Summary
Cerrahi travma inflamatuvar yanıt indükler. Sitokinler ve endojen ligand iskemi ve reperfüzyon sonrası miyokard infarkt modüle bilinmektedir. Biz torakotomi etkilerini en aza indirmek için asılı ağırlıklar kullanılarak murin iskemi ve reperfüzyon değiştirilmiş bir kapalı göğüs modeli sunuyoruz.
Abstract
Koroner ligasyon açık göğüs modellerinde torakotomi ile cerrahi travma ve iskemi reperfüzyon yer alan farklı mekanizmalar değiştiren bir bağışıklık yanıtı indükler. İmmün yanıt sitokin salınımını ve immün reseptörlerin endojen ligand serbest bırakılması veya salgı içerir. Doğal bağışıklığın aktivasyonu potansiyel infarkt modüle olabilir. Biz miyokard öncesi ve postconditioning ve iskemi ve reperfüzyon sırasında bağışıklık rolünü incelemek için yararlı olabilir asılı ağırlıklar kullanarak mevcut bir fare kapalı göğüs modeli değiştirdiniz. Bu model hayvan miyokard iskemi başlangıcından önce cerrahi travma gelen geri verir.
Uçucu anestezikler yoğun olarak çalışılmış ve iskemik kalp için kendi önkoşullaması etkisi iyi bilinmektedir. Ancak, bu koruyucu etkisi koroner arter ligasyonu açık göğüs modellerinde kullanımını engellemektedir. Bu nedenle, bir başka avantajı th kullanılması olabilirKronik bir kapalı göğüs model araçları için e iyi kontrol edilebilen uçucu anesteziklerin, kendi önkoşullaması etkisi 72 saat kadar sürer bu yana. Intermitan iskemi ve birden fazla hit modelleri ile kronik kalp hastalıkları bu modelin diğer olası uygulamaları vardır.
Kronik kapalı göğüs modeli için, entübe ve havalandırılmış fareler 4. interkostal üzeri yanal künt torakotomiye. Bir ligatür sol ön inen ve ardından kimlik geminin altına geçirilir ve her iki sütür ucu bir oklüder ile diziliyor. Ondan sonra iki sütür ucu bir döngü oluşturmak için düğümlenmiş göğüs duvarının üzerinden geçen ve deri altı doku kalır. Göğüs kapatılması ve 5 gün boyunca kurtarma sonra, fareler tekrar anestezi, göğüs deri tekrar açılır ve asılı ağırlıklar EKG kontrolü altında döngü bağladım edilir.
Iskemi / reperfüzyon protokolünün sonunda, kalp enfarktüsü için TTC ile boyanmış edilebilirboyutu değerlendirmesi veya histoloji ve immünhistokimya yanında morfometrik çalışmaların izin perfüzyon fiksasyon uğrarlar.
Protocol
1. Anestezi indüksiyonu
- Izofluran ile indüksiyon için, Vol 3.0 ve% 0.5 L / dk oksijen akışına buhar seti bağlı bir endüksiyon kutusuna fare koyun.
- Bilinçsizlik bir tepki ve devamsızlık veya arka ayakların ön ayaklardan pedalı geri çekme refleksi neden başarısız dokunsal uyaran ile elde edilir sonra, yatar pozisyonda sıcaklık kontrollü bir ameliyat masasında fare yerleştirin. Indüksiyon kutusu üzerinden buhar bağlı bir burun konisi üzerinde anestezi koruyun. Entübasyonu kolaylaştırmak için bir 5-0 naylon sütür ile üst ön dişler sabitleyerek kafa yatırabilir.
- 37 vücut çekirdek sıcaklığını korumak için rektal ısı probu yerleştirin ° C Bant ile ekstremite Fix. Sol göğüs açmak ve daha iyi kalp duyurmak için sağ bacak üzerinde sol alt bacak çapraz.
- Boyun ve sol göğüs için tüy dökücü krem uygulayın. 1 dakika sonra krem silin. Lokal deri için povidon-iyot uygulayındezenfeksiyon. Subkutan ağrı kesici buprenorfin 0.05 mg / kg vücut ağırlığı enjekte edilir.
- Küçük bir makas ile bir orta hat boyun cilt kesisi olun. Trakea kapağı bezleri ve kasları disseke künt. Vantilatör açın. Ventilatör ayarları fizyolojik parametreler ayarlanmalıdır. Biz Minivent, Hugo Sachs Elektronik, 105/min bir solunum hızı ile Harvard Apparatus ve 200 ul bir soluk hacmi kullanın. Bir forseps ile dil çekin ve bir 22 G metal tüp takın. Trakea ve göğüs hareketi içindeki tüp direkt görüntülenmesini tarafından entübasyon onaylayın.
- Laboratuvar alanı bulaşmasını önlemek için gaz boru atık geçerek indüksiyon kutusunu atlamak. 2.0 Vol% için buhar ayarlayın.
2. Torakotomi
- Sol köprücük kemiği çizgisinde bir cilt kesisi olun. Aksilla doğru deri altı dokusu diseke künt. Başlıca pektoralis kas sınır belirleme ve küçük p onu teşrih küntectoralis kas altında. Sağ pektoralis minör kas çekin. Bu göğüs kafesinin doğrudan bir görünüm kazanacaktır.
- Belirleme ve dobra dobra bir forseps ile 4'ncü interkostal pentetrate. Forseps ipuçları kendinizi ameliyat masasında bağlı lastik bantlar ile ayarlanır retraktörler eklemek için izin interkostal yayılan edelim. Sol kulak dahil kalbi net bir görüş açısına sahip olmalıdır. Bu erişim genellikle elektrik koagülasyon gerek kalmadan böylece herhangi bir kan kaybı olmadan elde edilmesini.
3. Kalp hazırlanması
- Yavaşça kalp zarar vermeden perikard çekin.
- Sol ventrikül ön duvar sol atriyal kulak off kaldırarak sol ön inen arter (LAD) tanımlayın. LAD sadece bulanık sınırlar ve damarlar ile karşılaştırıldığında parlak kırmızı renk ile kısa bir düz boyunca görülecektir.
4. Koroner ArterAletler
- U şeklinde içine oluşturarak konik bir iğne ucu ile 8-0 prolen sütür hazırlayın. LAD altında yeterince derin miyokard yoluyla iğne geçirin.
- Her tarafında sütür 1 cm olması dikiş iğnesi sonu kesin.
- Herhangi bir keskin köşeleri engelleyen bir oklüder olarak 1 mm PE-10 tüp bölümü kesti. . Tıkayıcı alkollü Dezenfeksiyon ıslattı ve kullanım Not önce dışarı dokunun izin verin: boru uygun 4 sterilize için 24 saat% 100 etanol içinde iliklerine edilmelidir.
- Konu sütür hem tıkayıcı yoluyla sona erer.
- Her iki dikiş üst interkostal dışarı biter yol gösterecek bir boyutu 3 Kalt dikiş iğnesi kullanın.
5.. Göğüs Kapanış
- Bir 6-0 prolen dikiş ile birlikte açılmış interkostal boşluğun üst ve alt ribana tie. Eğer göğüs kapatın önce 5.2 geçmek gerekir.
- Açmak için bir kaç solunum devir için akciğerler Hyperinflateekspiratuar tüp sıkma tarafından atelektazi. Bu manevra, kullandığınız ventilatör türüne göre farklılık gösterebilir. Göğüs kapanıncaya kadar tidal hacmi 300 ul olarak ayarlayın.
- Ventilatör tidal volüm geri 200 ul olarak ayarlayın.
- Onları bir döngü oluşturmak için 8-0 LAD ligasyonu sütür her iki ucuna bağlayın.
- EKG takın.
- 8-0 döngü ağırlıkları bağlayın ve ağırlıkları dikkatle durmasını sağlayın. Birkaç kalp atışları içinde ST yükselmesi önemli bir görmelisiniz. . Ağırlıkları Not serbest: Bu deneyler, ağırlıkça 5.5 g, toplam kullanan, ancak ağırlığı gerginlik ve farelerin vücut ağırlığına dayalı olarak değişebilmektedir.
- Subkütan cebinde döngü yerleştirin ve 6-0 tek düğüm dikişlerle deri kapatın.
- Fare bir ısınma lambası altında ekstübasyon sonrası kurtarmak olsun.
6. Miyokard İskemi ve Reperfüzyon
- En az 5 gün arasında iyileşme süresi ketamin, xylazin karışımı ile anestezi neden sonrave atropin (4 ml / kg, ketamin 10 mg / ml, ksilazin 2 mg / ml, atropin 0.06 mg / ml, 1.
- Entübe ve iskemi reperfüzyon yapılan deneyler için oda havası ile havalandırın.
- Göğüs sütüre cilt açın. 8-0 sütür döngü hazırlayın. EKG takın.
- Ağırlıkları bağlayın ve bunları ortada kalsın. Lütfen iskemi protokol izleyin. ST yükselmesi 2 potansiyel dağılması için EKG izleyin.
- Iskemi sonunda ağırlık bırakın. Cilt kapatın, fare ekstübe ve kurtarmanızı sağlar.
7. Kadar 3 Days Reperfüzyon Time İnfarktı Boyutu Değerlendirmesi
- Uyuşturmak ve istenen reperfüzyon süresi sonunda fare entübe.
- Xyphoid için orta hatta göğüs cilt kesin. Karın açın ve göğüs kafesi altındaki diyafram kesti. Köprücük kemiği hattının her iki tarafında açık göğüs kesin.
- Kalp engelsiz erişim kazanmak için bir dikiş ile flapped göğüs ön duvarı Fix.
- Dikkatlice 8-0 sütür döngü hazırlamak. Döngü kesin ve LAD tıkamak için bir düğüm.
- Sol atriyum içine% 10 phthalo mavi enjekte edilir. Kardiyak volüm yükü önlemek için, yavaş yavaş boya ve zaman zaman aspire enjekte.
- Sol atriyum içine potasyum klorür enjekte edilir. Bu eşit infarkt değerlendirmesi için diyastolde kalp tutuklama olacaktır.
- Kalp kesme kolaylığı kadar extracardial doku mümkün bırakarak, kalp kesin.
- Fosfat tampon çözeltisi içinde kalp yıkanır.
- Izopentan ve sıvı azot içinde kalp dondurun. Hafifçe donmuş kadar Alternatif olarak, kalpleri bir dondurucu içine yerleştirilebilir.
- 1 mm dilimler halinde kalp kesin. Biz eşit dilimler (Şekil 4) kalp kesmek için tıraş bıçakları yapılmış bir dilimleme aygıtı var. Kalp doğru kalbin uzun ekseni dik olarak kesilmiş hizalandığından emin olun.
- 20 dakika boyunca 37 ° C'de% 1.5 'in TTC dilimleri inkübe. Biz nerede bir 96 plaka kullanabilirsinizher dilim de içine konur. Bu TTC kaydetmek ve eserler önlemek için bir Whatman filtre kullanımı kaçınmayacağız.
- Bir gecede% 4 formaldehit ile dilimleri Fix. Bu kesitler, ancak küçültmek boya kontrastı olacaktır.
- Bir mikroskop lamı üzerinde dilimi koyun. Başka bir slayt ile kaplayın. Slayt her sonunda 1 mm metal pullar kullanın ve ataç ile birlikte slaytlar tutun.
- Her bir dilimin her iki tarafından bir dijital görüntü atın. Her zaman aynı ayarları kullanmak ve daha küçük dilimler için yakınlaştırmak yok.
- Planimetri için bir yazılım kullanın. Biz NIH tarafından ImageJ kullanın. Daima enfarkte alanlar için de aynı kriterleri kullanmalısınız, örneğin sadece beyaz alanlar enfarkte edilir. Beyaz pembemsi alanlar enfarkte değildir. Biz de müdahaleler ve planimetri için araştırmacılar kör var.
8. Histoloji Alternatif Kalp Hazırlık
- 7.2 adımlar 7.1 izleyin. ve 8.2 geçin. TTC boyama ile güvenilir infarkt değerlendirmesi 7 içinde yapılabilirReperfüzyon nedeniyle skar büzülmesi 2 saat.
- Herhangi bir extracardial doku kapalı hazırlayın ve aort kökü kaplayan timus teşrih künt.
- Forseps ile aort alın ve mümkün olduğunca az ekstrakardiyak doku ile kalp kesip.
- Yıkama ve kardiyoplejik çözüm yavaşça kalp sıkın.
- Kardiyoplejik çözeltisi ile doldurulmuş bir p35 çanağı içine kalp yerleştirin.
- Aorta hazırlayın.
- Formaldehit ile doldurulmuş bir kanül ile aorta kanüle. Biz çinko-formalin fiksatif ve 24 G iv hat 3 kullanın.
- Sol kulak ve sol atrium arasında bir delik kesin.
- Ona bağlı bir 16 cm uzunluğunda hortum ile sol atriyum içine bir 26 G kateter yerleştirin. Ayrıca PE50 tüp kullanabilirsiniz.
- Formalin fiksatif ile on dakika boyunca kalbi serpmek.
- 7 ° C'de 24 saat bir süre için sabitleştirici ile doldurulmuş bir tüp içine yerleştirin kalp
- Hazırlık ile devamhistoloji / immünhistokimya için aration.
9. Temsilcisi Sonuçlar
Kronik koroner arter ligasyonu birden tuzaklar karmaşık bir tekniktir. Ancak, bir kez onu çok düşük ölüm oranları ve son derece güvenilir sonuçlar ile yapılabilir hakim edilir. Fareler ve kalp erişim için en uygun konumu LAD başarılı kimlik ve enstrümantasyon için çok önemlidir. Ligasyon pozisyonu açıkça böylece standart ligasyonu site var gerektiren, infarkt etkileyecektir. Septal dallar etkilenir Ayrıca, eğer bu bir dal bloğu yerine ST yükselmesine neden olabilir. Epimyocardial damarlarından veya ventrikül kanama, ligasyon çok derin ise, oluşabilir ve kanama fazla ise farelerin ekarte edilmelidir. Perikard mümkün olduğu kadar tamamen çıkarılması gerekir. Perikard bırakmak ligasyonu için miyokard içine iğne iterek kötüleştirecektir. Ayrıca, en sonunda, perikardit neden olacaktıryapışıklıklar neden ve histolojik inceleme zorlaştıracak. PE-tıkayıcı miyokard travmanın en aza indirmek için keskin köşeler olmadan mümkün olduğunca kısa olmalıdır. Akciğerlerin hiperenflasyon göğüs kapatıldıktan sonra tansiyon pnömotoraks önlemek için kesinlikle çok önemlidir. Bir göğüs drenajı için gerek yoktur. Gerginliği çekme kontrol etmek zordur, çünkü dikiş uçlarını çekerek açık göğüs ligasyon doğru bir konumda test çıkarılmalıdır. LAD enstrümantasyon başarısız olursa bu miyokarda travma ve ödem katacak, çünkü daha girişimleri kaçınılmalıdır.
Güvenilir bir sonuç elde etmek için, standart protokol parametreleri olmalıdır. Bu nedenle, fare entübe ve oda hava ve vücut sıcaklığı sıkı bir geri besleme sistemi ile kontrol edilmektedir ile ventile edilir. Asılı ağırlıkların kullanılması zaten vurgulanmıştır. Diğer çekerek cihazlar gerginlik kaybı ve standart olmayan çekerek gerilim dezavantajı var. İskemikreperfüzyon ve oklüzyon birden fazla kür öncesi ve postconditioning protokolleri daha kolay onlar sadece kaldırılması gerekir ve (Şekil 1) asılı izin çünkü ağırlıkları asılı yapılmaktadır.
Infarkt alanları (beyaz) risk (kırmızı) ve riskler (mavi) (Şekil 2A-B) olmayan alanda alanları ayırt olmalıdır. Infarkt boyutları iskemi süresine bağlıdır. Reperfüzyon zaman başarılı TTC boyama (Şekil 1 ve 2) izin vermek için en az 2 saat olmalıdır. En önemlisi, sitokin RNA ifade miyokard enfarktüsü (Şekil 3A-C) uygulanan hayvanlara kıyasla iskemi ve reperfüzyon hariç tüm cerrahi işlemler vardı sham operasyonu hayvanlarda düşük.
Şekil 1. Riski (IS / AAR%) seviyesinde alanın yüzde olarak boyutunu enfarkt. Fareler 1 takiben 30 dakika iskemi uygulandıReperfüzyon 20 dakika (I / R, n = 10). IPC: İskemik postconditioning, fareler reperfüzyon / oklüzyon 20 sn her 3 kür takiben iskemi 30 dakika uygulandı (n = 6, * p <0.05 belirtir).
Şekil 2A. Temsilcisi TTC-lekeli kalp dilim. Beyaz: Kırmızı infarkt alanı, alanı: risk, Mavi: non-tıkalı alanı.
Şekil 2B. Enfarkte (beyaz) alanı Temsilcisi dilim. Apekse sol ventrikül yakın konik şekli nedeniyle, epimyocard düzlem alanı olarak belirecek ve planimetrik ölçümü (mavi / pembe dış alanı) için dikkate alınması gerektiğini unutmayın. Kırmızı = TTC canlı miyokard boyandı.
Şekil 3A. Benim açısından önemli bir fark30 dakika iskemi ve 120 dakika sonra, reperfüzyon ocardial TNF-α mRNA ekspresyonu. n grup başına = 4-6.
Şekil 3B. Miyokard IL-1β mRNA 30 dakika iskemi ve 120 dakika reperfüzyon (I / R) sonra. Anlamlı kontrol arasındaki fark (hiçbir cerrahi) ve grup (hayır iskemi / reperfüzyon) Yalancı operasyon var. n grup başına = 4-6, * p <0.05 gösterir.
Şekil 3C. Miyokard IL-6 30 dakika iskemi sonrası mRNA ve 120 dakika reperfüzyon (I / R). Anlamlı kontrol arasındaki fark (hiçbir cerrahi) ve grup (hayır iskemi / reperfüzyon) Yalancı operasyon var. n grup başına = 4-6, * p <0.05 gösterir.
Şekil 4A-C. Heart cihaz kesme. A: kesim pozisyonu tıraş bıçağı ile kapatılır. B: açık, yandan görünüm. C: açık, ön görünüm. Kalp tıraş bıçakları (ok) uzun ekseni dik olan beyaz plastik yatak oluk hizalanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz sol yanal interkostal torakotomi yoluyla kalbe erişim ve sol köprücük kemiği çizgisinde göğüs LAD sütür dışarı önde gelen bir fare kapalı göğüs modeli değiştirdiniz. Kemikli göğüs kafesi zedelemeden, travmanın en aza indirmek, böylece ağrı kesiciler, cerrahi alan enfeksiyonu ve ihtiyacı, kurtarma kolaylaştıracaktır. Sol iç memeliye arter koruyarak elektrokoter için bir ihtiyaç vardır. Daha sonra kolay erişim için subkutan dokuda sütür döngü terk ve tanımlanmış bir oklüzyon için asılı ağırlık sistemi kullanın. A kapalı göğüs modeli cerrahi, travma ve daha sonra bağışıklık yanıtı 4 bakımından miyokardiyal iskemi ve reperfüzyon tüm çalışma protokollerinin uygulama sağlar. Ancak, sitokin RNA ifade Fare, sıçan ve köpeklerde 4-6 cerrahi travma nedeniyle 3 gün 'e kadar artar. Böylece, 5 gün arasında bir geri kazanım aralığı dikkate alınmalıdır. Ayrıca, bu modelde uçucu Anest kullanımını sağlar72 saate kadar 7,8 için bilinen bir ön hazırlık etkisi enstrümantasyon için hetics. postoperatif ağrı için Opioidler aynı zamanda miyokard enfarktüsü netleşebilir. Bu, miyokardiyal fonksiyonu küresel miyokardiyal iskemi sonrası iyileşme 9 olduğu buprenorfin için gösterilmiştir. Davranış gözlem değerlendirilebilir Bununla birlikte, genel olarak farelere buprenorfinin ilave dozajlar gerekmez. Miyokard enfarktüsü önceki cerrahi travma sitokin salınımını bir "arka plan" gürültüye neden ve dahası, infarkt modüle olacaktır dair kanıtlar vardır. Ren ve ark. uzaktan cerrahi travma kalp 10 önkoşullaması indüklemesi göstermiştir. Travma sonrası serbest veya salgılanan yüksek mobilite grup box 1 (HMGB1) veya ısı şok proteinleri gibi diğer endojen ligand miyokard fonksiyonu 11-13 modüle gösterilmiştir.
Bir hastane öncesi ortamda Miyokard infarktüsü genellikle prece olmadan oluşurding travma veya yaralanma. Bu nedenle, kronik bir kapalı göğüs modeli miyokardiyal iskemi ve reperfüzyon için daha gerçekçi bir yaklaşım sağlar.
Potansiyel çalışma protokolleri iskemik ve farmakolojik öncesi ve postconditioning ve invaziv hemodinamik ölçümler. Bu modelin gelecek uygulamalar enstrümantasyon cerrahi travma dikkate almak zorunda kalmadan birden fazla hit modelleri içerebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz perfüzyon fiksasyon tekniği ile ilgili onun tavsiye Daniel Duerr teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vapor | Drägerwerk AG | Isoflo | |
| Microscope | Leica | M80 | |
| Light source | Schott | KL 1500 LCD | |
| Homeothermic Blanket Control Unit | Harvard Apparatus | ||
| MiniVent Type 845 | Hugo Sachs Elektronik | ||
| 8-0 Prolene | Ethicon | BV130-5 6.5mm 3/8c | |
| 6-0 Prolene | Ethicon | BV-1 9.3 mm 3/8c | |
| Kalt suture needle size 3 | FST | 12050-03 | |
| Triphenyltetrazolium | Sigma Aldrich | 93145 | |
| Phthalo blue | Heucotech LTD | ||
| PowerLab |  ADInstruments |
References
- Lim, S. Y., Davidson, S. M., Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. Preconditioning and postconditioning: the essential role of the mitochondrial permeability transition pore. Cardiovasc. Res. 75, 530-535 (2007).
- Eckle, T., Koeppen, M., Eltzschig, H. Use of a Hanging Weight System for Coronary Artery Occlusion in Mice. J. Vis. Exp. (50), e2526 (2011).
- Michael, L. H. Myocardial infarction and remodeling in mice: effect of reperfusion. Am. J. Physiol. 277, H660-H668 (1999).
- Nossuli, T. O. A chronic mouse model of myocardial ischemia-reperfusion: essential in cytokine studies 52. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 278, H1049-H1055 (2000).
- Irwin, M. W. Tissue expression and immunolocalization of tumor necrosis factor-alpha in postinfarction dysfunctional myocardium 846. Circulation. 99, 1492-1498 (1999).
- Michael, L. H. Creatine kinase and phosphorylase in cardiac lymph: coronary occlusion and reperfusion. Am. J. Physiol. 248, 350-359 (1985).
- Tonkovic-Capin, M. Delayed cardioprotection by isoflurane: role of K(ATP) channels 765. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 283, H61-H68 (2002).
- Tsutsumi, Y. M. Role of caveolin-3 and glucose transporter-4 in isoflurane-induced delayed cardiac protection. Anesthesiology. 112, 1136-1145 (2010).
- Benedict, P. E., Benedict, M. B., Su, T. P., Bolling, S. F. Opiate drugs and delta-receptor-mediated myocardial protection. Circulation. 100, II357-II360 (1999).
- Ren, X., Wang, Y., Jones, W. K. TNF-alpha is required for late ischemic preconditioning but not for remote preconditioning of trauma. J. Surg. Res. 121, 120-129 (2004).
- Andrassy, M. High-mobility group box-1 in ischemia-reperfusion injury of the heart. Circulation. 117, 3216-3226 (2008).
- Kim, S. C. Extracellular heat shock protein 60, cardiac myocytes, and apoptosis. Circ. Res. 105, 1186-1195 (2009).
- Lin, L. HSP60 in heart failure: abnormal distribution and role in cardiac myocyte apoptosis. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 293, 2238-2247 (2007).
