Summary
نحن هنا وصف استخدام ذاتي تجميع 3 الابعاد سقالة للثقافة الإنسان الخلايا العصبية السلف. نقدم بروتوكولا للافراج عن الخلايا من السقالات التي سيتم تحليلها في وقت لاحق من قبل مثل التدفق الخلوي. قد يكون هذا البروتوكول لتكييف أنواع الخلايا الأخرى لتنفيذ دراسات مفصلة ميكانيكيا.
Abstract
تأثير السقالات (3D) 3 الأبعاد على تمايز نمو وانتشار الخلايا العصبية وأخيرا هي ذات أهمية كبيرة من أجل العثور على طرق جديدة لعلاج الخلايا وموحدة تستند في اضطرابات عصبية أو أمراض الاعصاب. ومن المتوقع أن هياكل 3D لتوفير بيئة أقرب الى الوضع في الجسم الحي من الثقافات 2D. في سياق الطب التجديدي ، ومزيج من مادة بيولوجية مع السقالات والخلايا الجذعية العصبية السلف يحمل وعدا كبيرا كأداة علاجية. أثبتت أنظمة الثقافة 1-5 محاكاة بيئة ثلاثية الأبعاد للتأثير على انتشار والتفريق في أنواع مختلفة من الساق و السلف الخلايا. هنا ، في تشكيل وfunctionalisation من microenviroment - 3D المهم تحديد بقاء ومصير الخلايا المدمجة. 6-8 تستخدم نحن هنا PuraMatrix 9،10 (RADA16 ، م) ، وهو يستند الببتيد سقالة هيدروجيل ،الذي يوصف بشكل جيد وتستخدم لدراسة تأثير بيئة - 3D على أنواع مختلفة من الخلايا يمكن. 7،11-14 PuraMatrix تكون مخصصة بسهولة وتلفيق الاصطناعية من ألياف النانو يوفر نظام الثقافة 3D - الموثوقية العالية ، والتي بالإضافة xeno خالية.
مؤخرا درسنا تأثير تركيز - PM على تشكيل سقالة 13 في هذه الدراسة استخدام تركيزات رئيس مجلس الوزراء كان لها تأثير مباشر على تشكيل هيكل - 3D ، والذي تجلى من خلال مجهر القوة الذرية. وكشف تحليل لاحقة للبقاء على قيد الحياة والتمايز من hNPCs تأثير تركيزات من استخدام رئيس مجلس الوزراء حول مصير الخلايا المدمجة. ومع ذلك ، فإن تحليل بقاء أو تمايز الخلايا العصبية عن طريق تمتلك تقنيات المناعي بعض العقبات. للحصول على بيانات موثوق بها ، وعلى المرء أن تحديد العدد الإجمالي للخلايا داخل مصفوفة للحصول على العدد النسبي للمثل. الخلايا العصبية التي تميزت βIII - تويولين. هذا متطلبات تقنية لتحليل السقالات في جميع الأبعاد 3 - بواسطة المجهر مبائر أو تقنية مشابهة مثل المجاهر مضان قادرا على اتخاذ Z - أكوام من العينة. وعلاوة على هذا النوع من التحليل هو قتا طويلا جدا.
نحن هنا شرح طريقة للافراج عن الخلايا من السقالات 3D - لتحليلها لاحقا من قبل مثل التدفق الخلوي. في هذا البروتوكول ومثقف خلايا العصبية السلف (hNPCs) من الخلية ReNcell خط VM (ميليبور الولايات المتحدة) ومتمايزة في 3D - السقالات التي تتكون من PuraMatrix (بعد الظهر) ، أو تستكمل مع PuraMatrix laminin (PML). في أيدينا كانت PM - تركيز 0.25 ٪ المثلى لزراعة الخلايا 13 ، لكن يمكن تطويعها للتركيز على أنواع الخلايا الأخرى (12). ويمكن استخدام الخلايا الافراج عن immunocytochemical الدراسات على سبيل المثال وتحليلها في وقت لاحق من قبل التدفق الخلوي. يسرع هذا التحليل وموإعادة أكثر ، وبقية البيانات التي تم الحصول عليها بناء على قاعدة أوسع ، وتحسين موثوقية البيانات.
Protocol
1. الجزء 1 : ثقافة hNPCs في PuraMatrix
- مقدما للجيل من سقالة مع التركيز PuraMatrix من 0.25 ٪ دون laminin واحد يحتاج إلى إعداد الحلول التالية
- تحضير محلول يحتوي على 20 ٪ والسكروز محلول يحتوي على 10 ٪ سكروز المذاب في الماء المقطر العقيمة.
- لإيجاد حل 1 ميكرولتر 120 مزيج من محلول السكروز 20 ٪ مع 120 ميكرو لتر من الماء المقطر في أنبوب 1.5 مل المخروطية.
- حل ل2 ميكروليتر 60 مزيج من الحل PuraMatrix مع 60 ميكروليتر من محلول السكروز 20 ٪ في أنبوب 1.5 مل المخروطية.
لإعداد سقالة مع التركيز PuraMatrix من 0.25 ٪ تستكمل مع laminin (8 ميكروغرام لكل 100 مصفوفة ميكرولتر) واحد يحتاج إلى إعداد الحلول التالية.
- لإيجاد حل 1 ميكروليتر 72 مزيج من الماء المقطر مع 120 ميكروليتر من محلول السكروز 20 ٪ و 48 ميكرولتر laminin في أنبوب 1.5 مل المخروطية.
- 2 حل لمزيج حل PuraMatrix 60 ميكرولتر مع 60 ميكروليتر من محلول السكروز 20 ٪ في أنبوب 1.5 مل المخروطية.
- لالغرز من الخلايا في إعداد PuraMatrix ثقافة الخلية 4 - جيدا لوحة ووضع غطاء زجاجي معقم زلة (قطره 13 ملم) في اثنين من الآبار. متجر لوحة في مقاعد البدلاء النظيفة لاستخدامها لاحقا. تستخدم فقط ينزلق الغطاء الزجاجي للدراسات immunocytochemical. إذا لم يقصد stainings immunocytochemical ، يمكن تخطي هذه الخطوة.
لإعداد hNPCs لتغليف في أحد السقالات 3D ان تعد الحلول التالية. تمييع Benzonase في حل التربسين / EDTA ، وذلك باستخدام عامل التخفيف من 1:10.000. لمزيج حل Trypsin-Inhibitor/Benzonase : DMEM/F12 + Benzonase 25U/μl + + 1 ٪ HSA - التربسين المانع (0.5mg/ml).
- فصل الخلايا بإضافة 500 ميكروليتر التربسين / Benzonase الحل واحتضان لمدة 5 دقائق في حاضنة (37 درجة مئوية ثاني ، و 5 ٪ 2). وقف التفاعل مع حل Trypsin-Inhibitor/Benzonase. الطرد المركزي لاحقا إلى خلايا منفصلة لمدة 5 دقائق في 3000 س ز. غسل الخلايا مع 5 مل من محلول السكروز 10 ٪ والطرد المركزي مرة أخرى. تجاهل طاف.
- Resuspend الخلايا في محلول السكروز 10 ٪ ، وينبغي أن الحل النهائي خلية تحتوي 1x10 6 خلية / مل.
الخطوات التالية ، 1،8-1،11 ، ينبغي أن يتم في أسرع وقت ممكن ، وذلك بسبب انخفاض الرقم الهيدروجيني من الحل PuraMatrix ، والتي قد تكون ضارة للخلايا.
- مزيج 60 ميكرولتر من التعليق الخلية مع الحل 1.
- إضافة 120 ميكروليتر من محلول 1 ، الذي يحتوي على الخلايا ، لأنبوب مخروطي مع الحل (2) ومزيج دقيق.
- أقام المركز زلات 100 ميكروليتر من الخليط على الفور على كل لوحة في تغطية 4 - جيدا.
- إضافة ببطء 200 خلية ثقافة ميكرولتر المتوسطة لكل بئر ، وبعد 2-3 دقائق أخرى ميكرولتر 200. هذا سوف تشرع في التجميع الذاتي للمصفوفة.
- ج احتضانells عند 37 درجة مئوية ، ل1H في مقاعد البدلاء نظيفة على لوحة التسخين أو منطقة ساخنة من مقاعد البدلاء الخاصة بك نظيفة. بقدر الإمكان لا تتحرك لوحة لأن ذلك قد يضر تجميع المصفوفات.
- إزالة أكثر من المتوسط ولكن ليس كل شيء ، لتجنب الوقوع في مصفوفات الجافة ، مع ماصة 1000 ميكرولتر. إضافة 500 ميكرولتر من المتوسط لغسل مصفوفات لمدة 10 دقيقة. إزالة أخيرا المتوسطة والمتوسطة إضافة 500 ميكروليتر الطازجة ومكان لوحة الثقافة في حاضنة (37 درجة مئوية ثاني ، و 5 ٪ 2). كما مصفوفات حساسة للصدمة يجب أن يتم نقل اللوحات على أنها أقل وقت ممكن وتخزينها ، إذا أمكن ، في حاضنة منفصلة.
- وقد تكاثرت في hNPCs المستخدمة هنا لمدة 7 أيام في السقالات 3D وبدأ التمايز بالانسحاب من عوامل النمو 13. تم تغيير المتوسطة كل 2-3 أيام.
2. الجزء 2 : تلطيخ Immunocytochemical مصفوفات كامل
- مقدما لإجراء تلطيخ واحد يحتاج إلى إعداد : أ بتأمين حل العازلة التي تتكون من 5 ٪ مصل الماعز العادية و 0.3 ٪ من تريتون X 100 (المنحلة في برنامج تلفزيوني ، وهو حل بارافورمالدهيد 4 ٪ على أساس برنامج تلفزيوني M 0.1 و اذا دعت الحاجة الى حل مع 4 '،6 - Diamidin - 2' - phenylindoldihydrochlorid دابي) لتلطيخ النوى التي تحتوي على 100 نانوغرام دابي / مل الذائبة في برنامج تلفزيوني. وكانت المركبة عينات بمزيج من Mowiol وDABCO.
- لغسل مصفوفات إزالة المتوسطة مع ماصة 1000 ميكرولتر السقالات ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
- لإصلاح إزالة السقالات PBS وإضافة 400 ميكرولتر من بارافورمالدهيد (4 ٪ في برنامج تلفزيوني M 0.1) إلى كل بئر واحتضان المصفوفات لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ويمكن تخزين السقالات الثابتة في برنامج تلفزيوني تستكمل مع 0.02 ٪ في نان 3 4 درجات مئوية لعدة أسابيع قد تصل إلى شهور عدة.
- مقدما لتلطيخ غسل السقالات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
- احتضان والسقالات في عرقلة الحل العازلة. تم تغيير عرقلة حل ثلاث مرات كل 2-3 ساعات وsubsequently حضنت السقالات في عرقلة حل بين ليلة في 4 درجات مئوية.
- إزالة الحل عازلة تمنع وإضافة الضد الأولية الذائبة في برنامج تلفزيوني تستكمل مع 1 ٪ مصل الماعز العادي واحتضان المصفوفات في أكثر من ليلة 4 درجات مئوية.
- إزالة الأجسام المضادة الأولية حل ويغسل السقالات 4 مرات لمدة 2 ساعة وبعد ذلك طوال الليل عند 4 درجة مئوية مع برنامج تلفزيوني.
- تستكمل إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة حل مع الأجسام المضادة الثانوية ، المذاب في برنامج تلفزيوني مع 1 ٪ مصل الماعز العادي ، لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
- غسل العينات مع PBS 4-6 مرات لمدة 1 ساعة وبعد ذلك في أكثر من ليلة 4 درجات مئوية في الظلام.
- لتلطيخ نواة يمكن للمرء أن إضافة 400 ميكروليتر من محلول دابي لمدة 30 دقيقة.
- لتحميل عينات يحتاج المرء شرائح المجهر. إضافة Mowiol 50 ميكروليتر / Dabco على شرائح المجهر. إزالة الغطاء عن زلات لوحة 4 - جيدا ووضعها بعناية على المدى المتوسط في تصاعد مستمر.
- تستخدم هنا لدينا 8000 Biozeroمجهر (Keyence ، ألمانيا ، كارلسروه) للحصول على واحد ومداخن micrographs ض. كل مكدس يحتوي على 30 صورة واحدة مع مسافة ميكرومتر 1-2. باستخدام برنامج محلل المقابلة تمت إزالة طمس الأصيل في مضان قبل الإسقاطات الكامل للأنتجت Z - المداخن.
3. الجزء 3 : الإفراج عن hNPCs من السقالات لتحليل التدفق الخلوي
- مقدما على الإفراج عن الخلايا من السقالات غسل السقالات مع 500 HBSS ميكرولتر.
- نقل السقالات عن طريق ماصة 1000 ميكرولتر لأنبوب مخروطية 15 مل تحتوي على خلية متوسطة الثقافة.
- لتعطيل السقالات resuspend ميكانيكيا الحل الخلية عدة مرات مع ماصة 1000 جهاز طرد مركزي في وقت لاحق ميكرولتر والحل في 3000 x ج لمدة 5 دقائق.
- إزالة طاف مع ماصة ، إضافة 500 ميكرولتر من التربسين / Benzonase الحل وresuspend الخلية مرات عدة بيليه.
- احتضان الخلايا لمدة 5 دقائقفي 37 درجة مئوية في حل التربسين / Benzonase. رد فعل لوقف إضافة 1 مل من محلول Trypsin-inhibitor/Benzonase ماصة وصعودا وهبوطا عدة مرات.
- الطرد المركزي تعليق خلية 5 دقائق في 3000 XG ، إزالة طاف وغسل الخلايا مع 2 مل HBSS العازلة. كرر هذه الخطوة مرتين. وهذا الإجراء إزالة الحطام المصفوفة.
- تمرير حل تعليق حوض خلية خلية مصفاة (حجم المسام 70 ميكرومتر) لإزالة الركام وجمع الخلايا في مستنبت الخلية. ويمكن الحصول على الخلايا المصنفة ثانية على سبيل المثال تغطية قسائم للدراسات الفنية والمشبك التصحيح أو القياسات fluometric. لمعالجة الخلايا للالتدفق الخلوي ، وتحديد الخلايا مباشرة (انظر 4.1).
4. الجزء 4 : التحديد الكمي لβIII - تويولين الخلايا إيجابية التدفق الخلوي
- تحديد الخلايا التي تم الحصول عليها في الخطوة سراح 3.7 مع PFA 1 ٪ لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- الطرد المركزي تعليق خلية لمدة 5 دقائق في XG 3000 و removه وطاف. إذا لزم الأمر ، يمكن إعداد الخلايا ليتم تخزينها في 4 درجات مئوية لتحليلها في وقت لاحق. ولذلك الخلايا resuspend العازلة في غسل (PBS تستكمل مع جيش صرب البوسنة 0.5 ٪ و 0.02 ٪ نا أزيد).
- المضي قدما في التحضير للالتدفق الخلوي ، الطرد المركزي تعليق خلية لمدة 10 دقيقة في 350 XG ، وتجاهل طاف resuspend الخلايا في 25 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة. ولذلك يتم خلط الأضداد الأولى مع سابونين العازلة عند تركيز 1:100 مثلا βIII - تويولين. المخزن المؤقت يتكون من سابونين PBS مع التركيز سابونين من 0.5 ٪ ، وتركيز 0.5 ٪ من جيش صرب البوسنة وتركيز نا أزيد من 0.02 ٪.
- احتضان تعليق الخلية مع الضد الأولى ل2 ساعة في درجة حرارة الغرفة على شاكر. كعنصر تحكم السلبية تحضير عينة من دون الضد الأول.
- للخطوة الغسيل first إضافة 300 العازلة سابونين ميكرولتر مباشرة إلى الخلايا. الطرد المركزي تعليق خلية لمدة 5 دقائق في غرام × 350 للخطوة الغسيل الثاني ، تجاهلوطاف ، إضافة 300 ميكروليتر والعازلة للطرد المركزي في تعليق خلية لمدة 5 دقائق في غرام × 350
- إزالة طاف واضافة 25 ميكرولتر الحل الذي يحتوي على الأجسام المضادة الثانوية (مثل اليكسا فلور 647 ، 1:1000 ، الذائب في سابونين العازلة). احتضان الخلايا التي تحتوي على الأجسام المضادة الثانوية 1H في درجة حرارة الغرفة ، في الظلام.
- للخطوة الغسيل first إضافة 300 العازلة سابونين ميكرولتر مباشرة إلى الخلايا. الطرد المركزي تعليق خلية لمدة 5 دقائق في غرام × 350 للخطوة الغسيل الثاني ، تجاهل طاف ، إضافة 300 ميكروليتر والعازلة للطرد المركزي في تعليق خلية لمدة 5 دقائق في غرام × 350
- تجاهل وطاف resuspend الخلايا في 500 العازلة غسل ميكرولتر لتدفق تحليل الخلوي.
5. ممثل النتائج
ويظهر مثال hNPCs مثقف في PuraMatrix هيدروجيل سقالة الذاتي تجميع في الشكل 1. وhNPCs تنمو في مثل الهياكل في spheric PM معدلة. في هذه الحالة ثقافةبالكاد يمكن ليالي ، وخلايا غير معترف بها في ضوء انتقال ، على الرغم من حزم من العمليات بين المجالين مرئية (الشكل 1A). تبعا للظروف ثقافة نوع من الخلايا المستخدمة ، يمكن تعديل المصفوفة على سبيل المثال عن طريق إضافة laminin. للخط الخلوي hNPC ReNcell VM (ميليبور) laminin ضروري للحث على نمط النمو مع المجاميع أقل كثافة ولكن توزيع أكثر تجانسا من الخلايا (الشكل 1B). مستقلة من التعديلات ، ويمكن استخدام مصفوفة لدراسة تمايز الخلايا العصبية على سبيل المثال. 1C الرقم يمثل تلطيخ من hNPCs للعلامة العصبية βIII - تويولين. في هذا المثال كانت تزرع الخلايا لمدة 7 أيام في المصفوفة ومتمايزة في وقت لاحق لمدة 4 أيام ، حيث كان بفعل التمايز بالانسحاب من عوامل النمو وEGF bFGF. الهيئات الخليوي (13) وشبكة كثيفة من العمليات المبنية من الخلايا يمكن أن تكون يمكن التعرف عليه بسهولة. ومع ذلك ، فمن الواضح أن القياس الكمي لعدد الخلايا هو مضيعة للوقت ، وعدد كبير منصور من مناطق مختلفة من مصفوفة لابد من تحليلها ، للحصول على قاعدة بيانات موثوقة عن التحليل الإحصائي. في الشكل 1D يمكن للمرء أن نرى مثالا على الخلايا أفرج عنه من مصفوفة وplatted في وقت لاحق عن زلات الغطاء. يمكن استخدام هذه الخلايا للدراسات الفنية.
الافراج عن الخلايا من السقالات 3D - توفر إمكانية تحليل معلمات مختلفة مثل التعبير عن البروتينات علامة أو معدل البقاء على قيد الحياة من خلايا بواسطة AnnexinV / PI تلطيخ أو مقايسة النفق. ويبين الشكل 2 مثالا على تحليل تدفق الخلوي النسبة المئوية للخلايا + βIII - تويولين. ويظهر سيطرة السلبية (الخلايا لم يتم وضع علامة لβIII - تويولين) في الشكل 2A. وتستخدم هذه الضوابط لتحديد بوابة للكشف في وقت لاحق من الخلايا + βIII - تويولين (الشكل 2B). ويظهر من مقارنة العد اليدوي لخلايا وتحليلا من قبل التدفق الخلوي في 2C الرقم. كانت النسبة المئوية للخلايا + βIII - تويولين determINED عن طريق حساب عدد الخلايا الإجمالي (عن طريق تلطيخ دابي النووية) وعدد من الخلايا ، βIII تويولين + في الصور مضان.
الشكل 1. hNPCs مثقف في PuraMatrix الببتيد هيدروجيل الذاتي تجميع ألف hNPCs) مغلفة في PuraMatrix (بعد الظهر) تنمو في الهياكل spheric كثيفة ، ومعبأة ، حيث القطر من المجالات يمكن أن تصل إلى عدة مئات من ميكرون. في ما بين المجالين يمكن للمرء أن يتعرف حزم من العمليات المبنية من قبل خلايا (الأسهم). B) في خلايا مغلفة PuraMatrix تستكمل مع laminin (PML) تنمو في هياكل أقل كثافة ، وأكثر متجانس الموزعة. في laminin استكمال مصفوفة يمكن للمرء أن يتعرف الخلايا واحد في مناطق أقل كثافة (الأسهم) ، ومع ذلك فمن الممكن بالكاد لتقدير عدد الخلايا. C) hNPCs متباينة لمدة 4 أيام في التعبير عن علامة PML العصبية مثل βIII - تويولين (الخضراء). لevaluaالشركة المصرية للاتصالات نسبة الخلايا إيجابية على المرء أن تحديد العدد الكلي من قبل خلية تلوين النوى مثل دابي (الأزرق). وmicrophotograph يعرض الإسقاط الكامل لZ - كومة من الصور التي التقطت مع Biozero - 8000 المجهر. يمكن D) يتم إصدارها من الخلايا المصنفة المصفوفة على سبيل المثال تغطية قسائم للدراسات وظيفية أخرى. وتظهر الخلايا المستزرعة microphotograph ل3D ، في وقت لاحق لإجراء الإفراج عنه. وتلطيخ لβIII - تويولين (الأحمر) يكشف عن التشكل مماثلة لخلايا استضافتها في سقالة 3D.
الشكل 2. تحليل التدفق الخلوي الخلايا أفرج عنه من PuraMatrix. وللتغلب على القياس الكمي وقتا طويلا من microphotographs كنا بروتوكولا للافراج عن الخلايا المستزرعة في PuraMatrix السماح لأسرع تحليل التدفق الخلوي. تم استخدام الخلايا) غير ملوثين والسيطرة السلبية ، لتعيين البوابة (الإطار الأسود) للتحليل في وقت لاحقالخلايا βIII - تويولين على سبيل المثال. ب) لتحديد النسبة المئوية للβIII - تويولين + الخلايا كانت تستخدم نفس البوابة ، في مجموعة مراقبة سلبية. خلايا إيجابية تظهر في الجزء الأيمن من المحور س ، حيث لوحظ أيضا لسكان المتوسط (الإطار المنقط) ، وعلى الأرجح الحطام الخلية يمثلون. C) وكشفت المقارنة بين الخلايا فرز اليدوي والخلايا التي عدها التدفق الخلوي نسبة أعلى بكثير من الخلايا إيجابية ، حيث الاعتماد على الوقت لعدد βIII - تويولين + وقابلة للمقارنة ، مما يدل على موثوقية تدفق بروتوكول الخلوي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
استخدام 3D - السقالات يتيح الفرصة لدراسة تطوير أنواع مختلفة من الخلايا في خلية ثقافة الوضع أقرب إلى الوضع في الجسم الحي. ومع ذلك ، بخصوص تحليل تمايز الخلايا العصبية مثلا أو الدراسات الفنية للمرء أن التغلب على بعض العقبات التي تحول دون الحصول على بيانات موثوق بها لتقدير مثل أنواع الخلايا.
نحن هنا وصف ثقافة hNPCs في هيدروجيل الببتيد تستند سقالة PuraMatrix والافراج في وقت لاحق من الخلايا لاستخدامها في الدراسات في وضع 2D توفير سهولة الوصول إلى الأدوات وFACS أو المقايسات الفنية. في الآونة الأخيرة أظهرت لنا تأثير تركيز PuraMatrix على تشكيل 3D - سقالة بواسطة مجهر القوة الذرية والتأثير على بقاء وتمايز الخلايا. 13 ومع ذلك ، على المرء أن نضع في اعتبارنا أن كل نوع من الخلايا قد تحتاج ثقافة مختلفة شروط أو مصفوفات تتكون من مواد أخرى مثل matrigش أو الكولاجين.
يستند هذا البروتوكول للافراج عن الخلايا على بروتوكول المقدمة من قبل الشركة المصنعة 18 ويمكن مقارنتها مع البروتوكولات المستخدمة لإعداد مثل الثقافات العصبية الأولية حيث يتبع عزلة الميكانيكية للخلايا قبل هضم المواد المحيطة من الانزيمات. الخلايا تتسامح مع هذا الإجراء والبقاء الحيوية وتراكمت العمليات وأعرب عن علامة العصبية مثل βIII - تويولين ، مرة واحدة هي انهم المصنفة ثانية على السطح المطلي laminin. نحن هنا إجراء دراسات التدفق الخلوي مع خلايا سراح لقياس كمية من الخلايا + βIII - تويولين. وكشفت المقارنة لتقدير عمله "يدويا" من قبل عد الخلايا في micrographs نسبة أعلى بكثير من الخلايا + βIII - تويولين. هذا هو على الأرجح نتيجة لارتفاع عدد الخلايا التي عدها تدفق عداد الكريات (50،000 في التحقيق) في مقارنة لتحليل الخط (عدة مئات في التحقيق). ومع ذلك ، فإن حركية عدد & Bايتا ؛ III - تويولين + الخلايا يتبع نفس النمط في كل من العينات ، حيث يمكننا الكشف عن انخفاض عدد كريات + βIII - تويولين مع مرور الوقت. هذا هو وفقا للدراسات باستخدام الخلايا VM ReNcell 15-17 أخرى للتغلب على العقبات خلال تحليل مختصر مناطق كثيفة جدا من المصفوفات التي يصعب تحليلها أو خلفية عالية من المواد المصفوفة مما أدى إلى التقليل من "الحقيقي" الخلية رقم. نحن مقتنعون بأنه يمكن تكييفها لهذا البروتوكول أنواع الخلايا الأخرى التي توفر طريقة سريعة وموثوق بها لقياس جوانب عديدة من التمايز ، أو البقاء على قيد الحياة من انتشار الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر نورمان كروجر لدعمه فنية ممتازة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PuraMatrix peptide hydrogel | BD Biosciences | 354250 | |
| Mouse laminin I | Cultrex | 400-2009090 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378-1KG | |
| Normal goat serum | Dako | X0907 | |
| Triton X 100 | Carl Roth Gmbh | 3051.3 | |
| PBS Dulbecco | Biochrom AG | L 1825 | |
| HBSS | GIBCO, by Life Technologies | 14170-088 | Hanks’ Balanced Salt Solution 1X |
| βIII-tubulin antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | Sc-51670 | Mouse, monoclonal, 1:500 |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A 11029 | Goat α mouse, 1:1000 |
| Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A 11031 | Goat α mouse, 1:1000 |
| Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A 21235 | Goat α mouse, 1:1000 |
| Mowiol 4-88 Reagent | Calbiochem | 475904 | |
| Dabco | Aldrich | D2,780-2 | 1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane 98% |
| Cell strainer | BD Biosciences | 352350 | 70 μm pore size |
| Saponin | Merck & Co., Inc. | 7695 | |
| Trypsin/ EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300-054 | |
| Benzonase 250 U/μl | Merck & Co., Inc. | 1.01654.0001 | |
| Trypsin Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 (500 mg) | |
| 20% HSA | Octapharma | Human-Albumin Kabi 20% |
References
- Zhang, S., Gelain, F., Zhao, X. Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for 3D tissue cell cultures. Semin. Cancer. Biol. 15, 413-420 (2005).
- Gelain, F., Horii, A., Zhang, S. Designer self-assembling peptide scaffolds for 3-d tissue cell cultures and regenerative medicine. Macromol. Biosci. 7, 544-551 (2007).
- Blow, N. Cell Culture: building a better matrix. Nature. Methods. 6 (8), 619-622 (2009).
- Hauser, C. A., Zhang, S. Designer self-assembling peptide nanofiber biological materials. Chem. Soc. Rev. 39, 2780-2790 (2010).
- Teng, Y. D. Functional recovery following traumatic spinal cord injury mediated by a unique polymer scaffold seeded with neural stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 3024-3029 (2002).
- Silva, G. A. Selective differentiation of neural progenitor cells by high-epitope density nanofibers. Science. 303, 1352-1355 (2004).
- Gelain, F., Bottai, D., Vescovi, A., Zhang, S. Designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds for adult mouse neural stem cell 3-dimensional cultures. PLoS. ONE. 1, e119-e119 (2006).
- Taraballi, F. Glycine-spacers influence functional motifs exposure and self-assembling propensity of functionalized substrates tailored for neural stem cell cultures. Front Neuroengineering. 3, 1-1 (2010).
- Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 3334-3338 (1993).
- Zhang, S. Self-complementary oligopeptide matrices support mammalian cell attachment. Biomaterials. 16, 1385-1393 (1995).
- Horii, A., Wang, X., Gelain, F., Zhang, S. Biological designer self-assembling peptide nanofiber scaffolds significantly enhance osteoblast proliferation, differentiation and 3-D migration. PLoS. ONE. 2, e190-e190 (2007).
- Thonhoff, J. R., Lou, D. I., Jordan, P. M., Zhao, X., Wu, P. Compatibility of human fetal neural stem cells with hydrogel biomaterials in vitro. Brain. Res. 1187, 42-51 (2008).
- Ortinau, S. Effect of 3D-scaffold formation on differentiation and survival in human neural progenitor cells. Biomed. Eng. Online. 9, 70-70 (2010).
- Abu-Yousif, A. O., Rizvi, I., Evans, C. L., Celli, J. P., Hasan, T.
- Morgan, P. J. Protection of neurons derived from human neural progenitor cells by veratridine. Neuroreport. 20, 1225-1229 (2009).
- Giese, A. K. Erythropoietin and the effect of oxygen during proliferation and differentiation of human neural progenitor cells. BMC. Cell Biol. 11, 94-94 (2010).
- Schmöle, A. C. Novel indolylmaleimide acts as GSK-3beta inhibitor in human neural progenitor cells. Bioorg. Med. Chem. 18, 6785-6795 (2010).
- PuraMatrix, B. D. Peptide Hydrogel. Guidelines for Use. Catalog No 354250, BD. (2006).
