Summary
全体マウス器官の多光子顕微鏡は、光学的にイメージを作成する前に臓器をクリアすることにより可能ですが、そうでない場合、すべてのプロトコルは、蛍光タンパク質の蛍光信号を保持します。エタノールベースの脱水およびベンジルアルコールを用いて光学クリア方法を使用する場合：安息香酸ベンジルのクリアは、YFPを発現全体のマウスの脳の高解像度多画像を示す。
Abstract
全体マウス器官の固有蛍光と第二高調波発生（SHG）の多光子顕微鏡は、光学イメージング前器官をクリアすることによって実現されています。1,2しかし、このようなGFPとYFPなどの蛍光タンパク質を含む器官、メタノールを使用した光クリアプロトコルのベンジルアルコールを使用して脱水およびクリアライト3から保護されていないながら、安息香酸ベンジル（Babbの）は、蛍光シグナルを保持しません。ここで紹介するプロトコルは、神経細胞で発現YFPの蛍光シグナルを保持したまま、マウスの脳で臓器全体の光のクリアを実行するためにした斬新な方法です。臓器が蛍光タンパク質へのダメージを軽減し、多光子イメージングのための彼らの蛍光シグナルを維持するために発見されているエタノール傾斜シリーズを用いて脱水であること、このような光学決済プロトコルを変更すること。4エタノールベースの脱水と光学清算の最適化された方法を使用するとBabbのでクリア遮光しながら、我々は、組織表面の下に2ミリメートル以上のマウスの脳のニューロンにおける黄色蛍光タンパク質（YFP）式の高解像度多画像を示す。
Protocol
1。動物灌流5と全体のマウス脳のクリア
- 手続きの全体の長さは、脱水工程ごとに使用される時間の長さによって異なりますが、合計で全体のプロセスは2日間で実施することができる。
- YFPマウスを計量してから、深くケタミン/キシラジン（100 mg / kgを10 mg / kg）の腹腔内注射で麻酔。
- 手術に進む前に、深い麻酔の外科プレーンを確認します。動物にそれがしっかりとつま先やテールピンチに反応するかどうかを確認するために5分毎にチェックマークを付けます。動物が反応する場合、ケタミン/キシラジンの補足用量（元用量の1/3）が必要です。
- 一度深く麻酔し、マウスが手術のためにその胸を露出して、仰臥位（背recumbancy）になるように、ラボのテープを使用して手術台に各肢を接着することで、マウスを抑制する。手術台は、通常、金属やプラスチック製のメッシュで作られており、シンクにまたは口を閉ざしてパンの上に置かれるように血液や固定廃棄物は、容易に収集することができる。
- 開始するには、xyphoidプロセス下切開を行います。はさみとピンセットを使用して、胸郭のベースに沿ってカットし、カットがなされると同時に皮膚を引き戻す。心臓が露出したままに止血剤を用いて胸腔から離れて保持されている組織のフラップを作成するために、マウスの胸骨の両側（リブを介して）に沿って2つのカットを行います。
- 心臓の左心室に23グラムの針を挿入し、血液を逃がすために、右心房の筋肉の壁に小さな切開を加える。この手順のビデオの記事2497 Joveのために参照してください。5
- 40ミリリットル約5の割合で - 右心房が切断された直後に、血液がもはや心臓の右心房（30から排出が観察されなくなるまで°Cのリン酸緩衝生理食塩水、PBS液（pH7.2）をバッファリングされた4による灌流を開始ml /分）。
- 一度、すべての血液は（右心房を出る流体がクリアされている）排出された、冷やした4％に灌流媒体を切り替えるPFAのソリューションを提供します。マウスの体がタッチ（ - 約5ml /分の速度で40ミリリットル約30）に著しく剛性とコールドになるまで灌流する。 （濃縮16パーセントのPFA溶液はメーカーの指示およびpH 7.2に到達するまでNaOHを加えているに応じて希釈される。手袋と白衣を着用し、ドラフト内部の化学物質を扱うと混ぜる。）
- 灌流後、手術台からマウスを削除して、脳の切除を開始するために首をはねる。
- 鉗子および虹彩のはさみを使用して、頭蓋骨の裏から始まり、前進小さなセクションで頭蓋骨を削除します。慎重に小さなセクションでは、脳から離れて骨を引っ張るために鉗子を使用しながら、頭蓋骨全体ではさみで4ミリメートル - 小さな切り傷毎に2を加えます。脳の上面全体が露出されるまでこれを行う。
- ガラスバイアルに幅5mm、平らなへらと場所を使って頭蓋骨から脳を切除する。ポスト固定のため4時で6時間4％PFA°Cで水没。
- POSTの終了後に固定、ガラスバイアルのPFAを注ぎ、PBSでそれを置き換えることにより、室温でPBSで2回脳を洗う。注ぐと第二の洗浄PBSで交換する前に、PBS溶液中で渦脳を。
- 傾斜インキュベーションあたり2時間でエタノールのインキュベーションのシリーズ（一回で50％、70％、95％、二回では100％）、次いで第2の100％エタノールのインキュベーションのための12時間で、室温で脳を脱水するかに固定組織から水を抽出します。各インキュベーションについては、ガラスバイアルから前のエタノール溶液を注ぐと脳が完全に水没するまで、後続のソリューションに置き換えます。
- 100％エタノール中で第二のインキュベーションした後、溶液を注ぐと等量のエタノールとベンジルアルコールと安息香酸ベンジル（1:2容量：容量比）を含む決済ソリューションと交換してください。インキュベーションの2時間後、この溶液をデカントし、ベンジルアルコールと安息香酸ベンジル（1:2容量：容量比）の100％溶液と交換してください。 refra決済ソリューションのctiveインデックスはN = 1.54である。
- 一度Babbの中で、脳は4内で、著しく透明になる - 5時間。最高の清算の結果を得るには、明るい光から遮蔽しながら室温で6日間クリアする脳のままにしておきます。
2。顕微鏡のセットアップ
- 脳をイメージングのためにクリアされ、準備された後、シャーレの底に貼り、それはシアノアクリレートを使用して。接着剤は、先に進む前に乾燥することができます。
- 乾燥させた後、水没Babbの中で、脳やイメージングのための顕微鏡対物レンズの下にペトリ皿を置きます。
- 我々は、990 nmの励起波長〜710 nmの間で調節可能マイタイチタンサファイアレーザーを組み込んだ多光子顕微鏡を使用しています。我々はYFP信号を生成するために使用する励起波長は886 nmである。レーザーパワーは30から変化 - 100 mWの撮像深度に応じて。
- 大が可能ニコン5X客観数（NA、0.5）を用いた反射蛍光シグナルを捕捉視野イメージング（2×2 mm）です。
- 50分の535のバンドパスフィルタを用いた反射蛍光信号をフィルタリングし、GaAsPのPMT（H7422PA-40、浜松、ブリッジウォーター、ニュージャージー州）を用いて、それを集める。
- プロセスイメージは、高解像度のYFP画像を生成するために行あたり2ミリ秒のスキャン速度を使用して2048×2048ピクセルの解像度でscanimageでもソフトウェアを使用する6。
- 一度撮影が完了すると、将来のイメージングのために遮光鉗子とBabbの中でストアを使用してペトリ皿から脳を除去します。糊付けサンプルについては、30度を超えない角度で接着剤やシャーレの間にカミソリの刃を実行することにより、組織を除去する。私たちは、目に見える劣化で最大1年間Babbの内のサンプルを格納しました。
3。代表的な結果
ここに示されている代表的な画像や動画は、高分解能多光子イメージングの能力を実証する光クリアによって可能となった。脳全体のイメージングが可能に海馬と皮質の異なる層のニューロンが組織表面下に2ミリメートルのような深いようにはっきり見えるようにYFPを標識するための図1は、尾2.92ミリメートルで、海馬の解剖学的特徴に対応した冠状断像の代表的なイメージを示していブレグマ7。サンプルのイメージングの深さは1.94 mmであった。この違いのいくつかは、脳の尾側で小脳を除去したことによるものとバランスが脱水プロセスからの収縮によるものであった。スタックから別の画像は、組織表面（ 図2）の下に2ミリメートルYFPを発現する新皮質の層V / VIの錐体細胞を示しています。すべての画像はニコン5X客観的かつ倍率がscanimageでもソフトウェアでの画像取得のためのデジタルズーム機能を使用して行われていた使用して取得した。
新皮質にズームインすることで、新皮質V層錐体細胞の個々の軸索と神経細胞体は明確であるLY組織表面下の1.02ミリメートル（ 図3）まで区別できる。 図3から画像スタックを使用して、ニューロン領域の3D再構成はImageJのソフトウェア8（ 図4）を用いて作製した。
MPMの高解像度能力はまた、私たちは全体、個々のニューロンの画像を提示することができます。ここでは、個々の樹状突起がはっきりと見えるされる新皮質（ 図5）のV層錐体ニューロンの再建を示しています。
図1 1.2ミリメートルの画像スタックからの代表的なイメージ（0.8 -組織表面下に2ミリメートル）。新皮質と海馬の異なる層を示す全体のマウスの脳の。海馬の機能には、1.1ミリメートル組織表面下に表示され、フォローを用いて標識されたるコード番号：DGのDG =歯状回、GrDG =顆粒層、Lmol = lacunosum moleculare層、モル=分子層、DG、または= oriens層、PoDG =多形層、DG、PY =錐体細胞層、RAD =地層放線7。画像のサイズは1.8×1.8ミリメートル、スケールバー=200μmである。脳の吻側端は客観側に向け、尾方端でシャーレに固定した。これは、前頭面での撮像を容易にした。
図2 1.2ミリメートル画像スタック（0.8 -組織表面下に2ミリメートル）からの代表的なフレーム。新皮質を強調全体マウス脳の。大脳皮質の層のV / VIにYFPを発現錐体細胞およびプロセスは、組織表面の下に表示2mmである。標識の程度は、新皮質のまばらなラベリングの以前の報告と一致しています。折り込み9（右） は bから拡大されている左のoxedエリア。画像のサイズは1.8×1.8mmで、スケールバー= 200ミクロン（50μmの挿入図）。
図3代表的なフレームは脳の新皮質のV層錐体ニューロンの画像スタックから組織表面下に774μmを撮影。スタックは700μmから組織表面下の1020μmに行く。 8Xデジタルズームはこのような微細プロセスなどの詳細をキャプチャするために使用された。画像のサイズは225×225μmのスケールバー=20μmである。
図4：図3の画像スタックの3次元再構成の代表画像（225×225×320μm）である。画像のサイズは225×225μmのスケールバー= 28μmである。
図5 10倍デジタルズームを使用して新皮質V層錐体ニューロンの高分解能再構成画像。ニューロンは、長さが485μmのスケールバー=25μmを測定します。各画像タイルの視野を180μm×180μmである。各タイルは、異なる奥行き（Zレベル）である。皮質先端樹状突起は、一般的な、急行YFPと同様ソーマで、しないでください。ここに示すように、同一視野内に両方持っていると、電源がソーマの彩度を最小限にするために低下したが、これは微細なプロセスの一見の調光を行います。ここで我々の重点は視野ではなく、細かいディテールを実証していた。細かい詳細を明らかにするために、相馬ない領域に焦点を当て、デジタルズームを使用し、レーザーパワーを上げる。
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Discussion
標準的な有機色素は、有機溶媒の範囲と互換性があり、したがって、プロトコルをクリアするために特定の課題を提起していませんが、蛍光タンパク質は、溶媒中に変更されることが多いの耐性が低下します。本研究の4つの目標は、重大な限界を克服することであったXFPを蛍光が消失または著しく低下していた以前の光学クリアプロトコル。ここで提示されている画像はYFPの蛍光が維持されていることを実証する。ここに記載された光学清算技術が組織表面下に2ミリメートルまでの全マウス脳におけるYFP標識ニューロンの高分解能イメージングを可能にします。エタノールの脱水を使用して、以前に示したように、また、緑と赤の蛍光タンパク質の信号を保持します。ここに示されている4つの画像は、この光決済技術はそのような明文の蛍光タンパク質、その海馬や大脳皮質など全臓器領域を研究するために適用することができる方法を示しています。高い多光子顕微鏡の分解能の能力も臓器領域内の関心のある特定のセルまたは領域の明確な拡大を可能にします。タンパク質の蛍光を維持するためのキーポイントは固定し、すべてのソリューションは脱水エタノールではなくメタノールを使用すると、暗闇の中でサンプルを格納するために、pHが中性に近くに保たれていることを世話をするために、過剰な固定を避けるためです。
我々はここでマウスの脳のイメージング用の光学クリアの使用方法を示していますが、この技術は、一般的にほとんどの臓器にも適用可能である。本研究では、新皮質の海馬とまばらで9他の地域を全体マウス脳領域（新皮質と海馬）と新皮質（のV層内の特定の神経細胞の高解像度の画像THY1-YFPHマウス線ラベルの錐体細胞が認められた暗い表示されます）。 V層錐体ニューロンの画像スタックを使用して、神経細胞の3次元再構成されたボリュームが作成されました。 whicと使いやすさ光学クリアがこの神経解剖学を研究するための強力なツールになり時間後には、これらの画像を高解像度でマウスの脳の奥深くに捕らえられた。しかし、脳の灰白質は非常によくクリアしながら、撮像深度は、最終的には脳の中心部に近い濃い白質路の不完全クリアで制限されていました。これは、他の臓器の問題ではありません。
クリアするためBabbのを使用しての欠点の一つは、それが従来の浸漬の目的と互換性がないということです。光学収差でクリア結果を得ることができ、溶媒は客観的で所定の位置にレンズを保持している接着剤を溶解できる溶媒の高屈折率。そこで我々は、マクロレンズ、〜400nmの空間分解能（1 / eの半径）と〜4.9の軸方向の分解能で〜2mmの視野を兼ね備えニコンアリゾナPlanFluor 5X僅か0.5nA WDの15ミリメートルを、使用ミクロン（1 / eの半径）。レンズも球面収差を補正するために補正環を持っています。しかし、このレンズを22 mm背面開口部を有しているので、簡単に標準的な商用システムに適応されない場合があります。一つはマシンのカスタム·スレッド·アダプターを標準的な顕微鏡にレンズを取り付ける有効にすることもできますが、注意が励起ビームプロファイルが利用できる開口数を最大限に利用できるように、できるだけ背中の開口部を埋めることを保証するために注意するべきです。このレンズはBabbの溶液中に浸漬することなく、比較的大きな深さ（〜2mm）を通って焦点を合わせることができましたが、その0.5 NAはイメージング樹状突起棘のために十分な解像度を提供していません。少なくとも0.6の高NA化とレンズと〜40X倍率が樹状突起棘を解決することが可能です。しかし、それはBabbの溶液に浸漬を避けるために十分なワーキングディスタンスを持っている必要があります。この距離を維持することは、可能性に十分にクリアを通じて利用2mmの深さ以下zスタック画像の深さを制限します。
これは、固定とクリアが端から信号を増加させることができることに留意すべきである蛍光のogenous源。これは、よく頑張り指示薬色素の蛍光スペクトルと一致するように長波長の励起（> 800 nm）および発光フィルターを慎重に選択を選ぶことで回避されます。
Babbのためのいくつかの時間と比較して、サンプルをクリアするために6ヶ月-最近では、スケールと呼ばれる新しい尿素ベース洗浄剤、蛍光タンパク質10からの信号を保持することが実証されている、しかし、それは2週間かかります。規模も組織拡大、大量で、非常に脆弱な組織を残し、多くのタンパク質を変性尿素、、の使用は、免疫組織化学を用いたフォローアップ研究では問題となる可能性があります。これとは対照的に、クリア処理がBabbのとクリア幾つかの均一な組織収縮率（〜20％）をもたらすことができますが、標準的な組織学的処理1,2との互換性があることが示されている。
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Disclosures
動物実験では、エール大学の機関アニマルケア＆使用委員会によって定められたガイドラインおよび規制に準拠して行った。
Acknowledgments
我々は、ビデオ編集の彼の支援のためにヤコブソリスに感謝したいと思います。
この作品は、MJのレーベンへのNSFキャリア賞、DBI-0953902によって部分的に資金を供給された。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, Inc. | D8537 | 500 ml, pH 7.2 |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | 10 x 10 ml, 16% paraformaldehyde |
| Ethyl alcohol | American Bioanalytical | AB00515-00500 | 500 ml, 200 proof |
| Ethyl alcohol | Pharmco Products, Inc. | 111000190 | 1 gal., 190 proof |
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich, Inc. | 402834 | 500 ml, 99+% |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich, Inc. | B6630-IL | 500 ml, ≥ 99% |
| 5X/0.5 NA objective | Nikon | AZ Plan Flour 5X | 15 WD |
References
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