Summary
특정 조건에서 배양해 때 결핵은 Mycobacterium 마약 허용 biofilms를 형성합니다. 여기 culturing M.하는 방법을 설명 결핵 biofilms 및 약물 관용 persisters의 주파수를 결정. 이러한 프로토콜은 M.의 약물 내성의 메커니즘에 대한 연구를 위해 도움이 될 것입니다 결핵.
Abstract
결핵은 Mycobacterium 인간 결핵의 etiologic 에이전트, 항생제를 포함하여 환경 스트레스에 대한 생존을 위해 특별한 능력이있다. 비록 M.의 스트레스 내성 결핵은 결핵 1 6 개월 동안 화학 요법에 대한 가능성 참여자 중 하나입니다, 병원체의 특성 표현형의 기본 분자 메커니즘은 불분명 남아있다. 대부분의 미생물 종은 biofilms 2-4이라는 조직화 첨부 표면, 그리고 매트릭스 캡슐 구조로 자기 조립에 의해 스트레스 환경에서 생존하기 위해 진화했습니다. 지역 사회의 성장 미생물 선호하는 생존 전략이 될 것 같습니다, 그리고 표면 부착, 세포 통신, 그리고 세포외 고분자 물질의 합성 (EPS) 5,6 조절 유전자 구성 요소를 통해 이루어진다. 환경 스트레스에 대한 내성 가능성이 높습 physiolo에 의해 아마 EPS에 의해 촉진하고있다biofilms 7의 복잡한 아키텍처 내에서 이기종 microenvironments 개별 bacilli의 gical 적응.
최근 논문 일련의 우리는 그 설립 M. 결핵은 Mycobacterium의 smegmatis과 50 개 이상의 배 안티 - 결핵 약물 isoniazid와 rifampicin의 8-10의 최소 억제 농도를 용인할 수 biofilms라는 조직 다세포 구조로 성장하는 강한 성향을,,합니다. M. 미디어뿐만 아니라 분위기 9 공기의 제한된 교류 : 결핵 그러나 intriguingly 헤드 스페이스의 특정 9시 1분 비율로 성숙 biofilms를 형성하는 특정 조건이 필요합니다. 특수 환경 조건의 요구는 것도 M. 사실에 링크된 수 결핵은 의무를지게 인간 병원체이며, 따라서 조직 환경에 적응하고있다. 본 출판물에서 우리는 culturing M.하는 방법을 보여줍니다 결핵병 및 세균뿐만 아니라 유전자 연구를위한 편리한 12 잘 플레이트 형식의 biofilms. 우리는 M.의 감쇠 변형을 위해 프로토콜을 설명했습니다 병원체 9 생체내 성장을위한 중요한 두 loci, panCD 및 RD1에서 삭제와 결핵, MC이 7000. 이 변형은 안전 따라서 고가의 BSL-3 시설의 요건을 피하 결핵 병원체의 기본적인 생물학을 이해하기위한 BSL-2 억제에 사용할 수 있습니다. 방법은 다른 culturable mycobacterial 종 biofilm 성장을 위해, 미디어의 적절한 수정으로 연장하실 수 있습니다.
전반적으로, culturing mycobacterial biofilms의 유니폼 프로토콜 mycobacteria의 기본 탄력적인 특성을 공부에 관심이 수사를하는 데 도움이됩니다. 또한, 성장 mycobacterial biofilms의 분명하고 간결한 방법도 임상 및 제약 인보이스 도움이 될 것입니다estigators는 잠재적인 약물의 효능을 테스트합니다.
Protocol
1. M.의 성장 biofilms 250mL 나사 덮힌 병의 결핵
- 미디어 준비 : 물 900mL에 글리세롤의 60mL, 산화철 구연산 암모늄의 0.05g MgSO 4 KH 2 PO 4 0.5g, L-아스파라긴의 4g, 구연산 산성의 2g의 0.5g 디졸브. NaOH로 7.0으로 산도를 조정합니다. 압력솥, 시원하고 직전에 실험을 시작으로, 0.1 % w의 최종 농도로 멸균 ZnSO 4를 추가 / 대 MC 2 7000 판토텐산 auxotroph이므로 이러한 변형은 또한 최종 농도 10μg/mL에서 판토텐산이 필요합니다.
참고 : 이것은 M. 결핵에 사용 Sauton의 미디어의 표준 구성입니다. 필요한 경우에는 다른 전문 미디어는 또한 다른 mycobacterial 종의 사용할 수 있습니다.
- Inoculums 준비 : M.을 키운 0.05 % 0.7-1.0 중 한 주 동안 십대 초반-80, 또는 OD 600 7H9OADC에서 결핵. 세제곱lture 직접 1:100 희석에 inoculum으로 사용할 수 있습니다.
- 250mL 나사 뒤덮힌 폴리스티렌 병 (코닝)에 Sauton의 미디어 25mL 하는걸. 아주 단단히 매체, 캡 병에 inoculum의 250μl를 추가, 3 주 동안 humidified 37 ° C 배양기에서 그대로 가져 오십시오. 전혀 오염이 없다는 것을 보장하기 위해 매일 한 번씩 병을 관찰.
- 셋째 주말에, M의 추가 성장을 허용하도록 병 뚜껑을 느슨하게 인터페이스에서 결핵. 뚜껑이 단계에서 느슨하게하지 않는 경우 다음 컨테이너에 부족한 산소 농도는 박테리아의 추가 성장을 병신 것입니다.
2. M.의 성장 12 잘 접시에 결핵 biofilms
- 섹션 A1과 A2에서 설명한대로 두 MC 7000의 미디어와 inoculum를 준비합니다.
- inoculum의 600μl와 미디어 60mL를 섞는다. 4.5m 특면플레이트의 각도에 혼합물의 패. 뚜껑이있는 접시를 덮어. parafilm으로 접시를 여러 번 감싸주세요. 오주 동안 37 ° C에서 humidified 인큐베이터에서 그대로 접시를 품어.
3. M.에서 마약 관용 persisters의 주파수를 결정 결핵 biofilms
- M.을 키운 섹션 B. 이것은에 설명된대로 12도 형식으로 결핵 biofilms은 약 5 주간의 합계를 취할 것입니다.
- biofilms가 성숙되면 (인큐베이션의 5 주 후에) 피펫으로 microtip을 사용 biofilms 아래 미디어에 원하는 농도에서 항생제의 선택을 주입.
참고 : pellicles 아래 미디어의 볼륨이 약 3.0mL를 줄여줍니다. 그래서 수사관들이 적절하게 약물의 양을 계산한다.
- 소용돌이 항생제가 철저하게 중간에 한짓되어 부드럽게되도록 접시. 통계적으로 의미있는 결과를 얻으려면 antibi 투입네 우물의 귀의. 병렬에서 항생제가 다른 네 우물에서 해체되는 용매의 동일한 볼륨을 삽입하고, 온전히 접시의 마지막 네 우물 둡니다. 뚜껑에 커버 플레이트와 플레이트 주변 parafilm 신선한 레이어를 넣어. 원하는 기간 동안 인큐베이터에 다시 놓습니다.
- 배양이 끝나면 플레이트를 열고 우물 각 0.1 %의 최종 농도 (부피 / 부피)에 십대 초반-80 추가합니다. 소용돌이 세제의 균일한 분산을위한 부드럽게 전체 판. 15 분 동안 상온에서 접시를 품어. 그 전체 내용이 균일하게 15mL 원뿔 튜브로 전송 수 있도록 피펫 여러 번 각 우물의 내용을 섞는다.
- 상온에서 10 분 동안 4000rpm에서 튜브의 내용을 봐. 신선한 세차 버퍼 (10 % 글리세롤 및 0.05 % 십대 초반-80와 PBS)의 5mL에 펠렛을 Resuspend. 세탁 세 번 반복합니다. 세차 버퍼의 5mL에 펠렛을 Resuspend. O를 위해 로커에 보관4에 vernight ° C.
참고 : 저온 원래 M. smegmatis (분산 동안 성장을 최소화하기 위해)를 위해 개발뿐만 M. 결핵에 사용되었지만, 느린 성장하는 수종은 대부분 결과에 어떤 영향없이 상온에서 누볐어 수 있습니다. BSL-3 시설에서 근무하는 경우에는 실온에서 출렁 이는 것은 필요할 수 있습니다.
- , 적절한 크기의 넓은 끝을 절단 주사기에 맞추려고하고 parafilm로 포장하여 microtip (2-200μl)를 들으며 멸균 주사기를 준비합니다. 팁-장착되어 주사기를 통해 튜브의 전체 내용을 전달하고 신선한 15mL 튜브에 수집합니다. 당신은 매우 동질적인 서스펜션을 관찰할 때까지이 단계에게 5-6 회 반복합니다.
- 각 우물에 가능한 콜로니의 수를 결정하는 7H11OADC 접시 서스펜션과 접시 dilutions의 일련 dilutions을 준비합니다. 37 ° C 배양기에서 3 주 동안 번호판을 품어. frequen를 결정용매 처리 접시에서 얻은 이들에게 치료를 항생제로 얻은 콜로니 수의 비율을 계산하여 biofilm 인구의 persisters의 사.
4. 대표 결과
M. 한 병에서 배양해, 성장 결핵은 첫 번째 주말에 병 기지에서 볼 수 있습니다. 공기 미디어 인터페이스의 성장이 세 번째 주 (그림 1A)의 끝 부분에 지속적으로 볼 수 있지만 두 번째 주말함으로써, 공기 미디어 인터페이스에 대한 박테리아의 누덕누덕 기운 성장은 볼 수있다. 이때 용기의 벽에 박테리아의 부착도 관찰됩니다. 이 시점 이후로 문화의 성장은 주로 에어 미디어 인터페이스에서 발생합니다. 표면 성장을 아래에 액체가 분명하다. 일반적으로 구조는 다섯 번째 주 (그림의 1B)의 말까지 자라게. 부화가 장기간 경우 구조 컨테이너의 바닥에 침몰하기 시작합니다. Intriguingly,셋째 주말까지 뚜껑의 강화하는 과정에서 중요한 단계이며, 알려지지 않은 이유로 느슨한 덮인 병을 크게 인터페이스 9 성장의 개시를 retards.
12 음 형식에서는 공기 미디어 인터페이스에서 강력한 biofilm 다섯 주 (그림 2A)의 끝에 우물 각각 볼 수있다. 접시가 완전히 포장되지 않은 경우 다음 차동 biofilm 성장을 준수하고 있습니다. 최악의 경우에는 상당한 미디어 증발은 박테리아의 성장 (그림 2B)이 정지될 수 있습니다. 따라서, 번호판을 배치하는 것은 모두 증발을 방지하기 위해뿐만 아니라 biofilm 형성 (이전 단락을 참조) 환경을 제공하기 위해 필요합니다.
이 기법으로 결정 biofilms의 유력한 bacilli의 수는 아주 재현할 수있다. M.의 응답 결핵 biofilms는 항생제의 성격에 따라 다릅니다. 같은 rifampicin과 같은 bactericidal 항생제의 경우 생존의 손실 bipha을 따른다 SIC 동향 9. 인구의 작은 비율에 관계없이 항생제 또는 노출 시간 농도의 항생제에 완전히 고집 불통 남아있는 영구적인 단계 다음에 첫 번째 3~4일 동안 생존의 급격한 하락. 그림 3은 rifampicin의 50μg/mL에 7 일간 노출 (MIC보다 50 배 이상) 후 성숙 biofilms의 유력한 bacilli의 개수를 보여줍니다.
M.의 그림 1A. 초기 모습 배양 3 주 후에 박테리아의 공기 미디어 인터페이스 결핵 bacilli.
그림 1B 있습니다. M.의 biofilms를 성숙 인큐베이션 다섯 주 후에 공기 미디어 인터페이스에 대한 결핵.
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M.의 그림 2A 있습니다. 5 주 오래된 biofilms 결핵은 12도 형식으로 재배.
그림 2B. parafilm없이 12 잘 플레이트에서 M. 결핵 biofilms 양성하는데 실패 시도.
M.에서 마약 관용 persisters의 빈도를 보여주는 3. 대표 플롯 그림 결핵은 12도 형식으로 재배하고 이레 동안 Rifampicin으로 50μg/mL에 노출 biofilms.
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Discussion
은 Mycobacterium 결핵의 감염에 의한 결핵 (TB)는, 세계 공중 건강에 큰 위협이 남아있다. 세계 인구의 거의 삼분의 일은 asymptomatically 병원체에 의해 감염된 것으로 추정되며, 9 백만에 관한 새로운 환자가 활성 결핵 및 감염의 약 170 만 다이 매년 11 증상으로 매년 병원에 표시됩니다. 질병의 큰 부담은 주로 백신과 6~9개월 걸쳐 실시 multidrug 섭생과 관련된 매우 복잡한 화학 요법의 부족에 의해 공헌된다. 장기간 화학 요법은 크게 항생제 12 확장된 노출을 요구하는 병원체의 작은 subpopulation의 phenotypic 내성에 따라 결정됩니다. 이러한 persisters을 대상으로하는 결핵이 부족하고 효과적인 치료에 중요하지만, 이러한 persisters의 발전의 기본 메커니즘은 불분명 남아있다.
대부분의 미생물 speci그들의 자연 서식지에있는 네;은 저절로 자기 조립 성장, 표면 첨부된 다세포 커뮤니티 항생제 3 ~ 매우 관용있다 biofilms를했다. 최근에는, 그것은 여러 mycobacterial 종은, 마약 허용 persisters 9,13-15 개발을 촉진 microenvironment를 제공 biofilms으로 체외에서 성장하는 강한 성향을 가지고하는 것으로 나타났습니다. 빠른 등 M. 같은 환경 수종 성장하는 동안 smegmatis는 쉽게 속도가 느린 성장하는 병원성 종 M., 세제없는 미디어 biofilms를 형성할 수 결핵은 다세포 구조에게 9 형성 특정 조건을 필요로합니다. culturing M. 이후 biofilms의 결핵은 약물은 인내와 끈기, culturing에 대한 자세한 프로토콜은 오픈 소스를 통해 biofilms의 병원체는 특히 자원이 제한된 countr에서 결핵 연구에 도움이 될 것이다 보급의 메커니즘에 중요한 통찰력을 제공할 수Y.
여기 M. 재배하는 방법을 설명 상세 biofilms에서 결핵. 우리는 또한 biofilms 부러 뜨 리고 인구 가능한 bacilli의 수를 결정하는 프로토콜을 제공합니다. 이 기술은 문화의 약물 관용 persisters의 수를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. culturing의 biofilms에있는 세 개의 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 1) 적절한 세제없는 미디어의 선택, 첫 3 주 동안 문화 컨테이너를 폐쇄하고, 후속 인큐베이션위한 오픈 컨테이너. 또한, humidified 상태 컨테이너를 유지하면 5 주간의 배양 기간 동안 매체의 증발을 방지하는 것이 중요합니다. 이것은 상당히 결과의 재현성을 방해하실 수 있습니다.
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Disclosures
우리는 공개 할게 없다.
Acknowledgments
작품은 건강과 미국 폐 협회의 국립 연구소의 재정 지원으로 실시되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator | VWR international | Model # 1923/25 | |
| Polystyrene culture bottles | Fisher Scientific | 03-374-300 | |
| 12-well tissue culture plate | VWR international | 62406-165 | |
| 50-mL conical tubes | VWR international | 89039-660 | |
| Rocker | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 57019-662 | |
| Chromatographic refrigerator | VWR international | 55702-520 | |
| petri dish | VWR international | 25384-342 | |
| KH2PO4 (monobasic) | EMD Millipore | PX1565-1 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M65-500 | |
| L-asparagine | Sigma-Aldrich | A4284-100G | |
| citric acid | Sigma-Aldrich | C1857-100G | |
| ferric ammonium citrate | Sigma-Aldrich | F5879-100G | |
| glycerol | EMD Millipore | GX0185-5 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045-500G | |
| ZnSO4 | Sigma-Aldrich | Z4750-500G | |
| D-pantothenic acid | Sigma-Aldrich | P2250-25G | |
| Difco Middlebrook 7H9 Broth | BD Biosciences | 271310 | |
| Middlebrook OADC Enrichment | BBL | 212351 | |
| Tween-80 | Fisher Scientific | T164-500 | |
| 250mL storage bottle | Corning | 430281 | |
| 12 well plates | Falcon BD | 353043 | |
| rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501-1G | |
| methanol | JT Baker | 9070-05 | |
| 10mlLsyringe | BD Biosciences | 301604 | |
| 1-200μL pipet tips | VWR international | 89079-458 | |
| parafilm M | VWR international | PM-996 | |
| 15mL centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188-285 | |
| Difco Mycobacteria 7H11 Agar | BD Biosciences | 283810 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Na2HPO4 (dibasic) | Sigma-Aldrich | S0876-500G |
References
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