Summary
पूरे माउस अंगों के Multiphoton माइक्रोस्कोपी ऑप्टिकली इमेजिंग से पहले अंग समाशोधन द्वारा संभव है, लेकिन नहीं सभी प्रोटोकॉल फ्लोरोसेंट प्रोटीन के फ्लोरोसेंट संकेत बनाए रखने. इथेनॉल आधारित निर्जलीकरण और benzyl शराब के साथ एक ऑप्टिकल समाशोधन विधि का प्रयोग: बेंजाइल बेंजोएट समाशोधन, हम पूरे माउस मस्तिष्क YFP व्यक्त की उच्च संकल्प multiphoton छवियों को दिखाने के.
Abstract
पूरे माउस अंगों की आंतरिक प्रतिदीप्ति और 2 हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) के multiphoton माइक्रोस्कोपी ऑप्टिकली इमेजिंग पहले अंग समाशोधन द्वारा संभव बनाया है. 1,2 हालांकि, अंगों कि GFP और YFP में फ्लोरोसेंट प्रोटीन होते, ऑप्टिकल समाशोधन प्रोटोकॉल है कि मेथनॉल का उपयोग के लिए निर्जलीकरण और स्पष्ट benzyl शराब का उपयोग: benzyl benzoate (Babb) जबकि 3 प्रकाश से असुरक्षित फ्लोरोसेंट संकेत संरक्षित नहीं है. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक उपन्यास में जिस तरह प्रदर्शन करने के लिए माउस मस्तिष्क पर पूरे अंग ऑप्टिकल समाशोधन जबकि YFP न्यूरॉन्स में व्यक्त की प्रतिदीप्ति संकेत के संरक्षण है. ऑप्टिकल समाशोधन ऐसी है कि अंग निर्जलित एक इथेनॉल वर्गीकृत श्रृंखला का उपयोग फ्लोरोसेंट प्रोटीन को नुकसान को कम करने के लिए और उनके multiphoton इमेजिंग के लिए फ्लोरोसेंट संकेत बनाए रखने के लिए पाया गया है प्रोटोकॉल बदलकर 4 इथेनॉल आधारित निर्जलीकरण के साथ ऑप्टिकल समाशोधन के एक अनुकूलित पद्धति का उपयोग करके और Babb द्वारा समाशोधनजबकि प्रकाश से परिरक्षित, हम ऊतक सतह के नीचे एक माउस 2 मिमी से अधिक मस्तिष्क के न्यूरॉन्स में पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति (YFP) के उच्च संकल्प multiphoton छवियों को दिखाने के.
Protocol
1. 5 पशु परफ्यूज़न और पूरे माउस मस्तिष्क क्लियरिंग
- प्रक्रिया की पूरी लंबाई समय की लंबाई निर्जलीकरण कदम के प्रति इस्तेमाल पर निर्भर करते हुए भिन्न हो सकता है, लेकिन पूरी प्रक्रिया में कुल दो दिनों में आयोजित किया जा सकता है.
- YFP चूहों का वजन और फिर गहरा ketamine / xylazine (100 मिलीग्राम / किग्रा: 10 मिलीग्राम / किग्रा) के एक intraperitoneal इंजेक्शन के साथ anesthetize.
- सर्जरी करने के लिए आगे बढ़ने से पहले गहरी संज्ञाहरण के एक शल्य विमान की पुष्टि. पशु हर 5 मिनट के लिए अगर यह एक फर्म पैर या पूंछ चुटकी प्रतिक्रिया की जाँच करें. यदि पशु प्रतिक्रिया करता है, ketamine / xylazine की पूरक खुराक (मूल खुराक के 1/3) की आवश्यकता है.
- गहरा anesthetized एक बार, एक शल्य चिकित्सा प्रयोगशाला टेप का उपयोग कर बिस्तर के प्रत्येक अंग पालन इतना है कि माउस एक लापरवाह स्थिति (पृष्ठीय recumbancy) में है, सर्जरी के लिए अपने सीने को उजागर करके माउस को नियंत्रित करना. सर्जिकल बिस्तर आमतौर पर धातु या प्लास्टिक की जाली से बना है और एक सिंक में या एक ओंठों पैन की शीर्ष पर रखा है ताकि रक्त और लगानेवालाअपशिष्ट आसानी से एकत्र किया जा सकता है.
- शुरू करने के लिए, xyphoid प्रक्रिया नीचे एक चीरा बनाने. रिब पिंजरे कैंची और चिमटी का उपयोग कर के आधार के साथ काटें और त्वचा वापस खींच के रूप में काट दिया है. माउस उरोस्थि के दोनों ओर के साथ दो कटौती (पसलियों) के माध्यम से ऊतक के एक प्रालंब कि दूर छोड़ दिल उजागर hemostat का उपयोग छाती गुहा से आयोजित किया जाता है बनाने के लिए करें.
- दिल के बाएं वेंट्रिकल में एक 23 छ सुई डालें और सही atrium की मांसपेशियों की दीवार में एक छोटा सा चीरा बनाने के लिए खून से बचने के लिए अनुमति. कृपया इस प्रक्रिया का एक वीडियो के लिए 2497 लेख जौव देखें 5.
- तुरंत बाद सही atrium कट जाता है, 4 के साथ एक छिड़काव शुरू ° C फॉस्फेट खारा buffered, पीबीएस (7.2 पीएच) जब तक रक्त नहीं रह दिल की सही atrium (30 से draining मनाया जाता है - 5 के बारे में एक दर पर 40 मिलीलीटर एमएल / मिनट).
- एक बार सभी खून सूखा किया गया है (निकल सही atrium द्रव स्पष्ट है), एक ठंडा 4% छिड़काव मध्यम स्विचपीएफए समाधान. छिड़कना तक माउस शरीर काफ़ी कठोर और स्पर्श (लगभग 30 - के बारे में 5 मिलीग्राम / मिनट की दर पर 40 मिलीलीटर) ठंडा हो जाता है. (केंद्रित 16% पीएफए समाधान निर्माता के निर्देशों और NaOH 7.2 पीएच तक पहुँच जाता है जोड़ा जाता है के अनुसार पतला दस्ताने और एक प्रयोगशाला कोट पहनें और संभाल और एक धूआं हुड के अंदर रसायनों का मिश्रण है.)
- छिड़काव के बाद शल्य बिस्तर से माउस को हटाने और मस्तिष्क के छांटना शुरू करने के लिए सिर काटना.
- संदंश और कैंची परितारिका का उपयोग, छोटे खोपड़ी के पीछे से शुरू करने और आगे बढ़ने के वर्गों में खोपड़ी को हटा दें. छोटे हर 2 कटौती खोपड़ी भर में कैंची के साथ 4 मिमी जबकि संदंश का उपयोग करने के लिए ध्यान से छोटे खंडों में मस्तिष्क से हड्डी दूर खींच. जब तक इस पूरे मस्तिष्क के ऊपर की सतह उजागर हो रहा है.
- एक 5 मिमी चौड़ी, फ्लैट रंग और एक कांच की शीशी में जगह का उपयोग कर खोपड़ी से उत्पाद शुल्क मस्तिष्क. 4% 4 में 6 घंटे के लिए पीएफए ° सी में पोस्ट निर्धारण के लिए डूब.
- पोस्ट करने के बादनिर्धारण, मस्तिष्क पीएफए डालने का कार्य बाहर और कांच की शीशी की पीबीएस के साथ यह जगह से कमरे के तापमान पीबीएस में दो बार धो लो. बाहर डालने का कार्य है और एक दूसरे धोने के लिए पीबीएस के साथ जगह से पहले पीबीएस समाधान में मस्तिष्क भंवर.
- कमरे के तापमान पर इथेनॉल incubations वर्गीकृत श्रृंखला (एक बार में 50%, 70%, 95%, और दो बार में 100%), ऊष्मायन प्रति 2 घंटा और फिर 2 100% इथेनॉल ऊष्मायन के लिए 12 घंटा मस्तिष्क, निर्जलीकरण निश्चित ऊतकों से पानी निकाल सकते हैं. प्रत्येक ऊष्मायन के लिए कांच की शीशी से पिछले इथेनॉल समाधान डालना और यह बाद समाधान के साथ की जगह जब तक मस्तिष्क पूरी तरह से जलमग्न है.
- 100% इथेनॉल में 2 ऊष्मायन के बाद, बाहर समाधान डालना और बराबर भागों इथेनॉल और समाशोधन benzyl शराब और बेंजाइल बेंजोएट (1:2 खंड: खंड अनुपात) युक्त समाधान के साथ बदलें. ऊष्मायन, पसाना इस समाधान के 2 घंटे बाद और benzyl शराब और बेंजाइल बेंजोएट (1:2 खंड: खंड अनुपात) के एक 100% समाधान के साथ बदलें. refraसमाशोधन समाधान के ctive सूचकांक n = 1.54 है.
- एक बार Babb में, मस्तिष्क ज़ाहिर पारदर्शी बनने के लिए, 4 के भीतर - 5 घंटा. सबसे अच्छा समाशोधन परिणामों के लिए, मस्तिष्क 6 दिनों के लिए कमरे के तापमान पर साफ करने के लिए, जबकि उज्ज्वल प्रकाश से परिरक्षित छोड़ दें.
2. माइक्रोस्कोप सेटअप
- एक बार मस्तिष्क को मंजूरी दे दी है और इमेजिंग के लिए तैयार है, यह एक पेट्री डिश के नीचे करने के लिए प्रत्यय cyanoacrylate का उपयोग कर. चिपकने वाला आगे बढ़ने से पहले शुष्क करने की अनुमति दें.
- सूखने के बाद, Babb में मस्तिष्क डूब और इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप उद्देश्य के तहत पेट्री डिश जगह.
- हम एक multiphoton खुर्दबीन का उपयोग करें कि एक माई ताई टाइटेनियम नीलमणि लेजर एक 710 एनएम के बीच 990 एनएम उत्तेजना तरंग दैर्ध्य समायोज्य को शामिल किया है. हम YFP संकेतों को उत्पन्न करने के लिए उपयोग उत्तेजना तरंग दैर्ध्य 886 एनएम है. लेजर बिजली 30 से बदलता है - 100 मेगावाट इमेजिंग गहराई पर निर्भर करता है.
- परिलक्षित फ्लोरोसेंट एक Nikon 5X उद्देश्य (एनए, 0.5) का उपयोग करते हुए संकेत है कि बड़े पैमाने के लिए अनुमति देता है पर कब्जाक्षेत्र के दृश्य इमेजिंग (2 x 2 मिमी).
- परिलक्षित फ्लोरोसेंट संकेत एक 535/50 bandpass फिल्टर का उपयोग फ़िल्टर और इसे इकट्ठा एक GaAsP PMT (-40 H7422PA, हमामात्सू, Bridgewater, न्यू जर्सी) का उपयोग.
- प्रक्रिया 2048 x 2048 पिक्सल 2 ms प्रति उच्च संकल्प, YFP छवियों को उत्पन्न करने के लिए लाइन के स्कैन दर का उपयोग करने के एक प्रस्ताव पर ScanImage 6 सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवियों.
- एक बार जब इमेजिंग पूरा हो गया है, पेट्री डिश संदंश और Babb में दुकान भविष्य इमेजिंग के लिए प्रकाश से परिरक्षित का उपयोग कर से मस्तिष्क को हटा दें. चिपके नमूने के लिए, और एक नहीं 30 डिग्री से अधिक के कोण पर पेट्री डिश गोंद के बीच एक रेजर ब्लेड चलाने के ऊतक को हटाने. हम Babb में नमूने संग्रहीत किया गया है के लिए 1 वर्ष के लिए नहीं दिखाई गिरावट के साथ.
3. प्रतिनिधि परिणाम
प्रतिनिधि छवियों और वीडियो यहाँ दिखाया उच्च संकल्प multiphoton इमेजिंग क्षमता का प्रदर्शन ऑप्टिकल समाशोधन के द्वारा ही संभव बनाया. पूरे मस्तिष्क इमेजिंग की अनुमति देता हैYFP लेबल हिप्पोकैम्पस और प्रांतस्था के अलग परतों में न्यूरॉन्स ऊतक सतह के नीचे 2 मिमी के रूप में गहरी के रूप में स्पष्ट रूप से दिखाई दे सकता है. चित्रा 1 के लिए एक राज्याभिषेक देखने के एक प्रतिनिधि छवि 2.92 लांगुलिय मिमी में हिप्पोकैम्पस की शारीरिक विशेषताओं के लिए इसी से पता चलता है 7 शीर्षस्थान. नमूने में इमेजिंग की गहराई 1.94 मिमी था. इस अंतर का कुछ मस्तिष्क की दुम का अंत में सेरिबैलम के हटाने के कारण था और संतुलन निर्जलीकरण प्रक्रिया से संकोचन की वजह से था. ढेर से एक और छवि neocortex ऊतक सतह (2 चित्रा) के नीचे 2 मिमी YFP व्यक्त की परत / वी छठी पिरामिड न्यूरॉन्स से पता चलता है. सभी छवियों का उपयोग कर हासिल किया गया Nikon 5X उद्देश्य और बढ़ाई छवि अधिग्रहण लिए ScanImage सॉफ्टवेयर में डिजिटल जूम की सुविधा का उपयोग किया गया था.
Neocortex पर में zooming neocortex की परत वी में पिरामिड न्यूरॉन्स की व्यक्तिगत और axons न्यूरॉन सेल शरीर को साफ कर रहे हैंवर्गो में विभाजनीय ऊतक सतह के नीचे 1.02 मिमी (3 चित्रा) करने के लिए ly. चित्रा 3 से छवि ढेर का उपयोग, न्यूरॉन क्षेत्र के एक 3 डी पुनर्निर्माण ImageJ 8 सॉफ्टवेयर (चित्रा 4) का उपयोग किया गया था.
एम पी एम के उच्च संकल्प क्षमता भी हमें पूरे, व्यक्तिगत न्यूरॉन्स की छवियों को पेश करने के लिए अनुमति देता है. यहाँ हम neocortex में जो व्यक्ति वृक्ष के समान प्रक्रिया स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं (5 चित्रा) की एक परत वी पिरामिड न्यूरॉन के पुनर्निर्माण दिखाते हैं.
चित्रा 1 एक 1.2 मिमी छवि ढेर से प्रतिनिधि (0.8 - ऊतक सतह के नीचे 2 मिमी) छवि पूरे माउस मस्तिष्क neocortex और हिप्पोकैम्पस की विभिन्न परतों दिखा. हिप्पोकैम्पस के रूप दिखाई ऊतक सतह के नीचे 1.1 मिमी और पालन का उपयोग चिह्नित किया गया है7 महानिदेशक = दांतेदार गाइरस, = महानिदेशक की बारीक परत GrDG Lmol = lacunosum moleculare परत, Mol = आणविक परत महानिदेशक, या = oriens परत, PoDG = polymorph परत महानिदेशक, Py = पिरामिड सेल परत, रेड = परत radiatum: आईएनजी कोड. छवि आकार में 1.8 x 1.8 मिमी, पैमाने बार = 200 सुक्ष्ममापी है. मस्तिष्क के व्याख्यान चबूतरे वाला अंत दुम का उद्देश्य की ओर का सामना करना पड़ रहा अंत के साथ एक पेट्री डिश चिपका था. यह राज्याभिषेक विमान में इमेजिंग सुविधा.
चित्रा 2 1.2 मिमी छवि ढेर से प्रतिनिधि (0.8 - ऊतक सतह के नीचे 2 मिमी) फ्रेम पूरी माउस neocortex हाइलाइटिंग मस्तिष्क के. Pyramidal कोशिकाओं और प्रक्रियाओं के बारे में परत वी / प्रांतस्था के छठी में YFP व्यक्त ऊतक सतह के नीचे दिखाई 2 मिमी. लेबलिंग की डिग्री neocortex में विरल लेबलिंग की पिछली रिपोर्टों के साथ संगत है नौ इनसेट ख (दाएं) से बढ़ा है. बाईं तरफ oxed क्षेत्र. छवि आकार में 1.8 x 1.8 मिमी है, पैमाने बार = 200 सुक्ष्ममापी 50 सुक्ष्ममापी (इनसेट).
चित्रा 3 प्रतिनिधि फ्रेम परत मस्तिष्क के neocortex में वी पिरामिड न्यूरॉन्स की छवि ढेर से ऊतक सतह के नीचे 774 सुक्ष्ममापी लिया. ढेर 700 सुक्ष्ममापी से ऊतक सतह के नीचे 1020 सुक्ष्ममापी करने के लिए चला जाता है. एक 8x डिजिटल ज़ूम ठीक प्रक्रियाओं जैसे विवरण पर कब्जा करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. छवि आकार में 225 x 225 सुक्ष्ममापी, पैमाने बार = 20 सुक्ष्ममापी है.
चित्रा 4 चित्रा 3 में छवि ढेर 3D पुनर्निर्माण के प्रतिनिधि की छवि (225 x 225 x 320 सुक्ष्ममापी). छवि आकार में 225 x 225 सुक्ष्ममापी, पैमाने बार = 28 सुक्ष्ममापी है.
चित्रा 5 उच्च संकल्प neocortex एक 10X डिजिटल ज़ूम का उपयोग करने की एक परत वी पिरामिड न्यूरॉन के खंगाला छवि. न्यूरॉन लंबाई पैमाने बार = 25 सुक्ष्ममापी में 485 सुक्ष्ममापी उपाय. प्रत्येक छवि टाइल के लिए देखने के क्षेत्र 180 x 180 सुक्ष्ममापी सुक्ष्ममापी है. प्रत्येक टाइल एक अलग गहराई (z-स्तर) पर है. cortical शिखर dendrites, सामान्य, एक्सप्रेस YFP सोमा में के रूप में के रूप में अच्छी तरह से नहीं करते हैं. देखने का एक ही क्षेत्र में दोनों है, के रूप में यहाँ दिखाया गया है, बिजली सोमा की संतृप्ति को कम करने के लिए उतारा गया है, यह ठीक प्रक्रिया देखो dimmer बनाता है. हमारे यहाँ ठीक विस्तार के बजाय क्षेत्र के दृश्य का प्रदर्शन करने पर जोर दिया था. बेहतर जानकारी प्रकट करने के लिए, एक डिजिटल ज़ूम का उपयोग, एक क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित करने सोम बिना, और लेजर शक्ति में वृद्धि.
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Discussion
जबकि मानक कार्बनिक रंजक कार्बनिक सॉल्वैंट्स की एक सीमा के साथ संगत कर रहे हैं, और इसलिए प्रोटोकॉल समाशोधन के लिए एक विशेष चुनौती पैदा नहीं करते, फ्लोरोसेंट प्रोटीन अक्सर परिवर्तन की कम सहिष्णु विलायक में 4 वर्तमान कार्य के लक्ष्य की एक गंभीर सीमा को पार करने के लिए गया था. पिछले ऑप्टिकल समाशोधन प्रोटोकॉल जहां XFPs के प्रतिदीप्ति खो गया था या गंभीर रूप से अपमानित. छवियों है कि यहाँ प्रस्तुत कर रहे हैं दिखाना है कि YFP से प्रतिदीप्ति संरक्षित किया गया था. ऑप्टिकल समाशोधन यहाँ वर्णित तकनीक YFP लेबल पूरे माउस मस्तिष्क में ऊतक सतह के नीचे न्यूरॉन्स 2 मिमी की उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए अनुमति देता है. इथेनॉल निर्जलीकरण का उपयोग, के रूप में पहले दिखा, हरे और लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन संकेतों की रक्षा करेंगे. 4 छवियों को यहाँ प्रदर्शन कैसे इस ऑप्टिकल समाशोधन तकनीक हिप्पोकैम्पस या neocortex कि एक्सप्रेस फ्लोरोसेंट प्रोटीन के रूप में पूरे अंग क्षेत्रों का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है दिखाया. उच्चसंकल्प multiphoton माइक्रोस्कोपी की क्षमता भी विशिष्ट या अंग क्षेत्र के भीतर ब्याज की कोशिकाओं क्षेत्रों के स्पष्ट वृद्धि के लिए अनुमति देता है. प्रोटीन प्रतिदीप्ति के संरक्षण के लिए महत्वपूर्ण अंक अधिक निर्धारण से बचने के लिए, ध्यान रखना कि लगानेवाला और सभी समाधान तटस्थ पीएच के करीब बनाए रखा जाता है, निर्जलीकरण के लिए बजाय इथेनॉल मेथनॉल का उपयोग करने के लिए, और अंधेरे में नमूने की दुकान हैं.
हालांकि हम यहाँ माउस मस्तिष्क के इमेजिंग के लिए ऑप्टिकल समाशोधन के उपयोग के प्रदर्शन, तकनीक आम तौर पर ज्यादातर अंगों को लागू है. इस अध्ययन में हम पूरे माउस मस्तिष्क क्षेत्रों के उच्च संकल्प छवियों (neocortex और हिप्पोकैम्पस) और neocortex लेयर वी (हिप्पोकैम्पस में और कम neocortex में माउस Thy1 YFPH लाइन पिरामिड कोशिकाओं लेबल, 9 अन्य क्षेत्रों के भीतर विशिष्ट न्यूरॉन्स दिखाया अंधेरा दिखाई). परत वी पिरामिड न्यूरॉन्स की छवि ढेर का उपयोग, न्यूरॉन्स के एक 3D खंगाला मात्रा बनाया गया था. जो के साथ आरामज इन छवियों माउस मस्तिष्क के भीतर गहरे कब्जा कर लिया गया है उच्च संकल्प के बाद ऑप्टिकल समाशोधन neuroanatomy के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण बना देता है. हालांकि, जबकि ग्रे मामले बहुत अच्छी तरह से साफ करता है, मस्तिष्क में इमेजिंग गहराई अंततः मस्तिष्क के केंद्र के पास घने व्हाइट मैटर ट्रैक्ट की अधूरी समाशोधन द्वारा सीमित किया गया था. यह अन्य अंगों में एक मुद्दा नहीं है.
समाशोधन के लिए Babb का उपयोग करने का एक दोष यह है कि यह पारंपरिक की सूई के उद्देश्यों के साथ संगत नहीं है. उच्च अपवर्तक सूचकांक विलायक है कि ऑप्टिकल aberrations के में समाशोधन परिणाम के लिए सक्षम बनाता है, और विलायक गोंद है कि उद्देश्य में जगह में लेंस धारण भंग कर सकते हैं. इसलिए हम एक मैक्रो लेंस, Nikon AZ PlanFluor 5X 0.5NA WD 15 मिमी, कि एक ~ ~ 400 एनएम के एक पार्श्व संकल्प (त्रिज्या 1 / ई) और 4.9 ~ की axial संकल्प के साथ 2 मिमी क्षेत्र के दृश्य को जोड़ती सुक्ष्ममापी (1 / ई त्रिज्या). लेंस भी सुधार करने के लिए गोलाकार aberrations के लिए क्षतिपूर्ति कॉलर है. हालांकि, इस लेंसएक 22 मिमी वापस एपर्चर है और इसलिए आसानी से मानक वाणिज्यिक प्रणालियों के लिए अनुकूलित नहीं किया जा सकता है. एक एक कस्टम धागा एक मानक खुर्दबीन पर बढ़ते लेंस सक्षम है, लेकिन देखभाल के लिए सुनिश्चित करें कि उत्तेजना बीम प्रोफ़ाइल वापस एपर्चर जितना संभव के रूप में भरता उपलब्ध संख्यात्मक एपर्चर का अधिकतम उपयोग कर लिया जाना चाहिए अनुकूलक मशीन सकता है. हालांकि इस लेंस Babb समाधान में विसर्जन के बिना एक अपेक्षाकृत बड़ी गहराई (~ 2 मिमी) के माध्यम से ध्यान केंद्रित करने में सक्षम था, इसकी NA 0.5 इमेजिंग वृक्ष के समान spines के लिए पर्याप्त संकल्प नहीं प्रदान करता है. कम से कम 0.6 और ~ 40X बढ़ाई के एक उच्च एनए के साथ एक लेंस वृक्ष के समान spines को हल करने में सक्षम है. हालांकि, यह पर्याप्त काम Babb समाधान में विसर्जन से बचने के दूरी होनी चाहिए. इस दूरी को बनाए रखने की संभावना छवि z ढेर 2 मिमी गहराई समाशोधन के माध्यम से उपलब्ध है अच्छी तरह से नीचे की गहराई तक सीमित कर देगा.
यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि निर्धारण और समाशोधन अंत से संकेत में वृद्धि कर सकते हैंप्रतिदीप्ति की ogenous स्रोतों. यह सबसे अच्छा अब तरंग दैर्ध्य (> 800 एनएम) उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर का चयन सावधानी से ही सूचक डाई प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रम मैच चुनने से बचा है.
हाल ही में, एक नई यूरिया आधार समाशोधन एजेंट पैमाने के रूप में निर्दिष्ट फ्लोरोसेंट 10 प्रोटीन से संकेत की रक्षा करने के लिए प्रदर्शन किया गया है, तथापि, यह 2 सप्ताह लगते हैं - 6 महीने के लिए एक नमूना स्पष्ट Babb के लिए कुछ घंटों के साथ तुलना में. पैमाने पर भी बहुत नाजुक ऊतक पत्ते, ऊतक विस्तार की बड़ी मात्रा के साथ, और यूरिया, जो कई प्रोटीन denatures का उपयोग पालन immunohistochemistry का उपयोग करते हुए अध्ययन के लिए समस्याग्रस्त होने की संभावना है. इसके विपरीत, हालांकि समाशोधन प्रक्रिया कुछ वर्दी ऊतक (~ 20%) संकोचन, Babb साथ समाशोधन में परिणाम कर सकते हैं करने के मानक histological प्रसंस्करण 1,2 के साथ संगत होना दिखाया गया है.
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Disclosures
जानवरों पर प्रयोग येल विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया.
Acknowledgments
हम याकूब Solis वीडियो संपादन में उसकी सहायता के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा.
इस काम के हिस्से में एक NSF कैरियर एम.जे. Levene पुरस्कार DBI-0953902 द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, Inc. | D8537 | 500 ml, pH 7.2 |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 10 x 10 ml, 16% paraformaldehyde |
| Ethyl alcohol | American Bioanalytical | AB00515-00500 | 500 ml, 200 proof |
| Ethyl alcohol | Pharmco Products, Inc. | 111000190 | 1 gal., 190 proof |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich, Inc. | 402834 | 500 ml, 99+% |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich, Inc. | B6630-IL | 500 ml, ≥ 99% |
| 5X/0.5 NA objective | Nikon | AZ Plan Flour 5X | 15 WD |
References
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