Summary
Wij ontwikkelden een technologie op basis van silica mesoporeuze dunne film voor het selectief herstel van laagmoleculaire peptiden en eiwitten van humaan serum. De fysisch-chemische eigenschappen van onze mesoporeuze chips zijn volledig afgestemd op grote controle in peptide verrijking 'en derhalve profiel van de serum proteoom voor diagnostische doeleinden.
Abstract
De identificatie van circulerende biomarkers belangrijke mogelijkheden voor niet-invasieve benaderingen vroege diagnose en prognose, alsmede voor de bewaking van therapeutische efficiëntie. 1-3 Het circulerende laagmoleculaire proteoom (LMWP) bestaat uit kleine proteïnen werpen van weefsels en cellen of peptide fragmenten uit de proteolytische afbraak van grotere eiwitten geassocieerd met de pathologische toestand patiënten waarschijnlijk overeenstemming met de stand van de ziekte. 4,5 Ondanks deze potentiële klinische toepassingen, het gebruik van massaspectrometrie (MS) profiel van de LMWP van biologische vloeistoffen heeft bewezen zeer niet eenvoudig om groot dynamisch bereik van eiwitten en peptiden in serum. 6 Zonder monster voorbehandeling sommige van de meer voorkomende eiwitten verduisteren de detectie van lage overvloed species in serum / plasma. Current proteomics benaderingen zoals tweedimensionale polyacrylamidegel-electrophoresis (2D-PAGE) en shotgun proteomics methoden zijn arbeidsintensief, lage omzet en bieden beperkte geschiktheid voor klinische toepassingen. 7-9 Daarom is een meer effectieve strategie die nodig is om LMWP isoleren uit het bloed en de 'high throughput screening van klinische monsters laten .
Hier presenteren we een snelle, efficiënte en betrouwbare multi-fractionering op basis van mesoporeuze silica chips om specifiek te richten en te verrijken LMWP. 10,11 mesoporeuze silica (MPS) dunne films met afstelbare eigenschappen op nanoschaal werden vervaardigd met behulp van de triblokcopolymeer template pad . Met andere polymeer sjablonen en polymeerconcentraties in de precursoroplossing, werden verschillende poriegrootte verdelingen poriestructuren, verbindingen en oppervlakte-eigenschappen bepaald en toegepast voor selectief herstel van lage massa eiwitten. De selectieve ontleding van de verrijkte peptiden in verschillende subklassen volgens de fysisch-chemische eigenschappen zal enHance de efficiëntie van het herstel en de opsporing van lage overvloed soorten. In combinatie met massaspectrometrie en statistische analyse hebben we aangetoond dat de correlatie tussen de nanoschaal kenmerken van de mesoporeuze silica dunne films en de specificiteit en de doeltreffendheid van lage massa proteoom oogsten. De resultaten die hierin tonen het potentieel van de nanotechnologie gebaseerde technologie om een krachtig alternatief voor conventionele methoden voor LMWP oogsten bieden van complexe biologische vloeistoffen. Door de mogelijkheid om de eigenschappen van het materiaal af te stemmen, de mogelijkheid voor low-cost productie, de eenvoud en de snelheid van monstername en de sterk gereduceerde monster voor analyse, zal deze roman nanotechnologie aanzienlijk invloed hebben op het gebied van proteomics biomarker onderzoek en klinische proteomics beoordeling.
Protocol
1. Chip Fabrication
- Creëren bekledingsoplossing voor de chip gaat uit van het gehydrolyseerde silicaat precursoroplossing. Meng 14 ml tetraethylorthosilicaat (TEOS) met 17 ml ethanol, 6,5 ml gedeïoniseerd water en 0,5 ml 6M HCl onder sterk roeren (1200 rpm) met een roer verwarmingsplaat. Verwarm deze oplossing bij 80 ° C gedurende 2 uur, waarbij het roeren constant.
- Bereid polymeer oplossingen door de gewenste tri-blok coploymer (Pluronic F127, L121 en P123) aan 10 ml ethanol bij kamertemperatuur krachtig roeren. Vul het mengsel door toevoegen van 7,5 ml van het silicaat (uit stap 1.1) in de tri-blokcopolymeer oplossing gevolgd door 2 uur krachtig roeren bij kamertemperatuur. Dit is het laatste bekledingsoplossing.
- Breng 1 ml bekledingsoplossing tot 4 inch siliciumplak door spin-coating met een snelheid van 1500 rpm gedurende 20 seconden. Vervolgens warmte bij 80 ° C gedurende 12 uur.
- Verwarm de films naar biologische su te verwijderenrfactant door temperatuur 1 ° C per minuut tot 425 ° C en bakken gedurende 5 uur.
- Behandel de mesoporeuze silica (MPS) chip oppervlak met zuurstof plasma verassing (Plasma Asher - March Plasma System). (O 2 Capaciteit: 80 sccm, vermogen: 300 W, tijd: 10 minuten).
- Optioneel oppervlak chemische modificatie: silanate chips in 3% organosilaan een Methanol: DI water (19:1) oplossing gedurende 72 uur bij kamertemperatuur in een N2 handschoenkast. Spoel na elkaar met methanol en DI-water. Harden chips bij 110 ° C gedurende 15 minuten in een ventilator werkende oven.
2. Voorbeeld Voorbehandeling
- Voeg TFA en ACN elk serummonster zodanig dat de uiteindelijke concentratie 0,01% TFA en 5% ACN. Vortex om te mengen.
- Schudden deze monsters op een tafel vortex schudder bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
3. Serum Fractionering
- Pre-bak chips 's nachts in een oven bij 160 ° C. Als alternatief, opslage de chips in een exsiccator totdat u ze gaat gebruiken om hydratatie van het oppervlak te voorkomen door het omringende water in de lucht.
- Gebruik perslucht om stof deeltjes die op het oppervlak van de chip.
- Snijd prefab, gekocht CultureWell chambered dekglaasje om het gewenste aantal putten op te nemen. Schoon dekglaasje met 100% ethanol en vervolgens plaats op MPS-chip oppervlak. Druk op dekglaasje neer met een tang om een complete afdichting met chip te verzekeren.
- Pipetteer 10 ui van het serum te brengen in elk 3 mm goed. Gedurende 30 minuten in een bevochtigde kamer bij kamertemperatuur.
- Pipetteer up serum van putten en gooi ze weg. Pipetteer 10 pi gedeïoniseerd water aan elk putje wegwassen grotere eiwitten. Herhaal 4 keer.
- Pipetteer 5 pi elutiebuffer (0,1% TFA + 50% ACN) aan elk monster goed. Pipetteer op en neer 30 keer tijdens het verplaatsen van de pipetpunt rond in de put om de elutiebuffer mengen. (Alleen elutiebuffer toepassing 1-2 monsters tegelijk met elutiebuffer voorkomenverdampen zo snel).
- Na het mengen en pipetteer alle elutiebuffer en plaats in een microcentrifugebuis totdat u ze gaat MALDI-TOF-analyse uit te voeren.
- Om de complexiteit van een biologisch monster emuleren en verrijking effect evalueren oogsten laagmoleculaire onze on-chip fractionering systeem we geselecteerd en geassembleerd standaard mengsel van proteïnen en peptiden toe zesentwintig verschillende soorten met een brede reeks molecuulgewichten (900-66 500 Da) en PI (4.0 tot 10.2) en concentraties (0,5-8 pmol / pl) (zie eiwit lijst in tabel 1).
4. MALDI-TOF analyse van peptiden
- Spot 0,5 pi van monster tot MALDI richtplaat en laten drogen.
- Spot 0,5 pi matrix (α-cyano-4-hydroxycinnamic zuur (CHCA), 5 g / L) of verzadigde oplossing van trans-3 ,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic zuur (SA) in 50% acetonitrile met 0,1% TFA en laat co-kristallisatie. </ Li>
- Spot 0,5 pi van kalibratie-oplossing voor elke kalibratie plek en laten drogen.
- Plaats richtplaat in de MALDI-TOF massaspectrometer. De machine moet worden ingesteld op een positieve reflector mode met een laser intensiteit van 4200 en 3000 schoten per monster. De geselecteerde massabereik is 800 tot 5000 Da met een doel massa van 2000 Da zijn.
- Voer dezelfde MALDI-TOF-analyse in lineaire modus, maar veranderen de massa bereik tot 900 tot 10.000 Da of 3000 tot 70.000 Da en een doel massa van 5000 Da.
5. Data-analyse
- De ruwe spectra werden verwerkt met de ConvertPeakList software en de gegevens werden geëxporteerd naar software voor preprocessing SpecAlign. Alle spectra werden uitgelijnd met behulp van de PAFFT correlatie methode en intensiteiten werden genormaliseerd om de totale ionen stroom (TIC) in elke overeenkomstige spectrum. Alle spectra werden gladgestreken en de-ruchtbaar met een factor 4 en 0,5 respectievelijk. Pieken werden gedetecteerd met een uitgangswaarde van 0,5 massa venster 21 en hoogte-ratio 1,5, werden negatieve waarden verwijderd voor analyse.
- Hiërarchische clustering werd uitgevoerd met behulp van Cluster 3,0 en gevisualiseerd met MapleTree software. MALDI MS Data (m / z intensiteit van de piek) werd log-getransformeerd, genormaliseerd, en de mediane gecentreerd. Pearson correlatie gebruikt om de afstand tussen de monsters berekend en volledige koppeling clustering uitgevoerd.
- Een onafhankelijke Student T-test werd gebruikt voor vergelijking van groepen (n = 2 groepen) voor elke gedetecteerde piek MS voor ongecontroleerde hiërarchische clustering analyse. Een P-waarde van 0,02 of lager werd als significant beschouwd te differentieel geoogst peptiden en eiwitten kiezen uit de verschillende mesoporeuze proteomische chips (Grote poriën vs kleine poriën).
6. Representatieve resultaten
Zoals getoond in figuur 1, in dit onderzoek gefabriceerd een reeks mesoporeuze silica dunne films met verschillende nanotextures en uitgebreid onderzocht deir gebruik selectief vastleggen en verrijking LMW peptiden en eiwitten van humaan serum. Figuur 2a en b tonen de MS spectra van de onbewerkte serummonster peptiden in het traject van 900 tot 10.000 Da en eiwitten in het bereik van 3000 Da ~ 70000 respectievelijk . Deze spectra illustreren het signaal onderdrukking in de LMW regio vanwege de aanwezigheid van de geïoniseerde, zeer overvloedige hoog molecuulgewicht (HMW) eiwitten zoals albumine. Figuur 2c en d tonen de MS spectra van het serummonster na fractionering door MPS L121 (poriegrootte 6 nm). De meeste grote moleculen zijn uitgeput, waardoor een aanzienlijke verrijking van LMW componenten. Als controle werd dezelfde serummonster aangebracht op een poreuze zuivere silica oppervlak om de specificiteit van MPS dunne films LMWP herstel evalueren. Zoals in figuur 2e en f, was er geen significante oogsten van pepvloed of proteïnen uit de poreuze silica. Aldus kan worden geconcludeerd dat het de mesoporeuze architectuur niet silica oppervlak affiniteit dat de overhand vormt, in de verrijking van LMWP.
Nauwkeurig gecontroleerde variaties in poriegrootte kan worden bereikt door het gebruik van copolymeren met verschillende hydrofobe bloklengten. Door de ontworpen eiwitten en peptiden mengsel werd het effect van poriegrootte de LMW peptide en proteïne herstel werkzaamheid onderzocht met MPS dunne films vervaardigd uit vier Pluronic oppervlakteactieve (F127, P123, L121 en L121 plus zwelmiddel) met verschillende volumeverhoudingen van de hydrofiele en hydrofobe elementen te vormen respectievelijk poriegrootten van 3,7 nm, 5.2 nm, 7.4 nm, en 9.0 nm. Deze reeks poriegrootten tot het herstel van een andere repertoire van peptiden en eiwitten van dezelfde serummonster via grootte en vorm uitsluiting (figuur 3). Het eiwit spectra hoog molecuulgewicht demonstrate de moleculaire cut-off van elk type van de chip. Naast de grootte-afhankelijke uitputting van HMW proteïnen, de op de chip fractionering van de standaarden wordt een oplossing differentieel en selectieve verrijking van LMW soorten geassocieerd met de poriën. De tweezijdige hiërarchische clustering getoond in figuur 3b de LMW normen verrijking verkregen met de verschillende MSC. Zelfs indien de peptiden onder de moleculaire afkapwaarde van de chips, er een positieve correlatie tussen de poriegrootte en het molecuulgewicht van de gevangen soort. De MSC met grote poriën, tot 9 nm, bij voorkeur groter oogsten peptiden, terwijl de kleinere peptiden efficiënter gewonnen door de chips met kleinere poriën. De structurele transformatie van de mesoporeuze inrichting is uitgevoerd in door de concentratie van het sjabloon polymeer. De concentratie van de sjabloon polymeer tot een verminderde grensvlak kromming tussen de fasenvan het water, het copolymeer en het silicaat, zodat de inleiding van de onderling overgang van een bolvormig naar een cilindrische structuur. Pluronic F127, met hoog molecuulgewicht bezit deze hoge structurele periodiciteit. Door de concentratie van F127 in uitgangsoplossing kunnen verschillende MPS dunne film periodieke nanostructuren worden verkregen 3D nanostructuur naar 2D nanostructuur. De 3D kubieke en honingraat zeshoekige nanostructuren, die over een meer wenselijke nanogaatje interconnectiviteit en toegankelijker nanogaatje morfologie, vertonen superieure prestaties in selectief verrijken van LMW peptiden dan de 2D zeshoekige structuur, ook al zijn ze vergelijkbaar poriegrootte distributies en dezelfde moleculaire cut-off voor serum te delen fractionering (Figuur 4). We hebben ook gestroomlijnde de vervoeging van organo-silaan op MPS chips door de invoering van zuurstof plasma verassen op de chip oppervlak voorbehandelen. Met het oog op kwalitatief studie van de elektrostatisch effect op bepaaldeive on-chip verrijking, gebruiken we de eiwitten en peptiden mengsel. MS analyse van de proteomics normen oplossing gefractioneerd op MPS chips bereid met L121 en geconjugeerd met de chemische functionele groepen is weergegeven in figuur 5. De positief geladen en negatief geladen de peptiden en eiwitten LMW opgevangen op de anionogene en kationogene de chips respectievelijk. De kwantitatieve vergelijking van de verschillende MPS-chips bij het terugvinden van de peptiden met een positieve netto-lading wordt weergegeven in figuur 5a. De chips met negatieve lading en de chips zonder wijziging (een kleine negatieve lading oorspronkelijk) vertonen aanzienlijk hogere verrijking voor deze peptiden dan chips gemodificeerd met APTES (-NH2). Omgekeerd, de positief geladen MPS-chips beschikken over een uitzonderlijke mogelijkheid om die peptiden herstellen met negatieve netto-lading, zoals aangetoond in figuur 5b. Terwijl α-endorfine toont geen significante verandering due zijn PI ongeveer 6.
Figuur 1. Principe van MPS chips fractionering en LMW verrijking. Na monster vlekken aan het oppervlak worden LMW eiwitten en peptiden in de poriën ingesloten terwijl de grotere soorten steeds buiten de poriën en worden verwijderd tijdens de wasstappen. De verrijkte fracties worden vervolgens geëlueerd en geanalyseerd door MALDI.
Figuur 2. Peptide verrijking met behulp van de mesoporeuze silica dunne film chips. MALDI MS profielen in zowel de lage massa bereik (900 tot 10 000 Da) en de hoge massabereik (3000 tot 70 000 Da) vóór (a, b) en na (c, d) serum verwerking op mesoporeuze silica dunne films ( L121, 6 nm). De moleculaire herstel wordt aanzienlijk verminderd door het gebruik van lege niet-poreuze silica oppervlakken (e, f).
Figuur 3. Moleculaire cut-off en de grootte-afhankelijke verrijking van de MPS chips. (A) vergroot aanzicht van de MALDI spectra waaruit de karakteristieke moleculaire afkapwaarde van elk MPS chips correleren de poriëngrootte. (B) Twee-weg hiërarchische clustering van het peptide mix functies tussen de verschillende chips. De intensiteit van de rode en gele kleur geeft de relatieve peptide concentratie. Grote poriën versterkt het oogsten van grotere peptiden (3600 tot 8500 Da), terwijl de kleine peptiden (900 tot 3500 Da) werden voorkeur gewonnen uit de chips met kleinere poriën.
Figuur 4. Fysieke karakteriseringen van MPS dunne films en selectief herstel met verschillende nanostructuren. XRD patronen (a, b, c), TEM (inset a, b, c) Pluronic F127 bij verschillende concentraties in de precursoroplossing: 4,0 x10 3 M (a), 6,0 x 10 ~ 3 M (b) en 8,0 x 10 -2 M (c). (D) Bar grafiek van de intensiteit van detectie ter illustratie van de selectieve peptiden herstel op 3D kubieke en 3D zeshoekige F127 proteomische chips (Cub en Hex, respectievelijk). De verschillende structurele wijzigingen vormen een selectieve verrijking.
Figuur 5. Charge-specifieke herstel van de chips met verschillende oppervlakte functies. Staafdiagram van de MS intensiteit van detectie van selectief gevangen peptiden op het gefunctionaliseerde chips. Volgens de iso-elektrische punt, de peptiden positief of negatief geladen bij pH 7,0. (A) Positief peptiden ((1) des-Arg1-bradykinine, (2) bradykinine, (3) substance P-amide, (4) neurotensine, (5) ACTH (1-17), (6) ACTH (7 - 38)) zijn speciaal verrijkt de negatief geladen surgezichten. (B) Negatieve peptiden ((7) Glu1-fibrinopeptide B (8) α-endorfine, (9) ACTH (18-39) (10) insuline (11) EGF (12) insuline-achtige GFII) zijn specifiek verrijkt de positief geladen oppervlakken.
Figuur 6. On-chip stabilisatie van gefractioneerde serum. (A) Vertegenwoordiger MALDI profielen LMW peptiden en eiwitten geëlueerd onmiddellijk na serum fractionering (boven) en na 3 weken van on-chip opslag bij kamertemperatuur (onder). (B) Van boven naar beneden: Lineaire regressie-analyse van de gemiddelde intensiteiten van de gedetecteerde MS pieken in elke replicaatbak in vergelijking met 1 repliceren voor vers gefractioneerde serum en gefractioneerde serum na 3wk MPS chips opslag bij kamertemperatuur. Vergelijking, CV en determinatiecoëfficiënt (R 2) zijn aangegeven.
Discussion
Het bewijs is dat de montage van laag moleculair gewicht regio van de bloedsomloop proteoom is een rijke bron van diagnostische biomarkers voor de vroege opsporing van de ziekte. In deze technologie stelden wij een reeks mesoporeuze silica chips met verschillende poriën poriestructuren en wijzigingen selectief verrijken peptiden en laagmoleculaire eiwitten. Om eiwitstabiliteit evalueren, werden de MPS chips geïncubeerd met menselijk serum, gedroogd na wassen en opgeslagen 3wk bij kamertemperatuur. De verkregen eiwit / peptide patronen waren vergelijkbaar met die van verse gefractioneerde serum (figuur 6a), zoals blijkt uit de resultaten van de statistische analyse bleek in figuur 6b. De variabiliteit van de piek signalen gemeten aan de hand van de gemiddelde CV werd geschat op 12,7% voor ruwe serum en op 14.2% voor de gefractioneerde monsters. De marginale verschillen kunnen te wijten zijn aan de interne variabiliteit van de MALDI instrument en stelde voor dat de on-chip voorbehandeling en de bewaring veroorzaakte geen significante wijziging van de MS eiwitprofielen. Hetzelfde experiment werd uitgevoerd op niet-poreuze silicium. De gedroogde serum hersteld na opslag op silicium oppervlak werd gefractioneerd op de MPS chips, vooraleer MALDI-analyse. De arme MS profiel verkregen aangetoond dat de stabilisatie voordeel van de mesoporeuze oppervlak. In analogie met de eerder veronderstelde mechanismen, we veronderstellen dat de LMW soort gevangen in de nanoporiën werden bewaard tegen degradatie door de grootte uitsluiting van proteasen, of door sterische belemmering van hun proteolytische activiteit in de beperkte ruimte van de nanoporiën. De MPS-chip gebaseerde methode kan een krachtig instrument in de peptide en proteïne LMW profilering van complexe biologische vloeistoffen studie zijn. De MPS-chips zijn goedkoop te produceren en zorgen voor de productie opgeschaald tot de gelijktijdige verwerking van een groot aantal monsters te bereiken, het verstrekken van voordelige eigenschappen voor de experimentele screening en biomarker ontdekking.
Disclosures
Wij hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door Alliantie van nanogeneeskunde Pre-centrum Award (W81XWH-11-2-0168) en Texas Center for Cancer Nanomedicine (1U54CA151668-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tetraethoxysilane | Sigma-Aldrich | 131903 | 98% |
| Spin coater | Brewer Science, Inc. | Cee 200X | |
| Plasma Asher | Nordson March | AP-600 | |
| Spectroscopic Ellipsometer | J. A. Woollam Co. | M-2000DI | |
| MALDI-TOF | Applied Biosystems | Voyager-DE-STR | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma-Aldrich | C8982 | Matrix for MALDI-TOF |
| trans-3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid | Sigma-Aldrich | 85429 | Matrix for MALDI-TOF |
| Stir hot plate | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 11-475-30Q | |
| CultureWell chambered coverglass | Sigma-Aldrich | GBL103350 | 3 mm diam. ×1 mm depth, 3-10 μL, sterile |
| Pluronic F 127 | BASF | PEO106-PPO70-PEO106 | |
| Pluronic L121 | BASF | PEO5-PPO70-PEO5 | |
| Pluronic P123 | BASF | PEO20-PPO70-PEO20 | |
| Table 1. Physico-chemical properties and designed concentrations (Molecular weight and Iso-electric point) of the selected peptide and protein standards. | |||
References
- Wulfkuhle, J. D., Liotta, L. A., Petricoin, E. F. Proteomic applications for the early detection of cancer. Nat. Rev. Cancer. 3, 267-275 (2003).
- Etzioni, R. The case for early detection. Nat. Rev. Cancer. 3, 243-252 (2003).
- Hanash, S. M., Pitteri, S. J., Faca, V. M. Mining the plasma proteome for cancer biomarkers. Nature. 452, 571-579 (2008).
- Liotta, L. A., Ferrari, M., Petricoin, E.
- Petricoin, E. F., Belluco, C., Araujo, R. P., Liotta, L. A. The blood peptidome: a higher dimension of information content for cancer biomarker discovery. Nat. Rev. Cancer. 6, 961-967 (2006).
- Anderson, N. L., Anderson, N. G. The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects. Mol. Cell Proteomics. 1, 845-867 (2002).
- Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4, 3665-3685 (2004).
- Liu, H., Sadygov, R. G., Yates, J. R., 3rd, A model for random sampling and estimation of relative protein abundance in shotgun proteomics. Anal. Chem. 76, 4193-4201 (2004).
- Rabilloud, T. Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: old, old fashioned, but it still climbs up the mountains. Proteomics. 2, 3-10 (2002).
- Hu, Y. Tailoring of the nanotexture of mesoporous silica films and their functionalized derivatives for selectively harvesting low molecular weight protein. ACS Nano. 4, 439-451 (2010).
- Bouamrani, A. Mesoporous silica chips for selective enrichment and stabilization of low molecular weight proteome. Proteomics. 10, 496-505 (2010).
