Summary
Este trabajo presenta una técnica para la recolección de sangre de la aorta dorsal del pez cebra. También proporciona instrucciones para la obtención de suero para uso en los análisis bioquímicos, tales como ensayos para determinar los niveles de colesterol y triglicéridos.
Abstract
El pez cebra se ha utilizado como un modelo animal para estudios de varias enfermedades humanas. Puede servir como una plataforma preclínica potente para los estudios de sucesos moleculares y estrategias terapéuticas, así como para evaluar los mecanismos fisiológicos de unos 1 patologías.
Hay relativamente pocas las publicaciones relacionadas con la fisiología del pez cebra adulto de órganos y sistemas 2, que pueden conducir a los investigadores a deducir que las técnicas básicas necesarias para permitir la exploración de los sistemas de pez cebra faltan 3. Hematológicas valores bioquímicos de pez cebra fueron por primera vez en 2003 por Murtha y 4 colegas que empleó una técnica de recogida de sangre descrita por primera vez por Jagadeeswaran y sus colegas en 1999. Brevemente, se recogió sangre a través de una punta de la micropipeta a través de una incisión lateral, aproximadamente 0,3 cm de longitud, en la región de la aorta dorsal 5. Debido a las dimensiones implicadas minuto, estoEs una técnica de alta precisión que requiere un practicante altamente cualificado. La misma técnica fue utilizada por el mismo grupo en otra publicación en ese mismo año 6. En 2010, Eames y sus colegas evaluaron los niveles de glucosa en la sangre enteros en el pez cebra 7. Se tuvo acceso a la sangre mediante la realización de las decapitaciones con unas tijeras y luego insertar un tubo de recogida heparinizado microcapilar en la articulación pectoral. Ellos aluden a la dificultad con la hemólisis que se resolvieron con una temperatura de almacenamiento adecuada basada en el trabajo Kilpatrick et al. 8. Al intentar usar la técnica Jagadeeswaran en nuestro laboratorio, se encontró que era difícil hacer la incisión en el lugar correcto, precisamente como no permitir que una cantidad significativa de sangre que se pierde antes de la recolección se pudo iniciar.
Recientemente, Gupta et al. 9 se describe la forma de diseccionar los órganos adultos de pez cebra, la Kinkle et al. 10 se describe cómo llevar a cabo intraperitoninyecciones de EAL, y Pugach et al 11 se describe cómo realizar las inyecciones retro-orbital. Sin embargo, se necesita más trabajo para explorar más a fondo las técnicas básicas para la investigación en el pez cebra.
El pequeño tamaño del pez cebra presenta desafíos para los investigadores que lo utilizan como un modelo experimental. Además, dada esta pequeñez de la escala, es importante que las técnicas simples se han desarrollado para permitir a los investigadores a explorar las ventajas del modelo de pez cebra.
Protocol
1. Protocolo de Texto
- Antes de la recogida de sangre de pez cebra, es necesario para preparar el agua anestésico. Verter ~ 200 ml de agua del acuario en un recipiente con una capacidad de 500-ml. Añadir ~ 200 g de trozos de hielo. La temperatura debe ser de aproximadamente 4 ° C. Como los trozos de hielo se derriten, será necesario añadir más cubos de hielo para mantener una temperatura constante de alrededor de 4 ° C.
- Cuando el agua anestésico está listo, preparar los materiales necesarios para la recogida de sangre. Ponga un extremo de baja retención en una pipeta P20 y salir de la pipeta en el que se puede acceder fácilmente. No permita que la punta de la pipeta en contacto con cualquier fuente de contaminación.
- Cubrir una placa de Petri con un pedazo de gasa seca. Una hoja de acero y otro trozo de gasa debe ser colocado en un lugar fácilmente accesible.
- Una centrífuga adaptado para tubos de plástico se necesitará.
- Cuando los materiales antes mencionados se preparan, la captura del pez cebra primero en ser anestesiado el ingenioja red de pesca y lo liberan en el agua que ha sido preparado para la anestesia. El pez cebra requieren 3-6 s en agua fría para ser anestesiados, dependiendo de los peces. Mantenga el pez en el agua fría hasta que ya no responde a los estímulos externos.
- Uso de la red de pesca, coloque el pescado anestesiado en una pieza preparada de gasa, dejando la cola fuera de la gasa. Doble la gasa sobre la cabeza del pez y el cuerpo dejando fuera sólo su cola. Poner el pescado cubierto con la gasa sobre la placa de Petri.
- Utilice la hoja de acero para hacer una incisión en diagonal justo entre la aleta anal y la aleta caudal. La sangre empieza a salir. En este punto, es necesario trabajar con rapidez.
- Con cuidado aspirar la sangre que sale con la pipeta P20 (pre-cargado con una punta baja retención). La cantidad de sangre que puede recogerse depende del tamaño de los peces, y en qué medida en que fue anestesiado correctamente. Por lo general, varía desde 5 hasta 20 l. Cuando la sangre deja de coming cabo, suavemente transferir la sangre aspirado en un tubo.
- Para evitar la hemólisis, es crítico que el tubo con la sangre en ella ser manejado con mucho cuidado, sin ningún movimiento drástico hasta que se coloca en la centrifugadora.
- Para evitar la hemólisis, también es importante que la muestra de sangre se asegura en la centrífuga dentro de los 10 minutos de recogida de sangre.
- Si es necesario, es posible combinar la sangre de más de un animal, haciendo una piscina. Las muestras combinadas funcionará bien siempre y cuando la demora entre la recogida de sangre de los peces primero y centrifugación no exceda de 10 minutos.
- Cuando la recogida de sangre se hace, centrifugar la sangre durante 10 minutos a 0,5 g (centrífuga Eppendorf 5415D).
- Tras la centrifugación, el suero se presenta en la capa superior del tubo. Con una pipeta, aspire el suero, asegurándose de obtener sólo el suero, manteniendo las dos capas bien dividida y estable.
- Transferir el suero a un microtubo nuevo yestá listo para ser utilizado en los análisis bioquímicos. El suero puede ser almacenado en hielo mientras se espera para iniciar los análisis bioquímicos.
- Si el suero no se utiliza inmediatamente, se puede congelar a -18 ° C hasta aproximadamente 3 meses.
2. Los resultados representativos
Fue posible recoger 5 a 20 l de sangre entera de cada pez lo que representa la sangre incluso 4 veces más que las técnicas descritas previamente (Tabla 2). El análisis bioquímico del colesterol total, HDL-colesterol, LDL-colesterol y triglicéridos se realizaron después de la recogida de sangre utilizando esta técnica. Dos grupos de ambos sexos, los peces se mantuvieron en ayunas durante 24 horas antes de la extracción de sangre para evitar la interferencia de consumo de alimentos. Los análisis se realizaron con las pruebas a pequeña escala colorimétrica (Labtest Diagnóstica SA, Brasil) para los análisis de colesterol total y triglicéridos, 3 l de suero se utiliza. Para el colesterol LDL y HDL-colesterolanálisis, 4 l, y 10 l de suero se utilizaron, respectivamente. Estos análisis se realizaron en muestras combinadas de 10 pez cebra por muestra.
Los niveles séricos lipídicos fueron comparados entre los peces que se accede a sus propios huevos y los que, en un acuario de fondo cubierto, no tienen acceso a sus propios huevos durante un período experimental de 2 semanas. Análisis de suero mostraron que los niveles séricos de colesterol total (con huevos 362 ± 42 mg / dl y sin huevos 357 ± 13 mg / dl), HDL-colesterol (con huevos 91,22 ± 1,79 mg / dl y sin huevos 72,14 ± 2,89 mg / dl) y colesterol LDL (con huevos de 55,68 ± 10,88 mg / dl y sin huevos 44,18 ± 9,84 mg / dL) no difirió significativamente entre los grupos. Sin embargo, los niveles de triglicéridos fueron significativamente menores en el grupo experimental (sin huevos 292 ± 64 mg / dl) que en el grupo control (con huevos de 457 ± 25 mg / dL, p = 0,03).
| & Nbsp; | Con el acceso a los huevos | Sin acceso a los huevos |
| El colesterol total (mg / dL) | 362,82 ± 73,11 | 357,69 ± 23,08 |
| LDL - Colesterol (mg / dL) | 55,69 ± 18,84 | 44,19 ± 17,05 |
| HDL - Colesterol (mg / dL) | 91,23 ± 3,11 | 72,14 ± 5,01 |
| Los triglicéridos (mg / dl) | 457,64 ± 43,78 * | 292,36 ± 111,28 |
Tabla 1. Niveles séricos de colesterol y triglicéridos en ambos grupos estudiados (con acceso a los huevos y sin acceso a los huevos), expresado en media ± desviación estándar.
* Estadísticamente significativo (p = 0,03). Prueba t de Student.
| Aut. hors | Lugar de la incisión | Cosecha método | Anestesia | La cantidad de sangre recogida |
| Jagadeeswaran et. al., 1999 Murtha et al., 2003 | Posterior disección de las microempresas y las de la aleta dorsal | Micropipeta | No se menciona MS222 3% en agua fría | 1 un 5 l 5 un 10 l |
| Eames et al., 2010 | Decapitación | Micro capilares del tubo | MS222 0,02% 28 ° C del agua | 5 un 10 l |
| Estudio Actual | La incisión entre la aleta anal y la aleta caudal | Micropipetas y puntas de baja retención | De agua y pedazos de hielo | 5 un 20 l |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este trabajo presenta una técnica sencilla que permite a más análisis de sangre y suero en experimentos de pez cebra. Esta técnica tiene el potencial de contribuir a los estudios futuros de pez cebra hematológicas que requieren los datos de los parámetros sanguíneos. También debería permitir mayores aplicaciones del pez cebra como un modelo experimental.
Esta técnica no requiere habilidades especiales o la aplicación de una técnica precisa. Además, se permite hasta el doble de la cantidad de sangre que se recogió en relación con otras técnicas, permitiendo así el uso de menos peces para obtener la cantidad necesaria de material biológico. La técnica tiene un paso fundamental, que es que las muestras de sangre debe manejarse con cuidado ya que la sangre del pez cebra puede incurrir en la hemólisis con mucha facilidad. El retardo de tiempo entre la recogida de sangre y la centrifugación debe ser estrictamente limitado. Un límite de 10 minutos debe evitar la hemólisis. La velocidad y la duración de la centrifugación (0,5 g durante 10 minutos) should también ser seguido estrictamente.
Otras técnicas de recolección de sangre se intentaron antes de que esta técnica fue desarrollada. Sin embargo, el número de animales utilizados fue cantidades grandes y muy pequeñas de sangre se obtuvieron de cada pez. Esta nueva técnica permite el uso de menos animales, se demostró que era posible con los profesionales de baja cualificación de nivel, y le dio mejores resultados que otras técnicas en cuanto a la cantidad de sangre obtenida de cada uno de los peces.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
FIPE / HCPA - Fundo de Incentivo a Pesquisa e Eventos
CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nivel Superior
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low retention tips | Applied Biosystems | 022493020 | |
| Eppendorf Centrifuge 5415D | Eppendorf | Discontinued |
References
- Schneider, A. C. R., dos Santo, J. L., Porawski, M., Schaefer, P. G., Maurer, R. L., Matte, U., da Silveira, T. R. Implementação de um novo modelo de experimentação animal Zebrafish. Rev. HCPA. 29, 100-103 (2009).
- Briggs, J. P. The zebrafish: a new model organism for integrative physiology. Am. J. Physiol. Regulatory Integrative Comp. Physiol. 282, 3-9 (2002).
- Menke, A. L., Sptsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P. M., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of adult Zebrafish. Toxicologic Pathology. 000, 1-16 (2011).
- Murtha, J. M., Qi, W., Keller, E. T. Hematologic and serum biochemical values for Zebrafish. Comp. Med. 53, 37-41 (2003).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. Br. J. Haematol. 107, 731-738 (1999).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P.
- Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7, 205-213 (2010).
- Kilpatrick, E. S., Rumley, A. G., Rumley, C. N. The effect of haemolysis on blood glucose meter measurement. Diabet. Med. 12, 341-343 (1995).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (37), e1717 (2010).
- Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (42), e2126 (2010).
- Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L.
