. 76, 846-854 (2001).
- Ni, M., Aschner, M. Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications. Curr. Protoc. Toxicol. Chapter 12, Unit 12.17 (2010).
- Hassan, N. F., Rifat, S., Campbell, D. E., McCawley, L. J., Douglas, S. D. Isolation and flow cytometric characterization of newborn mouse brain-derived microglia maintained in vitro. J. Leukoc. Biol. 50, 86-92 (1991).
- Hassan, N. F., Prakash, K., Chehimi, J., McCawley, L. J., Douglas, S. D. Isolation and characterization of newborn rabbit brain-derived microglia. Clin. Immunol. Immunopathol. 59, 426-435 (1991).
- Hassan, N. F., Campbell, D. E., Rifat, S., Douglas, S. D. Isolation and characterization of human fetal brain-derived microglia in in vitro culture. Neuroscience. 41, 149-158 (1991).
- Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus: immunophenotypic and functional characteristics. J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).
- Byrnes, K. R., Stoica, B., Loane, D. J., Riccio, A., Davis, M. I., Faden, A. I. Metabotropic glutamate receptor 5 activation inhibits microglial associated inflammation and neurotoxicity. Glia. 57, 550-560 (2009).
- Loane, D. J., Stoica, B. A., Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Faden, A. I. Activation of metabotropic glutamate receptor 5 modulates microglial reactivity and neurotoxicity by inhibiting NADPH oxidase. J. Biol. Chem. 284, 15629-15639 (2009).
