Summary
Mycobacterium tuberculosis forma biofilm droga tolleranti, quando coltivate in determinate condizioni. Qui si descrivono i metodi per la coltura M. biofilm tubercolosi e che determinano la frequenza di persistenti droga tolleranti. Questi protocolli saranno utili per ulteriori studi sui meccanismi di tolleranza al farmaco in M. tubercolosi.
Abstract
Mycobacterium tuberculosis, l'agente eziologico della tubercolosi umana, ha una straordinaria capacità di sopravvivere contro gli stress ambientali, compresi gli antibiotici. Sebbene la tolleranza allo stress di M. la tubercolosi è uno dei contributori probabili a 6 mesi di chemioterapia lunga serie di tubercolosi 1, i meccanismi molecolari alla base di questo fenotipo caratteristico del patogeno rimangono poco chiari. Molte specie microbiche sono evoluti per sopravvivere in ambienti stressanti con l'auto-assemblaggio in altamente organizzato, superficie attaccata, e matrice di strutture incapsulate chiamata biofilm 2-4. La crescita nelle comunità sembra essere una strategia di sopravvivenza preferito di microbi, e si ottiene attraverso componenti genetiche che regolano la superficie di applicazione, le comunicazioni intercellulari, e la sintesi di sostanze polimeriche extracellulari (EPS) 5,6. La tolleranza allo stress ambientale è probabilmente facilitata da EPS, e forse dal fisiologicoadattamento gico di bacilli individuale microambienti eterogenei all'interno della complessa architettura dei biofilm 7.
In una serie di lavori recenti abbiamo stabilito che M. smegmatis Mycobacterium tuberculosis e hanno una forte propensione a crescere in strutture organizzate pluricellulari, chiamata biofilm, che può tollerare più di 50 volte le concentrazioni minime inibenti dei farmaci antitubercolari isoniazide e rifampicina 8-10. M. la tubercolosi, però, richiede intrigante condizioni specifiche per formare biofilm maturi, in particolare il rapporto di 9:01: spazio di testa dei media così come limitato scambio d'aria con l'atmosfera 9. Requisiti di specializzati condizioni ambientali potrebbe essere legato al fatto che M. la tubercolosi è un patogeno obbligato umana e quindi si è adattata agli ambienti dei tessuti. In questa pubblicazione si dimostra metodi di coltura M. tubercolosibiofilm in una bottiglia e un 12-pozzetti piastra, che è conveniente per studi batteriologici nonché genetica. Abbiamo descritto il protocollo per un ceppo attenuato di M. la tubercolosi, mc 2 7000, con l'eliminazione nei due loci, i panCD e RD1, che sono fondamentali per la crescita del patogeno vivo 9. Questo ceppo può essere tranquillamente utilizzato in un BSL-2 di contenimento per la comprensione della biologia di base del patogeno della tubercolosi evitando così l'esigenza di un costoso impianto di BSL-3. Il metodo può essere esteso, con le opportune modifiche in media, a crescere biofilm di altre specie coltivabili micobatteri.
Nel complesso, un protocollo uniforme di biofilm coltura dei micobatteri aiuterà i ricercatori interessati a studiare le caratteristiche di base di micobatteri resistenti. Inoltre, un metodo chiaro e conciso di biofilm che crescono micobatteriche aiuterà anche i inv clinico e farmaceuticoestigators per testare l'efficacia di un potenziale farmaco.
Protocol
1. Biofilm crescente di M. tubercolosi in una bottiglia con tappo a vite 250mL
- Preparazione Media: sciogliere 0,5 g di KH 2 PO 4, 0,5 g di MgSO 4, 4 g di L-asparagina, 2 g di acido citrico, 0,05 g di citrato ferrico di ammonio, 60 ml di glicerolo in 900 ml di acqua. Regolare il pH a 7,0 con NaOH. Autoclave, fresco e appena prima di iniziare l'esperimento, ZnSO 4 aggiungere sterile ad una concentrazione finale di 0,1% w / v Dal 7000 mc 2 è un auxotroph pantotenato questo sforzo richiede anche l'acido pantotenico al 10μg/mL di concentrazione finale.
Nota: Questa è una composizione standard dei supporti utilizzati per la Sauton di M. tuberculosis. Tuttavia, se richiesto altri media specializzati possono essere utilizzati anche per altre specie micobatteriche.
- Inoculums preparazione: Grow M. tubercolosi in 7H9OADC con 0,05% Tween-80 per una settimana, o OD 600 di 0,7 1,0. Il culture può essere direttamente utilizzata come inoculo in una diluizione 1:100.
- Distribuire 25mL di media Sauton ad un Flacone da 250 ml con tappo a vite di polistirene (Corning). Aggiungere 250μl di inoculo al mezzo, tappo della bottiglia molto strettamente e collocarlo in un indisturbato umidificata a 37 ° C incubatore per 3 settimane. Osservare la bottiglia una volta al giorno per assicurarsi che non vi è alcuna contaminazione.
- Alla fine della terza settimana, svitare il tappo della bottiglia per consentire l'ulteriore crescita di M. tubercolosi all'interfaccia. Se il tappo non è allentato in questa fase quindi la concentrazione di ossigeno insufficiente nel contenitore ritardare l'ulteriore crescita di batteri.
2. La crescita di M. biofilm tubercolosi a 12 pozzetti
- Preparare la media e inoculo di mc 2 7000, come descritto nelle sezioni A1 e A2.
- Mescolare 60ml di media con 600μl di inoculo. Dispensare 4,5 mL della miscela in ciascun pozzetto della piastra. Coprire la piastra con il coperchio. Avvolgere la piastra più volte con parafilm. Incubare la piastra indisturbato in incubatore umidificato a 37 ° C per 5 settimane.
3. Determinare la frequenza di persistenti droga tolleranti in M. la tubercolosi biofilm
- Grow M. biofilm tubercolosi nell'arco di 12 pozzetti, come descritto nella sezione B. Questo richiederà un totale di circa 5 settimane.
- Una volta che i biofilm sono maturati (dopo 5 settimane di incubazione) iniettare la vostra scelta di antibiotici a concentrazione desiderata nei media sotto i biofilm utilizzando una micropunta in una pipetta.
Nota: Il volume dei supporti sotto le pellicole riduce a circa 3.0mL. Così gli investigatori dovrebbero di conseguenza calcolare la quantità di farmaco.
- Agitare delicatamente la piastra in modo che l'antibiotico viene accuratamente diffuso nel mezzo. Per ottenere risultati statisticamente significativi, iniettare il antibioticiotic in quattro pozzi. Parallelamente, iniettare lo stesso volume di solvente in cui l'antibiotico è stato sciolto in altre quattro pozzetti, e lasciare gli ultimi quattro pozzetti della piastra intatto. Coprire la piastra con il coperchio e mettere nuovi strati di parafilm intorno alla piastra. Mettere di nuovo in incubatrice per un periodo di tempo desiderato.
- Al termine dell'incubazione, aprire la piastra e aggiungere Tween-80 alla concentrazione finale dello 0,1% (volume / volume) in ciascuno dei pozzetti. Agitare gentilmente l'intera piastra di dispersione uniforme del detersivo. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 15 minuti. Mescolare il contenuto di ciascun pozzetto con pipette volte in modo che l'intero contenuto può essere uniformemente trasferiti in un tubo conico 15mL.
- Rallenta il contenuto del tubo a 4000rpm per 10 minuti a temperatura ambiente. Risospendere il pellet in 5 ml di tampone di lavaggio fresca (PBS con 10% di glicerolo e 0,05% Tween-80). Ripetere il lavaggio tre volte. Risospendere il pellet in 5 ml di tampone di lavaggio. Keep it sul bilanciere per overnight a 4 ° C.
Nota: Anche se a bassa temperatura è stato originariamente sviluppato per M. smegmatis (per ridurre al minimo la sua crescita durante la dispersione) e utilizzati per M. tuberculosis pure, le specie a lenta crescita può molto probabilmente essere cullato a temperatura ambiente senza alcun impatto sul risultato. Dondolo a temperatura ambiente può essere necessario se si lavora in BSL-3 struttura.
- Preparare una siringa sterile dotato di micropunta (2-200 pl), tagliando la sua estremità ampia per la dimensione appropriata, adattandosi alla siringa e avvolgendolo con parafilm. Passare tutto il contenuto del tubo attraverso la punta attrezzata siringa e raccogliere in un tubo fresco 15ml. Ripetere questo passaggio da 5 a 6 volte fino ad osservare una sospensione abbastanza omogenea.
- Preparare diluizioni seriali della sospensione e le diluizioni piastra sulla piastra 7H11OADC per determinare il numero di colonie vitali in ciascun pozzetto. Incubare le piastre per tre settimane a 37 ° C incubatore. Determinare la frequenficienza di persistenti nella popolazione biofilm calcolando il rapporto tra numero di colonie ottenute nel trattamento antibiotico a quelli ottenuti solvente lastre trattate.
4. Risultati rappresentativi
Quando coltivate in una bottiglia, crescita di M. tuberculosis può essere visto alla base della bottiglia dalla fine della prima settimana. Alla fine della seconda settimana, la crescita di batteri chiazze sulla interfaccia aria-media può essere visto, anche se la crescita all'interfaccia aria-media interfaccia è sempre visibile alla fine della terza settimana (Fig. 1A). In questo momento l'attacco dei batteri alla parete del contenitore è anche osservato. Da questo punto in poi la crescita della coltura avviene principalmente sulla interfaccia aria-media. Il liquido sotto la superficie di crescita è chiara. Tipicamente, la struttura matura dalla fine della quinta settimana (Fig. 1B). Se incubazione è prolungata, le strutture inizierà a depositarsi sul fondo del contenitore. Curiosamente,serraggio del tappo fino alla fine della terza settimana è un passo importante nel processo, e per ragioni sconosciute un loose-flacone con tappo ritarda notevolmente l'inizio della crescita sull'interfaccia 9.
Nella 12-pozzetti, uno biofilm robusta all'interfaccia aria-media interfaccia è visto in ciascuno dei pozzetti alla fine di cinque settimane (Fig. 2A). Se le piastre non sono avvolte completamente quindi crescita biofilm differenziale viene osservata. Nel caso peggiore, significativa evaporazione media possono ritardare la crescita dei batteri (Fig. 2B). Così, avvolgimento della piastra è necessaria sia per evitare l'evaporazione e per fornire un ambiente per la formazione di biofilm (vedi paragrafo precedente).
Il numero di bacilli vitali in biofilm determinati con questa tecnica è molto riproducibile. Risposta di M. tubercolosi biofilm varia con la natura degli antibiotici. Per un antibiotico battericida, come la rifampicina, perdita di vitalità segue un bipha sic trend 9. Una rapida riduzione della redditività durante i primi tre o quattro giorni seguita da una fase persistente in cui una piccola percentuale della popolazione restano completamente recalcitrante agli antibiotici indipendentemente dalla concentrazione di antibiotico o il tempo di esposizione. La Figura 3 mostra il numero di bacilli vitali in biofilm maturi dopo 7 giorni di esposizione a 50μg/mL (50 volte superiore alla MIC) di rifampicina.
Figura 1A. Comparsa precoce di M. bacilli tubercolosi sulla interfaccia aria-media di batteri dopo 3 settimane di incubazione.
Figura 1B. Stagionato biofilm di M. tubercolosi in onda-Media Interface dopo cinque settimane di incubazione.
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Figura 2A. 5 settimane biofilm vecchi M. tubercolosi cresciuta in 12-pozzetti.
Figura 2B. Un tentativo fallito di crescere biofilm M. tuberculosis in 12 pozzetti senza parafilm.
Figura 3. Un grafico rappresentante che mostra la frequenza di persistenti droga tolleranti in M. tubercolosi biofilm cresciuto in 12 pozzetti ed esposte a 50μg/mL di rifampicina per sette giorni.
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Discussion
La tubercolosi (TB), causata da l'infezione di Mycobacterium tuberculosis, rimane una grave minaccia per la salute pubblica globale. Quasi un terzo della popolazione mondiale è stimata essere asintomatica infettati dal patogeno, circa 9 milioni di nuovi casi appaiono in clinica ogni anno con sintomi di TB attiva e circa 1,7 milioni muoiono di infezione ogni anno 11. L'enorme peso della malattia è principalmente contribuito la mancanza di un vaccino e di una chemioterapia altamente complessa che comporta un trattamento con multiterapia somministrate nell'arco di sei-nove mesi. La chemioterapia prolungata è in gran parte attribuita alla tolleranza fenotipica di una piccola sottopopolazione del patogeno che ha richiesto l'esposizione prolungata di antibiotici 12. Mentre gli obiettivi di tali persistenti è fondamentale per il trattamento breve ed efficace della tubercolosi, i meccanismi alla base dello sviluppo di queste persistenti rimangono poco chiari.
La maggior parte microbica species nel loro habitat naturale crescono spontaneamente in auto-assemblato, superficie comunità allegati pluricellulari chiamati biofilm, che sono molto tolleranti agli antibiotici 3. Recentemente, è stato dimostrato che numerose specie micobatteriche, hanno forte propensione a crescere in vitro come biofilm, che forniscono un microambiente che promuovono lo sviluppo di persistenti farmaci tolleranti 9,13-15. Mentre in forte crescita specie ambientali, quali M. smegmatis può facilmente formare biofilm in detergenti privi di mezzi, la crescita lenta specie patogene M. la tubercolosi richiedono condizioni specifiche per formare le strutture multicellulari 9. Dal momento che la coltura M. tubercolosi in biofilm potrebbe fornire la comprensione in maniera significativa nei meccanismi di tolleranza al farmaco e la persistenza, la diffusione di un protocollo dettagliato per la coltura del patogeno nel biofilm attraverso un open source sarà prezioso per la ricerca sulla tubercolosi, in particolare in una risorsa limitata country.
Qui si descrive il metodo di coltivazione M. tubercolosi in biofilm in dettaglio. Forniamo anche un protocollo per rompere i biofilm e determinare il numero di bacilli vitali della popolazione. Questa tecnica può essere utilizzata per determinare il numero di persistenti droga tolleranti nella cultura. I tre passaggi più critici nel biofilm coltura sono: 1) la scelta di un appropriato detergente privi di mezzi, chiuso contenitore di coltura durante le prime tre settimane, ed aprire il recipiente per la successiva incubazione. Inoltre, mantenendo il contenitore in una condizione umidificata è anche fondamentale per evitare l'evaporazione dei supporti durante 5-settimane di incubazione. Questo può ostacolare in modo significativo la riproducibilità dei risultati.
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Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Il lavoro è stato realizzato con il sostegno finanziario del National Institute of Health e la American Lung Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Incubator | VWR international | Model # 1923/25 | |
| Polystyrene culture bottles | Fisher Scientific | 03-374-300 | |
| 12-well tissue culture plate | VWR international | 62406-165 | |
| 50-mL conical tubes | VWR international | 89039-660 | |
| Rocker | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 57019-662 | |
| Chromatographic refrigerator | VWR international | 55702-520 | |
| petri dish | VWR international | 25384-342 | |
| KH2PO4 (monobasic) | EMD Millipore | PX1565-1 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M65-500 | |
| L-asparagine | Sigma-Aldrich | A4284-100G | |
| citric acid | Sigma-Aldrich | C1857-100G | |
| ferric ammonium citrate | Sigma-Aldrich | F5879-100G | |
| glycerol | EMD Millipore | GX0185-5 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045-500G | |
| ZnSO4 | Sigma-Aldrich | Z4750-500G | |
| D-pantothenic acid | Sigma-Aldrich | P2250-25G | |
| Difco Middlebrook 7H9 Broth | BD Biosciences | 271310 | |
| Middlebrook OADC Enrichment | BBL | 212351 | |
| Tween-80 | Fisher Scientific | T164-500 | |
| 250mL storage bottle | Corning | 430281 | |
| 12 well plates | Falcon BD | 353043 | |
| rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501-1G | |
| methanol | JT Baker | 9070-05 | |
| 10mlLsyringe | BD Biosciences | 301604 | |
| 1-200μL pipet tips | VWR international | 89079-458 | |
| parafilm M | VWR international | PM-996 | |
| 15mL centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188-285 | |
| Difco Mycobacteria 7H11 Agar | BD Biosciences | 283810 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Na2HPO4 (dibasic) | Sigma-Aldrich | S0876-500G |
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