Summary
Полезный инструмент для анализа эффектов лекарств, факторы роста и / или манипулировать клетками в животной модели заживления ран описан. Эта техника использует свойства поливинилового спирта (ПВС), губка для доставки и содержат желаемого лечения, а также предоставит возможность быть изъяты и проанализированы.
Abstract
Заживление ран представляет собой сложный, многоступенчатый процесс с участием многих типов клеток, факторы роста и соединений 1-3. В связи с этим сложности, исследования заживления ран являются наиболее полным, если они осуществляются в естественных условиях. Есть много в естественных моделей для изучения острых заживления ран, в том числе разреза, иссечение, мертвое пространство, и ожогов. Мертвое пространство модели являются искусственными, пористые имплантаты, которые используются для изучения формирования тканей и влияния веществ на рану. Некоторые из наиболее часто используемых моделей мертвые пространства включают поливинилового спирта (ПВС), губки, стальных баллонов сетки, расширенные политетрафторэтилена (ПТФЭ) материала, а Cellstick 1,2.
Каждый мертвый модель пространства имеет свои ограничения, основанные на состав ее материала и внедрение методов. Сетка стальная проволока цилиндр модель имеет лаг-фазы инфильтрации после имплантации и требует длительного периода времени до формирования грануляционной ткани бегинс 1. Поздние стадии заживления ран лучше всего анализировались с помощью 1,4 ПТФЭ модели. Cellstick является целлюлозной губкой внутри модели кремния трубки, которая обычно используется для изучения человеческих ран хирургии и ранить жидкости 2. PVA губка ограничивается исследований острой, потому что со временем это начинает вызывать иностранных ответ тела, которое приводит к гигантским реакция клетки у животных 5. В отличие от других материалов, PVA губка легко вставлять и вынимать, изготовленные из инертной и не поддающихся биохимическому разложению материалов и вместе с тем являются достаточно мягким, чтобы быть секционного для гистологического анализа 2,5.
В заживления ран PVA губка очень полезна для анализа формирования грануляционной ткани, коллагена, состав раны жидкости, а также влияние этих веществ на процесс заживления 1,2,5. В дополнение к использованию в изучении широкого круга признаков заживления ран, губки PVA также используется во многих других видах исследований. Это чкак были использованы для исследования опухолевого ангиогенеза, доставки лекарств и стволовых клеток и выживание приживления 1,2,6,7. Имея большой изменчивость, до широкого применения, и воспроизводимые результаты, PVA губка является идеальным примером для многих 1,2 исследованиях.
Здесь мы опишем подготовки, внедрения и извлечения дисков губкой ПВА (рис. 1) в мышиной модели заживления раны.
Protocol
1. Губка подготовка
- Сода губки путем перемешивания в течение ночи в 0,9% (вес / объем) водным раствором хлорида натрия.
- Стерилизовать гидратированных губки в автоклаве них. За 75 мл, автоклав в течение 25 минут при температуре 121 ° C.
Примечание: Загрузка губки с лечением, как описано ниже, не является обязательным.
- В стерильных капот с стерильных инструментов, выберите один из губки решения с помощью пинцета. Сожмите губкой с пинцетом и использовать вакуумную кончик удалить как можно больше решений, как можно с губкой. Поместите отжатой губкой в чашке культуру ткани, будьте осторожны, чтобы оставить пространство между губками. Несколько пластин и может быть использовано для разделения различных методов лечения.
- Пипетировать лечение решение непосредственно на центр губкой. Нажмите мягко на губку с пипетки после решения был сделан на губку, это помогает поглощать губка решения. Примечание: 6ммдиаметр на 2,75 мм толщиной губки, которые мы используем в состоянии удерживать более 25 мкл.
- После того как все губки были загружены, пластины они в могут быть сохранены на льду, пока не будут имплантированы в мышей.
2. Хирургические процедуры
- Соответственно обезболивания животных и управлять упреждающий анальгетик. Вся процедура длится около 20 минут на одно животное. Для 30 г мышь 1,5 литра в минуту кислорода с 1,5% Изофлюран используется, чтобы вызвать и поддержания анестезии. Когда животное не реагирует на тест щепотку рефлекс, место в носовой конус в положении лежа. Используйте электрическую бритву для бритья 1 дюйма на 1 дюйм площади на нижней брюшной стороне ниже грудной клетки. Протирать среза волос.
- Стерилизовать побрился области по очистке бетадин затем 70% спиртом. Повторите эту бетадин алкоголя чистки в три раза.
- Удерживая кожу учил использовать скальпель, чтобы сделать вертикальный разрез в 1,5-2 раза диаметрметр губки должны быть вставлены, быть осторожным, чтобы не прорезать полости тела.
- Используйте пинцет, чтобы удерживать края кожи и медленно начать разделение кожу от мышц с обеих сторон разреза использованием Metzembaum ножницами. Кармана должны идти по всей ширине мыши и из грудной клетки, чтобы задние лапы.
- Используйте пинцет, чтобы забрать первую губку, чтобы быть помещены в животное, зажимая его из сторон. Передача губки прямо пинцетом так, чтобы она проходила с верхней и нижней.
- Используйте пинцет, чтобы удерживать края кожи и снять ее так, чтобы губки могут быть вставлены. Медленно вставьте губка пытается избежать прикосновения к коже или под мышцу, как губка, будет трудно двигаться, когда она коснулась ткани. Повторите эти действия для всех губок.
- После того как все губки были вставлены, за два или три швов, чтобы закрыть разрез. Используйте пинцет, чтобы удерживать обе стороны от разреза вместе и закрутите Сутуповторно через оба слоя кожи. Затяните первый бросок достаточно, чтобы закрыть кожу края. Закончить квадратный узел с одного броска с другой стороны, на этот раз потянув плотный узел. Затем связать два квадратных узла для завершения шва (рис. 2). Установите дополнительный швов, чтобы закрыть весь разрез. Другие способы связи раны могут быть использованы такие как dermabond, рана клипов, или скоб.
- Удаление животного из наркоза и мониторинг системы в то время как сознание возобновляется. Животные должны быстро начать ambulating и вернуться к заранее оп мобильности. Убедитесь, что они способны достигать достаточно пищи и воды. Некоторые смоченной пищи могут быть помещены в нижней части клетки для оказания помощи в восстановлении. Продолжайте следить за животным ежедневно в течение признаки бедствия или дискомфорт, и проверить разреза инфекции, воспаления, и зияние. Принимать необходимые меры, если никаких осложнений для восстановления найдено.
3. Дополнительная инъекция
- Чтобы придать губкой с искомым решением, в первую очередь определить количество вещества для управления с помощью мыши. Вещество должно быть сосредоточено, так что инъекции объем составляет менее половины от общего объема губка может иметь места.
- Подготовить шприц для инъекций (для мышей, мы используем 28 G иглой).
- Поместите животное получает инъекции под наркозом.
- Когда животное не реагирует на щепотку теста инъекции могут быть предоставлены.
- Чтобы подтолкнуть инъекции иглу под углом 45 ° тщательного кожи в центре губкой. Затем нажмите на иглу в губку только собирается на полпутипо толщине. Цель состоит в том, чтобы вводить в точном центре губкой.
- Чтобы проверить, чтобы убедиться, что игла находится в губки, медленно поднимите иглу вертикально. Если стрелка находится в губки, губки должны двигаться с иглы.
- Медленно введите в губку и удалить иглу. При наличии нескольких губки требуют инъекций, возможно, что некоторые вводят жидкость будет выталкиваться из предыдущих участках инъекций.
4. Губка удаление
Примечание: Во время удаления губки, справиться с губкой с дополнительной осторожностью. Избегайте проникновения в губку с хирургическими инструментами и предотвратить чрезмерное кровотечение в губку, избегая крупных артерий вокруг окружающие ткани.
- После того, как животное усыпляют, удалить губкой, удерживая кожу с помощью пинцета и делая надрез закрыть губкой.
- Аккуратно отделить губки от окружающих капсулу й избежать сбора дополнительных тканей, окружающих губкой. Для тестов, таких как доставка лекарств или морфометрии, меньшую точность требуется для удаления.
5. Представитель Результаты
Удаленные губки могут быть сохранены в различных условиях в зависимости от типа анализа, который будет выполняться. Для секционирования, полученного губки могут быть внедрены в среде для замораживания таких как оптимальная температура резки (ОКТ), соединения или помещены в 10% растворе формалина для встраивания и секционирования в парафиновых блоков (рис. 3А, Б). Наилучшие результаты для резки получаются, когда губка пополам по диаметру и встроенные сократить поверхностью вниз (рис. 4А, Б). Разделы губки должны быть приняты, так что всю ширину губка присутствует. 3А показаны две губки, левая губка была заложена / секционного неправильно и право губка была обработана правильно.
ЛОР "> Для анализа, губки могут быть помещены в пробирку Эппендорфа и хранили при -20 ° C до готовности для обработки РНК и количественных реальных губок время ПЦР-анализа должны быть помещены в пробирку Эппендорфа, заморозки и хранить в. - 80 ° C. Кроме того, консервант РНК, такие как RNAlater от QIAGEN, могут быть использованы для стабилизации РНК для безопасного хранения при более высокой температуре. ран жидкость может быть собрана, сжимая губками на трубе, и объединение вместе с жидкостью несколько губки для получения репрезентативной выборки. живые клетки, такие как фибробласты, макрофаги и лимфоциты, также могут быть извлечены из губки. После удаления из животных, губки может быть места в соответствующих средствах массовой информации для нужного типа клеток. Губки может обрабатываться, чтобы освободить клетки физических (т.е. измельчение) или ферментативного (например, коллагеназы) методов.
Рисунок 1. ОбезвоживанияТед PVA губка дисков в трех различных размерах.
Рисунок 2. Изображение мыши ранозаживляющим модель, показывающая положение боковых раны и четыре PVA губки.
Рисунок 3. (A), H & E окрашивания на скорости 4х и (B) трехцветного окрашивания в 10х из секционного парафин губки.
Рисунок 4. () Изображение губка разрезать пополам вдоль диаметра. (B) PVA губка 1/2, встроенный разрезанной стороной вниз в октябре
Discussion
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Финансирование предоставляется на Национальных Институтов Здоровья (NIH) грант R01-HL088424; по делам ветеранов заслуги наградой PPy.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PVA Sponge | Medtronic Inc. | CF120 | The size and porosity of the sponge depends on the experiment |
| Scalpel blade size 15 | BD Biosciences | 371115 | |
| Metzembaum scissors | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 79-211 | |
| Hemostat Forceps | Fine Science Tools | 13004-14 | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12004-16 | |
| 5-0 nylon suture | Ethicon Inc. | 698 | |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 |
References
- Efron, D. T., Barbul, A.
- Gottrup, F., Agren, M. S., Karlsmark, T. Models for use in wound healing research: a survey focusing on in vitro and in vivo adult soft tissue. Wound Repair. 8, 83-96 (2000).
- Sprugel, K. H., McPherson, J. M., Clowes, A. W., Ross, R. Effects of growth factors in vivo. I. Cell ingrowth into porous subcutaneous chambers. Am. J. Pathol. 129, 601-613 (1987).
- Alaish, S. M. Comparison of the polyvinyl alcohol sponge and expanded polytetrafluoroethylene subcutaneous implants as models to evaluate wound healing potential in human beings. Wound Repair. 3, 292-298 (1995).
- Davidson, J. M. Animal models for wound repair. Arch. Dermatol. Res. 290, 1-11 (1998).
- Alfaro, M. P. sFRP2 suppression of bone morphogenic protein (BMP) and Wnt signaling mediates mesenchymal stem cell (MSC) self-renewal promoting engraftment and myocardial repair. J. Biol. Chem. 285, 35645-35653 (2010).
- Andrade, S. P., Ferreira, M. A. The sponge implant model of angiogenesis. Methods Mol. Biol. 467, 295-304 (2009).
- Diegelmann, R. F., Lindblad, W. J., Cohen, I. K. A subcutaneous implant for wound healing studies in humans. J. Surg. Res. 40, 229-237 (1986).
- Efron, D. T., Most, D., Shi, H. P., Tantry, U. S., Barbul, A. A novel method of studying wound healing. J. Surg. Res. 98, 16-20 (2001).
- Lindblad, W. J. Considerations for selecting the correct animal model for dermal wound-healing studies. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 19, 1087-1096 (2008).
