Summary
整个小鼠脏器的多光子显微镜能够通过光学成像之前清零器官，但并非所有协议保留的荧光蛋白的荧光信号。使用光学乙醇脱水和苯甲醇苯甲酸苄酯结算的结算方法，显示高分辨率的多光子图像的整个小鼠脑组织表达YFP。
Abstract
多光子显微镜是通过光学成像之前清除器官的固有荧光和二次谐波产生（SHG）的整个鼠标机关。1,2然而，对于器官，包含荧光蛋白，如GFP和YFP，光使用甲醇的结算协议脱水和用苄醇苯甲酸苄酯（巴布），而未受保护的光3不保留的荧光信号。这里介绍的是一种新的方式，同时保留YFP的荧光信号在神经元中表达，在其中执行整个器官对小鼠脑组织的光透明的协议。改变光透明的协议，例如使用的乙醇梯度系列已经发现，减少损伤的荧光蛋白，并保持其多光子成像的荧光信号，器官是脱水。4使用一个优化的方法，光透明的基于乙醇的脱水和清除由巴布从光屏蔽时，我们显示高分辨率的多光子图像，黄色荧光蛋白（YFP）表达在神经元的小鼠脑组织表面下方超过2毫米。
Protocol
1。动物灌注5和整个小鼠脑结算
- 的整个长度上的程序可以根据每脱水工序中使用的时间长度而变化，但总的整个过程可以在两天内进行。
- 称重YFP的小鼠和然后深深麻醉腹膜内注射氯胺酮/赛拉嗪（100毫克/公斤10毫克/公斤）。
- 确认的手术平面的深度麻醉，然后再进行手术。检查动物，每隔5分钟，看看它的反应到公司或脚趾尾捏。如果动物的反应，氯胺酮/赛拉嗪的补充剂量（原剂量的1/3）是必需的。
- 一旦深度麻醉，抑制小鼠通过坚持每个肢体实验室磁带到手术床上使用，让鼠标是在仰卧位（背recumbancy），露出胸部手术。一张的手术通常是由一个金属或塑料网和放入水槽或顶部的唇形盘，使血液和固定液废物可以很容易地被收集。
- 开始，一个低于剑突过程中的切口。剪切沿肋条笼形件的基础上用剪刀和镊子和回拉皮肤作为切割。削减沿鼠标胸骨两侧的（通过肋），创建一个皮瓣的组织，从胸腔内使用止血钳离开的心脏暴露。
- 进入左心室的心脏插入了23 G针和一个小切口，右心房肌壁，使血液逃脱。请参阅朱庇特第2497此过程的视频。
- 立即被切断后，右心房，开始灌注4℃的磷酸缓冲生理盐水，PBS（pH7.2）中，直到不再观察到血液的心脏的右心房（30 - 40毫升的速率约5从排水毫升/分钟）。
- 一旦所有的血液被抽干（液体排出右心房是明确的），灌注介质切换到冷冻4％PFA解决方案。灌注，直到鼠标的身体变得明显的刚性和寒冷的触摸（约30 - 40毫升的速度约5毫升/分钟）。 （稀释16％集中PFA解决方案根据制造商的说明书中加入NaOH直至pH值达到7.2。戴上手套，实验室外套和处理，在通风橱内的化学品混合）。
- 灌注后，移开鼠标，从开始的大脑切除的手术床上，斩首。
- 使用镊子和虹膜剪，除去头骨，小部分从后面的头骨和前进的。小切口，用剪刀在整个头骨的2 - 4毫米，而使用镊子小心地将骨远离大脑中的小部分。做到这一点，直到整个顶表面被暴露的大脑。
- 海关的大脑，头骨，5毫米宽，平锅铲和一个玻璃小瓶。淹没在4％PFA 6小时，在4℃下进行后固定。
- 经过后期固定术，两次在室温PBS洗大脑通过浇注的煤灰，满分的玻璃小瓶中，并用PBS代替。涡流的大脑浇筑前的第二次洗涤和更换PBS PBS溶液。
- 脱水的大脑进行梯度系列的乙醇孵育（一次在50％，70％，95％，和两次在100％）在2小时，每培养，然后为第二个的100％乙醇孵育12小时，在室温下通过提取的水，从固定的组织。每个孵化，以前的乙醇溶液倒入玻璃小瓶，直到大脑完全被水淹没，取而代之的是在随后的解决方案。
- 在100％乙醇中的第二次温育后，倾出溶液，并更换与等份的乙醇和结算含有苄醇，苯甲酸苄酯（1:2体积：体积比）的溶液。经过2小时的潜伏期，滗析这个解决方案中，和取代苄醇，苯甲酸苄酯（1:2体积：体积比）以100％的溶液。该refra的莫如指数的结算解决方案，为n = 1.54。
- 在巴布后，大脑会明显变得透明，在4 - 5小时。为了获得最佳的结算结果，离开大脑，以清除在室温下6天，同时屏蔽从明亮的光线。
2。显微镜设置
- 一旦大脑被清零，并准备用于成像，加盖的陪替氏培养皿的底部，使用氰基丙烯酸酯。使粘合剂干燥，然后再继续。
- 干燥后，淹没巴布大脑中，用于成像的显微镜物镜下放置在陪替氏培养皿。
- 我们使用了多光子显微镜，结合埋汰钛蓝宝石激光器710 nm至990 nm激发波长可调。我们用来生成YFP信号的激发波长为886纳米。激光功率范围从30 - 100毫瓦，根据成像深度。
- 捕捉反射的荧光信号使用的是尼康5X物镜（NA 0.5），允许大字段的视图成像（2×2毫米）。
- 过滤器反射的荧光信号使用一个五十〇分之五百三十五带通滤波器和收集它使用砷化镓PMT（H7422PA-40，滨松，布里奇沃特，新泽西州）。
- 处理图像在ScanImage软件6，分辨率为2048×2048像素，扫描速度为2毫秒，每行生成高分辨率，YFP图像。
- 一次成像完成后，消除大脑从培养皿中，使用产钳和存储在巴布避光未来的成像。对于胶样品，通过运行一个刀片的角度不大于30度之间的胶水和陪替氏培养皿中除去组织。我们已保存的样品在巴布长达1年没有明显的退化。
3。代表性的成果
此处所示的代表图像和视频显示的高分辨率的多光子成像能力成为可能的光透明。全脑成像允许YFP标记在不同的层，海马和皮层神经细胞清晰可见深组织表面的2毫米以下。 图1显示了一个代表图像的冠状相应的解剖学特征的海马2.92毫米尾鳍前囟门7。样品中的成像的深度为1.94毫米。这种差异是由于在尾端的大脑切除小脑的平衡，是由于脱水过程中收缩。从堆栈中的另一图像显示层V / VI下方的组织表面（ 图2）的新皮层表达YFP2毫米的锥体神经元。所有的图像被收购使用的尼康5X目标和放大倍率，使用数码变焦功能，图像采集ScanImage软件。
通过放大在新皮层中，明确个人在新皮层V层锥体神经元的轴突和神经元胞体光年区分至1.02毫米的组织表面的下方（ 图3）。从图3中使用的图像堆栈，神经元的区域的3D重建使用ImageJ软件8（ 图4）。
高分辨率的能力，也让我们的MPM图像的整体，单个神经元。在这里，我们展示的是重建的V层锥体神经元的大脑新皮质中，个体的树突清晰可见（ 图5）。
图1示出新皮质和海马的不同层的整个小鼠脑的代表图像从一个1.2毫米的图像堆栈（0.8 -下方组织表面2毫米）。特点是可见的海马组织表面的1.1毫米以下，并已使用如下标记ING代码：DG =齿状回，GrDG =颗粒层DG，Lmol的腔隙moleculare层，MOL =分子层DG，或= oriens的层，PoDG多形层DG，PY =锥体细胞层，抗辐射层radiatum。图片是1.8×1.8毫米大小，比例尺= 200微米。的脑吻侧端被固定到与尾端朝上朝向目标陪替氏培养皿。这有助于在冠状面成像。
图2。代表整个小鼠脑组织突出新皮层1.2毫米的图像堆栈帧（0.8 - 2毫米的组织表面下）。锥体细胞和表达YFP V / VI的皮质层是可见的组织表面的2毫米以下。程度与以前的报告在新皮层稀疏的标签，标签上是一致的。9插图（右）从B扩大上左边的oxed地区。图片的尺寸为1.8×1.8毫米，比例尺= 200微米（50微米插图）。
图3。代表帧V层锥体神经元的大脑新皮质中从图像堆栈下方的组织表面774微米。堆栈从700微米到1020微米的组织表面的下方。一个8倍数码变焦被用来捕捉细节，如精细的工序。图片为225×225微米大小，比例尺= 20微米。
图4代表三维重建图像（225×225×320微米），在图3中的图像堆栈。图片为225×225微米大小，比例尺= 28微米。
图5。高分辨率重建图像的V层锥体神经元的新皮层使用10倍数码变焦。神经元尺寸为485微米长，比例尺= 25微米。为每个图像平铺的视场为180微米×180微米。每一瓦片是在一个不同的深度（z轴的水平）。皮质顶树突不这样做，在一般情况下，快递YFP以及胞体。都在同一视野，如下图所示，电源降低到最小化的胞体的饱和度，这使得精细工艺的外观调光器。我们这里强调的是在展示场的看法，而不是精细的细节。为了显示更精细的细节，使用数码变焦，集中在一个地区，而胞体，并提高激光功率。
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Discussion
虽然标准的有机染料是兼容的有机溶剂的范围内，因此，不清除协议构成特别的挑战，荧光蛋白往往是在溶剂中的改变的耐性低。4本工作的目的是克服一个严重的限制以前的光学结算协议XFPS荧光的丢失或严重退化。这里所呈现的图像表明，荧光YFP被保存。光透明这里描述的技术允许YFP标记的神经元在长达2毫米的整个鼠脑组织表面下的高清晰度成像。先前证明，使用乙醇脱水，也将保留绿色和红色荧光蛋白信号4所示的图像在这里演示如何该光学结算技术也可以应用于研究整个器官的地区，如海马或新皮层表达荧光蛋白。高多光子显微镜的分辨能力也可以清晰放大特定的细胞或内器官地区的兴趣领域。蛋白质的荧光维护的关键点是避免过度固定，照顾，固色剂和所有的解决方案都保持在接近中性pH值，而不是使用乙醇甲醇脱水，并在黑暗中存储的样本。
虽然我们在这里展示的小鼠大脑成像的光透明使用，该技术是普遍适用于大多数器官。在这项研究中，我们发现整个鼠标的大脑区域的高清晰度图像（新皮层和海马）和新皮层（V层的Thy1系YFPH鼠标线的标签在海马锥体细胞和散在新皮层，其他9个区域内的特定神经元出现暗）。使用图像堆栈V层锥体神经元的神经元的3D重建体积已建立。的难易程度whicH这些图像深的小鼠大脑内被抓获后，在高分辨率光学结算使得这是一个强大的工具，为研究神经解剖学。然而，，而灰质清除非常好，大脑成像深度的限制不完整的结算密集的中心附近的大脑的白质。这是不是一个问题，在其他器官。
使用，以进行结算的巴布的一个缺点是，它是用常规浸渍目标不兼容。高折射率的溶剂的结算结果，使光学象差，且溶剂能溶解胶保持在目标中的透镜的地方。因此，我们用微距镜头，尼康AZ PlanFluor 5X 0.5NA WD15毫米，结合〜2毫米现场的视图的横向分辨率为〜400 nm（1 / e的半径）和轴向分辨率为〜4.9微米（1 / e的半径）。该镜头还具有校正的衣领补偿球面像差。然而，这个镜头有一个22毫米的背面光圈，因此可能无法很容易地适应标准的商业系统。机自定义线程适配器可以安装到一个标准的显微镜的镜头，但应小心，以确保激发光束轮廓填充后面的光圈尽可能最大限度地利用可用的数值孔径。虽然这种透镜是能够集中没有浸没到巴布溶液通过一个相对较大的深度（约2毫米），其0.5 NA不提供足够的分辨率用于成像的树突棘。具有较高的NA至少为0.6〜40倍放大的镜头是能够解决的树突棘。然而，它必须有足够的工作距离，以避免在巴布溶液浸泡。保持这个距离可能会限制远低于2毫米的深度，可以通过清理的z-堆栈的图像的深度。
应当注意的是，固定和结算可以增加信号从一端的荧光ogenous源。这最好是避免通过选择较长波长激发（> 800nm）的和仔细挑选的发射过滤器，以及匹配的指示剂染料的荧光光谱。
最近，一种新的脲基清除剂已被证明作为尺度称为保存从荧光蛋白10的信号，然而，它需要2周- 6个月以清除样品相比，用了几个小时为巴布。规模也离开组织非常脆弱，大量的组织扩张，并使用尿素，变性许多蛋白质，可能是有问题的后续研究采用免疫组化。相比之下，虽然结算处理可以导致一些均匀的组织的收缩率（〜20％），清除与巴布已被证明是兼容标准的组织学处理1,2。
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Disclosures
按照耶鲁大学实验动物护理和使用委员会提出的指导方针和规定，对动物进行的实验。
Acknowledgments
我们要感谢他的援助，在视频编辑雅各索利斯。
这部分工作是由美国国家科学基金会职业奖DBI-0953902 MJ列文。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, Inc. | D8537 | 500 ml, pH 7.2 |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 10 x 10 ml, 16% paraformaldehyde |
| Ethyl alcohol | American Bioanalytical | AB00515-00500 | 500 ml, 200 proof |
| Ethyl alcohol | Pharmco Products, Inc. | 111000190 | 1 gal., 190 proof |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich, Inc. | 402834 | 500 ml, 99+% |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich, Inc. | B6630-IL | 500 ml, ≥ 99% |
| 5X/0.5 NA objective | Nikon | AZ Plan Flour 5X | 15 WD |
References
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