Summary
Un outil utile pour analyser les effets des drogues, des facteurs de croissance et / ou des cellules manipulées dans un modèle animal de la cicatrisation des plaies est décrite. Cette technique utilise les propriétés d'un alcool de polyvinyle (PVA) éponge à livrer et contiennent le traitement désiré et également fournir une plate-forme d'être excisée et analysées.
Abstract
La cicatrisation des plaies est un processus compliqué, en plusieurs étapes impliquant de nombreux types cellulaires, les facteurs de croissance et des composés 1-3. En raison de cette complexité, les études de cicatrisation sont le plus complet lorsqu'il est effectué in vivo. Il ya beaucoup de modèles in vivo disponibles pour étudier la cicatrisation des plaies aiguës, y compris l'incision, excision, l'espace mort, et des brûlures. Modèles de Dead Space sont artificiels, implants poreux qui sont utilisées pour étudier la formation des tissus et les effets des substances sur la plaie. Certains des modèles couramment utilisés espace morts comprennent l'alcool polyvinylique (PVA) éponges, Bouteilles en acier treillis métallique, le polytétrafluoroéthylène expansé (ePTFE) le matériel, et le 1,2 Cellstick.
Chaque modèle espace mort a ses propres limites basées sur la composition de son matériau et l'implantation des méthodes. Le fil d'acier cylindre maillage du modèle dispose d'une phase de latence de l'infiltration après l'implantation et nécessite une quantité de temps de temps avant la formation de tissu de granulation bëgins 1. Les stades ultérieurs de la cicatrisation des plaies sont mieux analysés en utilisant les modèles de 1,4 ePTFE. Le Cellstick est une éponge de cellulose dans un modèle de tube de silicium qui est généralement utilisé pour l'étude des plaies de chirurgie de l'homme et enroulé de fluides 2. L'éponge PVA est limité à des études de courte durée car avec le temps, il commence à provoquer une réaction au corps étranger qui provoque une réaction à cellules géantes chez l'animal 5. Contrairement à d'autres matériaux, les éponges PVA sont faciles à insérer et à retirer, faites de matériaux inertes et non-biodégradables et qui pourtant sont assez doux pour être sectionnée pour l'analyse histologique 2,5.
Dans la cicatrisation des plaies de l'éponge PVA est très utile pour analyser la formation de tissu de granulation, le dépôt de collagène, de la composition fluide de la plaie, et les effets des substances sur le processus de guérison 1,2,5. En plus de son utilisation dans l'étude d'un large éventail d'attributs de la cicatrisation des plaies, l'éponge PVA a également été utilisé dans de nombreux autres types d'études. Il hcomme cela a été utilisé pour étudier l'angiogenèse tumorale, l'administration de médicaments et de la survie des cellules souches et la prise de greffe 1,2,6,7. Avec son altérabilité grande, l'utilisation antérieure vaste, et des résultats reproductibles, l'éponge PVA est un modèle idéal pour de nombreuses études 1,2.
Ici, nous allons décrire la préparation, l'implantation et la récupération de disques éponge PVA (Figure 1) dans un modèle murin de la cicatrisation des plaies.
Protocol
1. Préparation éponge
- Éponges hydrate par une nuit d'agitation dans 0,9% (p / v) une solution aqueuse de chlorure de sodium.
- Stériliser les éponges hydratés par eux autoclave. Pour 75 ml, dans un autoclave pendant 25 minutes à 121 ° C.
Remarque: les éponges de chargement avec un traitement tel que décrit ci-dessous est facultative.
- Dans une hotte stérile avec des instruments stériles, ramasser une éponge de la solution en utilisant une pince à épiler. Pressez l'éponge avec les pincettes et utiliser un embout aspirateur pour enlever la solution autant que possible de l'éponge. Placez le essoré l'éponge dans une boîte de culture de tissu, en prenant soin de laisser un espace entre les éponges. Plusieurs plaques à puits peut être utilisé pour séparer les différents traitements.
- Pipeter la solution de traitement directement sur le centre d'une éponge. Appuyez doucement sur l'éponge avec la pointe de pipette après que la solution a été placé sur l'éponge, ce qui aide l'éponge absorber la solution. Remarque: Le 6mmdiamètre par 2,75 mm d'épaisseur éponges que nous employons sont en mesure de contenir un maximum de 25 pi.
- Une fois toutes les éponges sont chargés, la plaque, ils sont en peuvent être stockés sur de la glace jusqu'à ce qu'ils soient implantés dans la souris.
2. Procédure chirurgicale
- Appropriée anesthésier des animaux et administrer préventive analgésique. Toute la procédure va durer environ 20 minutes par animal. Pour un 30 g de souris de 1,5 litres par minute d'oxygène avec 1,5% d'isoflurane est utilisé pour induire et maintenir une anesthésie. Lorsque des animaux ne sont plus réceptifs à l'épreuve réflexe pincée, le lieu dans le cône du nez en position couchée. Utilisation d'un rasoir électrique rasage 1 pouce par une po une zone sur le côté inférieur ventrale sous la cage thoracique. Essuyez de coupe de cheveux.
- Stériliser la zone rasée par un nettoyage à la bétadine suivie par l'alcool à 70%. Répéter ce nettoyage bétadine-alcool à trois reprises.
- Tout en maintenant la peau a enseigné, utiliser le scalpel pour faire une incision verticale de 1,5-2 fois le diamètres des éponges à insérer, étant prudent pour ne pas couper à travers la cavité du corps.
- Utilisez une pince à épiler à maintenir le bord de la peau et commence lentement séparer la peau du muscle des deux côtés de l'incision avec des ciseaux Metzembaum. La poche doit aller sur la largeur de la souris et de la cage thoracique aux pattes postérieures.
- Utilisez une pince à épiler pour ramasser l'éponge premier à être placé dans l'animal en le pinçant sur les côtés. Transfert de l'éponge à une pince à épiler droite, de sorte qu'il est détenu par le haut et le bas.
- Utilisation des pinces pour tenir le bord de la peau et la soulever de telle sorte que l'éponge peut être inséré. Introduisez doucement l'éponge en essayant d'éviter de toucher la peau ou le muscle en dessous, comme l'éponge sera difficile de se déplacer une fois qu'il a touché le tissu. Répétez l'opération pour toutes les éponges.
- Une fois toutes les éponges ont été insérés, placez deux ou trois points de suture pour fermer l'incision. Utilisez une paire de pince à épiler pour tenir les deux côtés de l'incision ensemble et enfiler le Suture à travers les deux couches de la peau. Serrer le premier lancer, juste assez pour fermer les bords de la peau. Terminer le noeud carré avec un plus jeter dans l'autre sens, cette fois en tirant le nœud serré. Ensuite, attachez deux noeuds plus carrés à la fin de la suture (Figure 2). Placez sutures supplémentaires pour refermer l'incision ensemble. Autres méthodes de collage des plaies peuvent être utilisés tels que DERMABOND, clips plaies, ou des agrafes.
- Retirer l'animal du système d'anesthésie et surveiller tandis que la conscience est repris. Animaux devraient rapidement commencer ambulantes et revenir à la mobilité pré-opératoire. Assurez-vous que ils sont capables de suffisamment atteindre la nourriture et l'eau. De la nourriture peut être humidifié disposé dans le fond de la cage pour aider à la récupération. Continuer à surveiller les animaux tous les jours pour des signes de détresse ou d'inconfort, et vérifier le site de l'incision de l'infection, l'inflammation, et la déhiscence. Prendre des mesures appropriées si des complications à la récupération se trouvent.
3. Injection en option
- Pour injecter l'éponge avec une solution voulue, d'abord déterminer la quantité de la substance à administrer à la souris. La substance doit être concentrées de façon que le volume d'injection est inférieure à la moitié du volume total de l'éponge peut contenir.
- Préparer une seringue pour l'injection (pour les souris que nous utilisons une aiguille 28 G).
- Placez l'animal à recevoir les injections sous anesthésie.
- Lorsque l'animal ne répond plus à l'épreuve pincée l'injection peut être donnée.
- Pour donner l'injection pousser l'aiguille à un angle de 45 ° approfondie de la peau au centre de l'éponge. Ensuite, poussez l'aiguille dans l'éponge ne va à mi-cheminà travers son épaisseur. L'objectif est d'injecter dans le centre exact de l'éponge.
- Pour vérifiez que l'aiguille est dans l'éponge, soulevez lentement l'aiguille à la verticale. Si l'aiguille est dans l'éponge, l'éponge doit se déplacer avec l'aiguille.
- Injecter lentement dans l'éponge et retirer l'aiguille. Si il ya des éponges nécessitant des injections multiples, il est possible que certains d'entre le fluide injecté sera poussé hors des sites d'injection précédents.
4. Retrait de l'éponge
Remarque: Lors de la retrait de l'éponge, gérer l'éponge avec des précautions supplémentaires. Éviter de pénétrer dans l'éponge avec les instruments chirurgicaux et d'éviter un saignement excessif dans l'éponge en évitant les grandes artères autour du tissu environnant.
- Après que l'animal est euthanasié, retirez l'éponge en maintenant la peau à l'aide une pince à épiler et à faire une incision à proximité de l'éponge.
- Soigneusement séparer les éponges de la capsule entourant un e éviter de récolter des tissus supplémentaires entourant l'éponge. Pour les tests tels que la livraison de drogue ou la morphométrie, moins de précision est requise pour l'excision.
5. Les résultats représentatifs
Éponges supprimés peuvent être stockés dans des conditions différentes selon le type d'analyse qui sera effectuée. Pour la coupe, les éponges récupérés peuvent être intégrés dans un milieu pour la congélation comme la température de coupe optimale (PTOM) composé ou placés dans du formol 10% pour l'intégration et la coupe de blocs de paraffine (figure 3A et B). Meilleurs résultats pour la coupe sont obtenus lorsque l'éponge est coupé en deux dans le diamètre et la surface de coupe intégré vers le bas (figure 4A et B). Les articles de l'éponge doivent être prises afin que toute la largeur de l'éponge est présent. Figure 3A montre deux éponges, l'éponge à gauche a été incorporé / sectionné de manière incorrecte et l'éponge à droite a été traitée correctement.
ent "> Pour l'analyse, les éponges peuvent être placées dans un tube Eppendorf et stockés à -20 ° C jusqu'au moment du traitement de l'ARN et quantitatifs réels éponges analyse PCR en temps doivent être placés dans un tube Eppendorf, flash congelés et stockés à. - 80 ° C. En outre, un agent de conservation d'ARN, tels que le RNAlater de QIAGEN, peut être utilisé pour stabiliser les ARN pour le stockage en toute sécurité à des températures élevées. fluide de la plaie peuvent être collectées en serrant les éponges sur un tube, et mise en commun du fluide à partir éponges multiples pour obtenir un échantillon représentatif. des cellules vivantes, telles que des fibroblastes, les macrophages et les lymphocytes, peuvent également être extraites des éponges. Après le retrait de l'animal, éponges peut être placé dans un milieu approprié pour le type de cellules souhaitée. éponges peuvent traiter pour libérer les cellules par physiques (c.-à-hachage) ou enzymatique (c.-à-collagènase) méthodes.
Figure 1. Déshydratationted PVA disques éponge en trois tailles différentes.
Figure 2. Image de la souris modèle de cicatrisation de la plaie montrant la position latérale et quatre éponges PVA.
Figure 3. (A) H & E coloration en 4x et (B) coloration trichrome à 10x d'éponges de paraffine sectionnés embarqués.
Figure 4. (A) Image de la coupe éponge dans la moitié le long du diamètre. (B) PVA éponge moitié, côté coupé vers le bas intégré en oct.
Discussion
Disclosures
Nous n'avons rien à communiquer.
Acknowledgments
Le financement fourni par les National Institutes of Health (NIH) de subvention R01-HL088424; attribution aux anciens combattants mérite affaires à PPY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PVA Sponge | Medtronic Inc. | CF120 | The size and porosity of the sponge depends on the experiment |
| Scalpel blade size 15 | BD Biosciences | 371115 | |
| Metzembaum scissors | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 79-211 | |
| Hemostat Forceps | Fine Science Tools | 13004-14 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12004-16 | |
| 5-0 nylon suture | Ethicon Inc. | 698 | |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 |
References
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