Multimodale Bildgebung von Stem Cell Implantation in das zentrale Nervensystem der Mäuse

Summary

Dieser Artikel beschreibt eine optimierte Abfolge der Ereignisse für multimodale Bildgebung von zellulären Transplantaten im Gehirn von Nagetieren mit: (i) In-vivo-Biolumineszenz-und Kernspintomographie, und (ii) post mortem histologische Analyse. Die Kombination dieser bildgebenden Verfahren auf einem einzigen Tier erlaubt zelluläre Transplantat Auswertung mit hoher Auflösung, Empfindlichkeit und Spezifität.

Abstract

Während der letzten zehn Jahre hat Stammzelltransplantation zunehmendes Interesse als primäre oder sekundäre therapeutische Modalität für eine Vielzahl von Krankheiten, sowohl in vorklinischen und klinischen Studien gewonnen wurden. Bis heute wurde jedoch Ergebnisse in Bezug auf funktionelle Ergebnis und / oder Geweberegeneration folgenden Stammzelltransplantation sind sehr unterschiedlich. Im Allgemeinen wird eine klinische Nutzen ohne tiefes Verständnis der zugrunde liegende Mechanismus (n) ¹ beobachtet. Deshalb haben mehrere Bemühungen um die Entwicklung der verschiedenen molekularen Bildgebungsverfahren führte zur Stammzell-Transplantation mit dem Ziel, richtig einschätzen zu Überleben, Schicksal und Physiologie der aufgepfropft Stammzellen und / oder deren Mikro-Umgebung zu überwachen. Änderungen in der einen oder mehrere Parameter bestimmt durch molekulare Bildgebung beobachtet könnte zu der beobachteten klinischen Effekt stehen. In diesem Zusammenhang unsere Studien über den kombinierten Einsatz von Biolumineszenz-Imaging (BLI), Kernspintomographie (MRT) und histologische analysi konzentrierens zu bewerten Stammzell-Transplantation.

BLI wird allgemein nicht-invasiv durchgeführt Zellverfolgung und überwachen das Überleben der Zelle in der Zeit nach der Transplantation ^2-7, basierend auf einer biochemischen Reaktion, bei der Zellen, die das Luciferase-Reportergen verwendet werden können, um Licht nach der Wechselwirkung mit seinem Substrat emittieren (z. B. D- Luciferin) ^{8, 9.} MRI auf der anderen Seite ist eine nicht-invasive Technik, die klinisch anwendbare ¹⁰ ist und kann verwendet werden, um genau zu lokalisieren zelluläre Transplantate mit sehr hoher Auflösung ^{von 11 bis 15} werden, obwohl seine Empfindlichkeit hängt stark von der Kontrast nach der Markierung von Zellen mit einem MRT-Kontrastmittel erzeugt . Schließlich ist post-mortem histologische Analyse die Methode der Wahl, um Forschungsergebnisse mit nicht-invasiven Techniken mit höchster Auflösung und Empfindlichkeit erhalten zu validieren. Außerdem Endpunkt histologische Analyse ermöglicht es uns, detaillierte phänotypische Analysen von transplantierten Zellen und / oder des umgebenden Gewebes, ba durchführenSED auf die Verwendung von fluoreszierenden Reporter-Proteine ​​und / oder direkte Markierung von Zellen mit spezifischen Antikörpern.

Zusammenfassend haben wir hier visuell demonstrieren die Komplementarität von BLI, MRT und Histologie an verschiedenen Stammzell-und / oder Umwelt-assoziierten Merkmalen nach Stammzell-Transplantation in das ZNS von Mäusen zu entwirren. Als ein Beispiel, Knochenmark-abgeleiteten Stromazellen, gentechnisch verändert, um die verstärkte grün fluoreszierende Protein (EGFP) und Glühwürmchen-Luciferase (Fluc), und markiert mit blau-fluoreszierenden Mikrometergröße Eisenoxidteilchen (MPIOs) exprimieren, wird in der gepfropft werden ZNS von immunkompetenten Mäusen und das Ergebnis wird von BLI, MRT und Histologie (Abbildung 1) überwacht werden.

Protocol

1. Zellpräparation

1. Die Experimente sollten initiiert mit ex vivo kultivierten Stammzell-Populationen genetisch manipuliert, um die Luciferase und eGFP Reporter-Proteine ​​zu exprimieren. Wir verwenden hier Luciferase / eGFP-Expression murinen Knochenmark abgeleiteten Stromazellen (BMSC-Luc/eGFP), wie zuvor von Bergwerf et al. ^{2, 5} beschrieben.
2. Zwei Tage vor Zellmarkierung, Platte BMSC-Luc/eGFP Zellen bei einer Dichte von 8 x 10 ⁵ Zellen pro T75 Kulturflasche in 15 ml komplett Expansion Medium (CEM) mit 1 ug / ml Puromycin ergänzt.
3. Willkommen Zellen für 48 Stunden bei 37 ° C und 5% CO _2.
4. Fügen Sie 5 x 10 ⁶ gletscherblau Mikrometergröße Eisenoxid-Partikel (GB MPIO) pro ml Kulturmedium auf die wachsende Zellkultur (gesamt: 75 x 10 ⁶ Teilchen pro 15 ml Kulturmedium in einer T75 Kulturflasche).
5. Inkubieren Sie für 16 Stunden, um Partikel Aufnahme über Endozytose ermöglichen.
6. Wegspülen verbleibenden Teilchenund ermöglichen Zellen für weitere 24 Stunden wachsen, um Zellkonfluenz und homogene Verteilung der GB MPIO zu erhalten.
7. Überprüfen Partikelaufnahme visuell unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie durch Zählen des Verhältnisses der eGFP + und D +-Zellen MPIO auf die Gesamtmenge der eGFP +-Zellen.
8. Wash GB MPIO-markierten BMSC-Luc/eGFP Zellen zweimal mit 10 ml PBS und Ernten der Zellen nach Trypsin-EDTA-Behandlung (5 ml pro T75 Kulturflasche für 5 Minuten).
9. Waschen Sie geernteten Zellen resuspendieren und bei einer Endkonzentration von 133 x 10 ⁶ Zellen / ml in PBS.
10. Halten Zellen auf Eis bis zur Transplantation.

2. Zellimplantation im ZNS von Mäusen

1. Anästhesiert Mäuse durch eine intraperitoneale Injektion von einer Ketamin (80 mg / kg) + Xylazin (16 mg / kg)-Mischung.
2. 5 Minuten warten, damit Mäuse, um einzuschlafen.
3. Rasieren Sie mit der Maus Kopf bis zur sterilen Manipulationen zu ermöglichen.
4. Platzieren Sie die Maus in einem stereotaktischen Rahmen.
5. Desinfizieren, dieHaut und nass die Augen der Mäuse zu Austrocknung zu verhindern.
6. Machen Sie eine Mittellinie Kopfhauteinschnitt, um den Schädel freizulegen, und bohren Sie ein Loch in den Schädel mit einem Dentalbohrers Grat an den angegebenen Koordinaten: 2 mm und 2 mm posterior lateral zum Bregma.
7. Vortex die Zellsuspension kurz und saugen Sie den Zell-Suspension in der Spritze.
8. Setzen Sie die Nadel der Spritze in einer Tiefe von 2,5 mm unter der Dura und erlauben Druckausgleich für 1 Minute.
9. Einspritzen, 3 ul Zellsuspension (4 × 10 ⁵ Zellen) in einer Tiefe von 2 mm unter der Dura und mit einer Geschwindigkeit von 0,70 ml / min unter Verwendung eines automatisierten Mikro-Einspritzpumpe.
10. Warten für weitere 5 Minuten, um einen Rückfluss des eingespritzten Zellsuspension zu verhindern.
11. Langsam einfahren Nadel und desinfizieren die Haut Grenzen vor dem Vernähen der Haut.
12. Injizieren Sie 300 ul 0,9% NaCl-Lösung subkutan, um Austrocknung zu verhindern, und platzieren Sie die Maus unter einer Wärmelampe aus der Narkose zu erholen. Verwalten pOst-operative Analgetikum in Übereinstimmung mit institutionellen Normen.

3. In-vivo-Biolumineszenz

1. Betäuben die Mäuse mit einem Gemisch aus 3% Isofluran und Sauerstoff.
2. Legen Sie die Mäuse in der Photon-Imager und Anästhesie verringern Niveau auf 1,5% Isofluran und Sauerstoff.
3. Inject 150 mg D-Luciferin pro kg Körpergewicht intravenös.
4. Erwerben Sie auf die Grafik für 5 Minuten mit dem Photo Vision Software.
5. Führen Bildverarbeitung mit dem M3vision Software. Quantifizierung des beobachteten Signals mit fester Regions of Interest.

4. In-vivo-Magnetic Resonance Imaging

1. Betäuben die Mäuse mit 3% Isofluran in einem Gemisch aus O _2: N ₂ O (3:7).
2. Platzieren Sie die Mäuse in der Restrainer einer horizontalen 9,4 T MR-System zu verringern und Anästhesie auf 1% Isofluran in einem Gemisch aus O _2: N ₂ O (3:7).
3. Befeuchten Sie die Augen der Mäuse, um Dehydratisierung zu verhinderntion, legen Sie eine rektale Sonde, um die Körpertemperatur überwachen und überwachen die Atmung, indem ein Sensor der Unterseite der Maus Bauch.
4. Pflegen Sie Atemfrequenz bei 110 ± 10 Atemzüge pro Minute und halten die Körpertemperatur konstant in einem engen Bereich von 37 ± 0,5 ° C.
5. Legen Sie die Oberfläche HF-Spule auf der Oberseite der Maus Kopf und positionieren Sie den Mauszeiger in der Mitte des Magneten.
6. Erwerben Sie einen Satz von 10 koronalen T2-gewichteten Spin-Echo (SE) Bilder an bestimmte anatomische Information und T2 *-gewichteten Gradientenecho (GE) Bilder zu erhalten, um Stammzell-Migration mit einer in-plane-Auflösung von 70 um ² zu studieren. Set-Sequenz Parameter wie folgt: Repetitionszeit (TR): 500 ms, Echozeit (TE): 8 ms (GE-Sequenz) und Wiederholung (TR): 4200 ms, Echozeit (TE): 12,16 ms (SE-Sequenz); Field of View (FOV): 18x18 mm ^2, Matrix: 256x256, 1 mm Schichtdicke und 1 mm Scheibe Trennung (Paravision 5.1-Software).
7. Führen DatenverarbeitungseinrichtungVerwendung von Amira 4.0-Software.

5. Post Mortem Histologie

1. Betäuben die Mäuse tief durch Inhalation eines Isofluoran (4%), Sauerstoff (0,5 l / min) und Stickstoff (1 l / min)-Mischung für 2 Minuten. Opfere die Mäuse durch Genickbruch.
2. Entfernen Sie die Maus Gehirn aus dem Schädel und fixieren das Hirngewebe in 4% Paraformaldehyd in PBS für 2 Stunden.
3. Entwässern des Hirngewebes, indem das Gehirn anschließend in verschiedenen Gradienten von Saccharose: 2 Stunden lang in 5% Sucrose in PBS, 2 Stunden lang in 10% Saccharose in PBS über Nacht in 20% Saccharose in PBS.
4. Frieren Sie das Hirngewebe mit flüssigem Stickstoff und lagern Sie das Gewebe bei -80 ° C bis zum Schneiden.
5. Abschnitt das Hirngewebe in 10 mu m dicke Schnitte mit Hilfe eines Kryostaten.
6. Bildschirm ungefärbt Kryoschnitten für blaue Fluoreszenz aus den GB MPIO Partikel und grüne Fluoreszenz der eGFP exprimierenden Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop.
7. Bildschirm ungefärbt Kryoschnitten fürgrün / rot Hintergrundfluoreszenz von Entzündungszellen.
8. Führen weitere immunhistochemische und Immunfluoreszenz-Färbungen auf endogenes Zellpopulationen (zB Mikroglia, Astrozyten, T-Zellen, ...), die mit zellulären Transplantate zu identifizieren.

6. Repräsentative Ergebnisse

Wir hier visuell eine optimierte Abfolge von Ereignissen für eine erfolgreiche multimodale Bildgebung von Luciferase / EGFP-exprimierenden (Stamm-) Zellpopulationen im ZNS von Mäusen vorgestellt. Auf den ersten, mit dem beschriebenen GB MPIO Kennzeichnung Vorgehen führt zu hocheffizienten Kennzeichnung von BMSC-Luc/eGFP Zellen, die leicht überprüft werden können Fluoreszenz-Mikroskopie (Abbildung 2A). Als nächstes wird auf Pfropfung GB MPIO markierten BMSC-Luc/eGFP im ZNS von Mäusen, kann das Überleben des Transplantats durch zellulären in vivo BLI basierend auf Luciferase-Aktivität (2B) überwacht werden. Zusätzlich kann die exakte Lokalisierung der transplantierten Zellen durch in vivo beobachtet werden (Abbildung 2C) basiert. Schließlich erlaubt die histologische Analyse Validierung der Ergebnisse durch BLI und MRT erhalten. Stabile Überleben wurde durch eine stabile eGFP-Expression mit der Zeit (2D) bestätigt. Dafür Kolokalisation von eGFP-exprimierenden Zellen mit blau fluoreszierenden MPIO erlaubt die exakte Bestimmung der Lokalisation und das Überleben der transplantierten Zellen. Darüber hinaus reduziert diese doppelte Fluoreszenzmarkierung der Stammzellen die Möglichkeit zu falsch positiven Ergebnissen auf Hintergrundfluoreszenz durch Entzündungszellen ⁵ erstellten Basis zu beobachten.

1. Übersicht der Bearbeitungsreihenfolge

1. Zellmarkierung: BMSC-Luc/eGFP werden mit 5 x 10 ⁶ GB MPIO Partikel pro ml Kulturmedium beschriftet. Nach 16 Stunden Inkubation und einem folgenden Ruhezeit von 24 Stunden werden die Zellen für geerntetintrazerebraler Implantation.
2. Zell-Implantation: GB MPIO beschriftet BMSC-Luc/eGFP im Gehirn der Maus werden an den folgenden Koordinaten aufgepfropft: Bregma -2 mm, 2 mm rechts von der Mittellinie und 2 mm unter Dura.
3. In vivo BLI: Nach intravenöser Gabe von 150 mg D-luciferin/kg Körpergewicht wurde das erzeugte Licht während 5 Minuten mit dem Photon Imager erworben.
4. In-vivo-MRT: Ein Satz von 10 koronalen T2-gewichteten Spin-Echo (SE) Bilder und T2 *-gewichteten Gradientenecho (GE) Bilder mit einem in-plane-Auflösung von 70 um ² erworben wurden. Sequence Parameter waren wie folgt: Repetitionszeit (TR): 500 ms, Echozeit (TE): 8 ms (GE-Sequenz) und Wiederholung (TR): 4200 ms, Echozeit (TE): 12,16 ms (SE-Sequenz); Field of View (FOV): 18x18 mm ^2, Matrix: 256x256, 1 mm Schichtdicke und 1 mm Scheibe Trennung.
5. Post-mortem-Histologie: 10 um dicke Gefrier wurden für eGFP exprimierenden und blau fluoreszierend markierten BMSC u abgeschirmtsingen ein Fluoreszenzmikroskop.

Abbildung 2. Multimodale Bildgebung von Stammzell-Transplantate

1. Direkte Immunfluoreszenz-Mikroskopie von Glacial blau (GB) MPIO BMSC-Luc/eGFP beschriftet.
2. In vivo BLI von Mäusen mit 4x10 ⁵ eingespritzt GB MPIO beschriftet BMSC-Luc/eGFP Zellen in Woche 1 und Woche 2 nach der Implantation. Die statistische Analyse der erfassten Signale BLI in Woche 1 und Woche 2 nach der Implantation. Die Daten werden als durchschnittliche Anzahl der Photonen pro Sekunde pro Steradiant pro Quadratzentimeter (ph / s / sr / cm ²⁾ von einem 5-Minuten-Zeitraum ausgedrückt + / - Standardfehler von einem festen region of interest in Mäusen zeigen eine klare BLI-Signal berechnet an der Injektionsstelle.
3. Koronare zweidimensionalen MRT GB MPIO beschriftet BMSC-Luc/eGFP (linkes Bild: (i) T2-gewichteten Spin-Echo-Bild und (ii) T2 *-gewichteten Gradienten-Echo-Bild) und unmarkierter BMSC-Luc / eGFP (rechtes Bild: (iii) T2-gewichteten Spin-Echo-Bild und (vi) T2 *-gewichteten Gradienten-Echo-Bild) Transplantate im Gehirn der Maus.
4. Die histologische Analyse der GB MPIO beschriftet BMSC-Luc/eGFP Implantate in Woche 2 nach der Implantation. (I) direkte Immunfluoreszenz-Analyse zur Lokalisation von eGFP-exprimierende und GB MPIO beschriftet BMSC-Luc/eGFP Transplantate. (Ii) Starke Vergrößerung anzeigen: (i). (Iii) Immunfluoreszenzfärbung für GFAP-Antigen, die die Entwicklung von Astrozyten Narbengewebe in der Umgebung der GB MPIO markierten BMSC-Luc/eGFP. (Vi) Immunfluoreszenzfärbung für Iba-1-Antigen, was anzeigt, die Invasion und Umgebung GB MPIO markierten BMSC-Luc/eGFP durch Mikroglia.

Discussion

In diesem Bericht beschreiben wir ein optimiertes Protokoll für die Kombination aus drei sich ergänzenden bildgebenden Verfahren (BLI, MRT und Histologie) für eine detaillierte Charakterisierung der zellulären Implantaten im ZNS von immunkompetenten Mäusen. Eine Kombination von Reportergen Markierung von Zellen, auf genetische Modifikation mit der Reportergene Luciferase und eGFP, und eine direkte Markierung von Zellen mit GB MPIO basiert, führt zu einer genauen Beurteilung der Stammzellläppchen in vivo.

Für Partikel Kennzeichnung von BMSC, wird das GB MPIO Teilchengröße (1.63μm) in Kombination mit dem anionischen oberflächenaktiven (Carboxyl Ersatz) vorgeschlagen, endozytotische Aufnahme dieser Teilchen durch nichtphagozytischen Zellen ^16-18 erleichtern. Es muss jedoch erwähnt werden, dass die Inkubationszeit der hohen Effizienz zu erhalten Kennzeichnung Zelltyp abhängig ist. Zum Beispiel sind Phagozyten (wie Makrophagen und dendritische Zellen) in der Lage, diese Partikel schneller internalisieren (Inkubationszeit von 0,5 bis 1 h) als Nicht-phaghocytic Zelltypen (wie BMSC oder neurale Stammzellen), die eine Inkubationszeit von mindestens 16 Stunden für die effiziente Kennzeichnung müssen verglichen. Dies muss berücksichtigt werden während der Durchführung Zellmarkierung Experimente und Effizienz der Markierung immer im Voraus bestimmt werden unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie und / oder die durchflusszytometrische Analyse. Die Kennzeichnung von Zellpopulationen mit GB MPIOs nicht beeinflusst Zellviabilität, Zellproliferation oder Zellphänotyp ^5, die Kombination von Eisenoxid und einem Fluorophor in diesen Partikeln schafft somit eine ideale Gelegenheit, um sie sowohl mittels MRT und optische Bildgebung sichtbar zu machen. Außerdem wird durch den hohen Eisengehalt und großer Partikelgröße, können Partikel MPIO für einzelne Zelle ^12,19,20 und ²¹ Single Particle Imaging mittels MRT eingesetzt werden. Dies ist äußerst interessant, wenn es um die Zellwanderung zu studieren als einzelne Zellen beobachtet werden kann kommt. Der hohe Eisengehalt des verwendeten GB MPIOTeilchen hat auch gewisse Nachteile, wenn mit dem Ziel, die genaue Größe des Transplantats vor Ort mittels MRT abzugrenzen. Die sehr hohe Eisengehalt von MPIOs schafft nicht nur magnetische Inhomogenitäten an der Implantationsstelle, sondern auch in der Umgebung des zellulären Implantat, was zu einer Überschätzung des Implantatlagers Volumen und eine weniger genaue Unterscheidung zwischen implantierten Zellen und dem umgebenden Gewebe. Folglich kann die Art der Partikel, benötigt für Zellmarkierung, wird auf den Aufbau der Studie ab. Bei dem Ziel, Stammzellen-Migration, eine sehr hohe Empfindlichkeit und damit eine hohe eisenhaltigen MPIOs benötigt werden bestimmen. Auf der anderen Seite könnte beim Zielen für die genaue Lokalisierung von Stammzellläppchen kleineren SPIOs mit einem niedrigeren Eisengehalt eine bevorzugte Alternative ²² sein. Darüber hinaus erzeugen Eisenpartikel negativen Kontrast Einführung ein weiteres Problem bezüglich der Diskriminierung zwischen den implantierten Zellen und Blutungen nach Zell-Transplantation. Daher ist eine Menge Forschung gehtauf auf den Einsatz von positiven Kontrastmitteln für die Markierung von Zellen. Neben der Teilchen, die Art der Sequenz für die MRI-Erfassung verwendet hängt auch von der Ziel der Studie. Wenn MRI verwendet wird, um das Implantat abzugrenzen, genaue Informationen über die Lage des Implantats und der Implantatgröße, die T2-Sequenz zu erhalten (Spin-Echo) ist günstig, da es eine anatomische Information mit hoher Genauigkeit ermöglicht. Auf der anderen Seite ist die T2 *-Sequenz (Gradientenecho) eine Sequenz verwendet, um mögliche Migration von transplantierten Zellen zu untersuchen, wie diese Sequenz berücksichtigt alle Inhomogenitäten des Magnetfeldes machen eine höhere Empfindlichkeit gegenüber Verbindungen Beeinflussung des Magnetfeldes. Diese Sequenz ist absolut notwendig, wenn es um den Nachweis von einer kleinen Menge von Zellen, die aus dem implantierten Bereich migriert haben könnten, unverzichtbar. Mit dieser Sequenz konnten wir feststellen, dass BMSC-Luc/eGFP Zellen nicht nach striatalen Implantation im ZNS von Mäusen zu migrieren.

WährendMRT liefert Daten über die Zell-Implantat-Lokalisierung, liefert zusätzliche Daten zur Analyse BLI Zelle Implantatüberlebensrate ^2,4,11. Da die enzymatische Reaktion zwischen dem Luciferase-Enzym und dem Substrat Luciferin muss das Vorhandensein von O ₂ und ATP, ist es eine zuverlässige Technik Überleben der Zelle zu untersuchen. Nekrotische Zellen werden nicht ausdrücken das Luciferase-Enzym und keine O ₂ und ATP wird anwesend sein. Ferner werden nur Zellen, die das Luciferase-Enzym, das die Reaktion zu katalysieren, was zur Erzeugung von Licht, das die hohe Empfindlichkeit der Technik ähnelt. BLI können in einer quantitativen Weise durchgeführt werden, da die Menge des erzeugten Lichtes ist proportional zu der Menge an Luciferase-exprimierenden Zellen. Allerdings müssen wichtige Überlegungen in Betracht gezogen werden, während der Durchführung BLI quantitativ mehrere andere Faktoren als Zelle beträgt die Expression von Luciferase oder die Menge des detektierten Lichts zu beeinflussen. Zum Beispiel anesthesiPegel kann Einfluss auf die Luciferase-Enzym und / oder das Luciferin Verfügbarkeit ^23, verschiedene Faktoren und Verbindungen kann das Substrat Verfügbarkeit und / oder Aufnahme ^{von 24 bis 26} oder Promotor-Aktivität ^{von 27 bis 30} zu beeinflussen, was zu Unterschieden in den Signalausgang. Darüber hinaus ist die Verwendung von BLI ist auf kleine Tiere begrenzt, da die Technik zu niedrigen Eindringen in das Gewebe des Lichts begrenzt ist. Deshalb ist bei dem Ziel, quantitative BLI zu verfolgen Überleben der Zellen nach der Transplantation, alle Parameter möglicherweise Wirksignal Variationen durchführen müssen, um als Standard wie möglich gehalten werden. Zum Beispiel, Implantationstiefe von zellulären Transplantaten, Anästhesie Niveau und Art der Anwendung / Menge des Substrats vor BLI Erwerb verabreicht, richtige Rasur von der Haut des Tieres, usw.

Unter Berücksichtigung der oben beschriebenen Vor-und Nachteile der molekularen Bildgebung, die gewonnenen Ergebnisse müssen immer durch histologische Analyse validiert werden. Hiermit variouns zellulären Phänotypen und zellulären Interaktionen zwischen verschiedenen Zelltypen können visualisiert werden mit höchster Empfindlichkeit post mortem. Trotz der Tatsache, dass diese Technik das Validierungs-Tool der Wahl, die Anwesenheit der Hintergrundfluoreszenz durch Entzündungszellen umgeben und / oder eine Invasion des Transplantats vor Ort muss berücksichtigt werden, da dies zu falsch positiven Ergebnissen führen könnten, geschaffen ist. Jedoch reduziert die Verwendung eines Dual-Markierung mit einem fluoreszierenden Reporter-Gen, wie eGFP, und einer fluoreszierenden Sonde, wie GB MPIO, die Möglichkeit einer falschen Identifizierung (dh transplantierten Zellen sollten sowohl spezifische Fluoreszenz zeigt, ohne das Anzeigen Hintergrundfluoreszenz in irrelevanten Licht Kanäle).

Zusammenfassend während BLI ist eine einzigartige Technik, um das Überleben der Zelle in der Zeit in einer quantitativen Weise mit sehr hoher Sensitivität aber geringer Auflösung zu überwachen, ist die MRT die Methode der Wahl, um die niedrige Auflösung mit BLI erhalten zu überwinden. Kombination aus diesen In-vivo-techFrage macht ausreichende Informationen über das Überleben und die Lokalisierung von transplantierten Zellen in vivo in einem nicht-invasive Weise. Schließlich kann die zelluläre Wechselwirkungen Transplantats mit dem umgebenden Gewebe und / oder endogenen entzündlichen Zellen leicht post mortem überwacht werden mit Histologie. Obwohl, im Moment, letztere muss noch durch histologische Analyse durchgeführt werden, werden die wichtigsten Herausforderungen für die Zukunft sein, zur Verbesserung der bestehenden In-vivo-molekularen Bildgebungsverfahren zu ermöglichen Echtzeit-Beurteilung der Parameter mit ähnlicher Auflösung und Empfindlichkeit als unter Verwendung histologische Analyse.