Imagem Multimodal de implante de células-tronco no sistema nervoso central de camundongos

Summary

Este artigo descreve uma sequência otimizada de eventos para imagiologia multimodal de enxertos celulares no cérebro de roedores por meio de: (i) na bioluminescência vivo e ressonância magnética, e (ii) a análise post mortem histológica. A combinação destas modalidades de imagem em um único animal permite uma avaliação do enxerto celular com alta resolução, sensibilidade e especificidade.

Abstract

Durante a última década, o transplante de células estaminais ganhou interesse crescente como primário ou secundário modalidade terapêutica para uma variedade de doenças, tanto em estudos pré-clínicos e clínicos. No entanto, até à data resultados referentes resultado funcional e / ou tecido regeneração transplante de células estaminais seguinte são bastante diversos. Geralmente, um benefício clínico é observado sem uma profunda compreensão do mecanismo subjacente (s) ^1. Portanto, os esforços têm múltiplas levou ao desenvolvimento de diferentes modalidades de imagens moleculares para monitorar enxerto de células-tronco com o objectivo último para avaliar com precisão o destino, sobrevivência e fisiologia de células estaminais enxertados e / ou do seu ambiente de micro-. Alterações observadas em um ou mais parâmetros determinados por imagem molecular pode estar relacionado com o efeito observado clínica. Neste contexto, os nossos estudos focalizam o uso combinado de imagem de bioluminescência (BLI), ressonância magnética (MRI) e Analysi histológicas para avaliar células estaminais do miocárdio.

BLI é normalmente usado para executar de forma não invasiva de rastreamento de células e monitorar a sobrevivência das células no tempo após o transplante de ^2-7, com base numa reacção bioquímica onde as células expressando o gene repórter da luciferase-são capazes de emitir luz interacção seguinte com o seu substrato (por exemplo, D- luciferina) ^{8, 9.} RM, por outro lado é uma técnica não-invasivo que é clinicamente aplicável ¹⁰ e pode ser usado para localizar precisamente os enxertos celulares com resolução muito elevada ^11-15, embora a sua sensibilidade altamente depende do contraste gerado após marcação das células com um agente de contraste para IRM . Finalmente, post-mortem análise histológica é o método de escolha para validar os resultados de pesquisa obtidos com técnicas não-invasivas com maior resolução e sensibilidade. Além disso end-point análise histológica nos permite realizar uma análise detalhada fenotípica das células enxertadas e / ou tecido circundante, based sobre a utilização de proteínas repórter fluorescentes e / ou rotulagem célula directa com anticorpos específicos.

Em resumo, estamos aqui visualmente demonstrar a complementaridade de BLI, ressonância magnética e histologia para desvendar células-tronco e diferente / ou meio ambiente associada seguintes características de células-tronco de enxerto no sistema nervoso central de camundongos. Como um exemplo, derivadas da medula óssea células estromais, geneticamente modificados para expressar o reforço de Proteína Fluorescente Verde (eGFP) e luciferase do pirilampo (FLUC), e marcadas com azul fluorescentes micron de tamanho de partículas de óxido de ferro (MPIOs), vai ser enxertados na SNC de camundongos imuno-competentes e os resultados serão monitorados por BLI, ressonância magnética e histologia (Figura 1).

Protocol

1. Preparação de células

1. Experiências deve ser iniciada usando ex vivo populações de células-tronco cultivadas geneticamente modificadas para expressar as proteínas repórter da luciferase e EGFP. Aqui usamos luciferase / eGFP-expressam murinos derivadas da medula óssea (células estromais BMSC-Luc/eGFP) como anteriormente descrito por Bergwerf et al. ^{2, 5.}
2. Dois dias antes de marcação celular, as células BMSC-Luc/eGFP em placas a uma densidade de 8 x 10 células por ⁵ T75 frasco de cultura em meio de expansão 15 ml completo (CEM) suplementado com 1 ug / ml Puromycine.
3. Permitir que as células a crescer durante 48 horas a 37 ° C e 5% de CO _2.
4. Adicionar 5 x 10 ⁶ Glacial azul micron de tamanho de partículas de óxido de ferro (GB MPIO) por ml de meio de cultura para a cultura de células em crescimento (total: 75 x 10 ⁶ partículas por meio de cultura 15 ml em um frasco de cultura T75).
5. Incubar durante 16 horas para permitir a captação de partículas através de endocitose.
6. Lavar as partículas restantese permitir que as células crescer durante uma hora adicional 24 para obter uma distribuição de células de confluência e homogénea da MPIO GB.
7. Validate captação de partículas visualmente usando microscopia de fluorescência através da contagem do rácio de EGFP + e MPIO GB + de células para a quantidade total de EGFP + de células.
8. Lavar as células GB MPIO-rotulados BMSC-Luc/eGFP duas vezes com 10 ml de PBS e as células de colheita sequência de tripsina-EDTA tratamento (5 ml por frasco de cultura T75, durante 5 minutos).
9. Lave as células colhidas e ressuspender em concentração final de 133 x 10 ⁶ células / ml em PBS.
10. Manter as células em gelo até ao transplante.

2. Implantação de células no SNC de Ratos

1. Anestesiar ratinhos por uma injecção intraperitoneal de uma cetamina (80 mg / kg) + xilazina (16 mg / kg) mistura.
2. Aguarde 5 minutos para permitir que os ratos para adormecer.
3. Raspar a cabeça de rato para permitir manipulações estéreis.
4. Posicione o mouse em um quadro estereotáxico.
5. Desinfectares aa pele e os olhos molhado dos ratinhos para evitar a desidratação.
6. Fazer uma incisão na linha média do couro cabeludo para expor o crânio, e perfurar um orifício no crânio utilizando uma broca dental rebarba nas coordenadas dada: 2 mm posterior e 2 mm lateral à bregma.
7. Vórtice da suspensão de células de forma breve e aspirar a suspensão de células na seringa.
8. Coloque a agulha da seringa, a uma profundidade de 2,5 mm sob a dura-máter e permitir que o equilíbrio de pressão durante 1 minuto.
9. Injectar uma suspensão de células 3 ul (4 x 10 ⁵ células) a uma profundidade de 2 mm sob a dura-máter e com uma velocidade de 0,70 ul / min utilizando uma bomba de injecção de micro-automatizado.
10. Esperar por um período adicional de 5 minutos, para evitar o refluxo da suspensão de células injectadas.
11. Lentamente, retirar a agulha e desinfectar as fronteiras da pele antes da sutura da pele.
12. Injectar 300 solução de NaCl a 0,9% uL por via subcutânea, a fim de evitar a desidratação, e colocar o rato sob uma lâmpada de aquecimento para recuperar da anestesia. Administrar post-operatório analgésico em conformidade com as normas institucionais.

3. Na bioluminescência in vivo

1. Anestesiar os ratos por uma mistura de 3% de isoflurano e oxigénio.
2. Coloque os ratos no Imager Photon e reduzir o nível de anestesia para 1,5%, isoflurano e oxigênio.
3. Injectar 150 mg de D-luciferina por kg de peso corporal por via intravenosa.
4. Adquirir imagem por 5 minutos, utilizando o software Vision Photo.
5. Executar o processamento de imagem usando o software M3vision. Quantificar o sinal observado utilizando regiões de juro fixa.

4. Em Ressonância Magnética vivo

1. Anestesiar os ratos com 3% de isoflurano em uma mistura de O _2: N ₂ O (3:7).
2. Colocar os ratinhos no limitador de um sistema horizontal MR 9.4T e reduzir a anestesia nível de 1% de isoflurano em uma mistura de O _2: N ₂ O (3:7).
3. Molhe os olhos dos camundongos para evitar desidrataçãoção, anexar uma sonda rectal de controlar a temperatura do corpo e monitorar a taxa de respiração pela colocação de um sensor de baixo da barriga do rato.
4. Manter a taxa de respiração em 110 ± 10 respirações por minuto e manter a temperatura corporal constante dentro de uma estreita faixa de 37 ± 0,5 ° C.
5. Coloque a bobina RF superfície sobre a parte superior da cabeça do rato e da posição do rato no meio do magneto.
6. Adquirir um conjunto de 10 coronais ponderadas em T2 spin-eco (SE) imagens para obter informações anatômica específica e T2 * ponderadas gradiente eco (GE) imagens, a fim de estudar a migração de células-tronco com uma resolução no plano de 70 mM ^2. Definir parâmetros de seqüência da seguinte forma: tempo de repetição (TR): 500 ms, tempo de eco (TE): 8 ms (seqüência GE) e tempo de repetição (TR): 4200 ms, tempo de eco (TE): 12,16 ms (SE seqüência); campo de visão (FOV): 18x18 mm ^2, matriz: 256x256, 1 fatia de espessura mm e 1 fatia de separação mm (Paravision software 5.1).
7. Realizar o processamento de dadosusando software Amira 4,0.

5. Post Mortem Histologia

1. Anestesiar os ratos muito profundamente por inalação de um oxigénio isofluorano (4%), (0,5 L / min) e azoto (1 l / min) a mistura durante 2 minutos. Sacrifício dos camundongos por deslocamento cervical.
2. Remover o cérebro do rato a partir do crânio e fixar o tecido cerebral em paraformaldeído a 4% em PBS durante 2 horas.
3. Desidratar o tecido do cérebro, colocando o cérebro, posteriormente, em diferentes gradientes de sacarose: 2 h em sacarose a 5% em PBS, 2 horas em 10% de sacarose em PBS, durante a noite em sacarose a 20% em PBS.
4. Congelar o tecido do cérebro utilizando azoto líquido e armazenar o tecido à temperatura de -80 ° C até seccionamento.
5. Seção tecido do cérebro em 10 mM de espessura, utilizando um criostato.
6. Tela unstained criossecções para a fluorescência azul a partir das partículas GB MPIO e fluorescência verde a partir das células que expressam EGFP usando um microscópio de fluorescência.
7. Tela imaculada criosecções paraverde / vermelho fluorescência de fundo a partir de células inflamatórias.
8. Realizar colorações mais imuno-histoquímica e imunofluorescência para identificar populações de células endógenas (por exemplo, a microglia, astrócitos, células T, ...) que interagem com enxertos celulares.

6. Os resultados representativos

Nós aqui apresentadas visualmente uma sequência otimizada de eventos para imagiologia multimodal sucesso da luciferase / eGFP expressar-populações (caule) de células no sistema nervoso central de camundongos. Na primeira, os descritos GB MPIO resultados de rotulagem procedimento em rotulagem altamente eficiente de células BMSC-Luc/eGFP, que podem facilmente ser validados utilizando microscopia de fluorescência (Figura 2A). Em seguida, mediante enxerto de GB MPIO rotulado BMSC-Luc/eGFP no SNC de ratinhos, a sobrevivência do enxerto celular pode ser monitorizada por in vivo BLI com base na actividade da luciferase (Figura 2B). Além disso, a localização exacta das células enxertadas pode ser monitorizada por in vivo (Figura 2C). Finalmente, a análise histológica permite a validação dos resultados obtidos por BLI e RM. Sobrevivência estável foi confirmada por uma expressão eGFP estável no tempo (Figura 2D). Para isso, colocalização de EGFP-expressando células com azul fluorescente MPIO permite a determinação exacta da localização e sobrevivência das células transplantadas. Além disso, este rotulagem dupla fluorescente das células-tronco reduz a possibilidade de observar resultados falsos positivos baseados em fluorescência de fundo criado por células inflamatórias ^5.

Figura 1. Visão geral da seqüência de manipulação

1. Marcação celular: BMSC-Luc/eGFP são rotulados com 5 x 10 ⁶ partículas GB MPIO por ml de meio de cultura. Após 16 hr de incubação e um período de repouso seguinte de 24 horas, as células são colhidas paraimplante intracerebral.
2. Implante de células: GB MPIO rotulado BMSC-Luc/eGFP são enxertados no cérebro do rato nas coordenadas seguinte: bregma -2 mm, 2 mm direita da linha média e 2 mm sob dura.
3. In vivo BLI: administração intravenosa de 150 mg D-luciferin/kg peso corporal, a luz gerada foi adquirida durante 5 minutos usando o Imager Photon.
4. In vivo RM: Um conjunto de 10 coronais ponderadas em T2 spin-eco (SE) imagens e T2 * ponderadas gradiente eco (GE) imagens com uma resolução no plano de 70 mM ² foram adquiridos. Parâmetros de sequência foram as seguintes: tempo de repetição (TR): 500 ms, tempo de eco (TE): 8 ms (sequência GE) e tempo de repetição (TR): 4200 ms, tempo de eco (TE): 12,16 ms (sequência SE); campo de visão (FOV): 18x18 mm ^2, matriz: 256x256, 1 fatia de espessura mm e 1 fatia de separação mm.
5. Post-mortem histologia: cryosection espessura 10μm foram selecionados para eGFP expressar e azul fluorescente etiquetado BMSC ucantar um microscópio de fluorescência.

Figura 2. Imagem Multimodal de enxertos de células-tronco

1. Microscopia de imunofluorescência direta da Glacial azul (GB) MPIO rotulado BMSC-Luc/eGFP.
2. In vivo BLI de camundongos injetados com 4x10 ⁵ GB MPIO rotulado células BMSC-Luc/eGFP na semana 1 e semana 2 após a implantação. A análise estatística dos sinais detectados BLI na semana 1 e semana 2 pós-implantação. Os dados são expressos como o número médio de fotões por segundo por esterradiano por centímetro quadrado (pH / s / SR / cm ²⁾ a partir de um período de tempo 5 minutos + / - erro padrão calculados a partir de uma região de interesse fixa em ratinhos apresentando um sinal claro BLI no local da injecção.
3. Coronal bidimensional de ressonância magnética GB MPIO rotulado BMSC-Luc/eGFP (painel da esquerda: (i) ponderação T2 spin echo e (ii) T2 *-weighted imagem eco gradiente) e sem rótulo BMSC-LUC / eGFP (painel da direita: (iii) ponderação T2 spin echo e (vi) T2 *-weighted imagem eco gradiente) enxertos em cérebro de camundongo.
4. A análise histológica do MPIO GB rotulado implantes BMSC-Luc/eGFP na semana 2 pós-implantação. (I) a análise de imunofluorescência directa para a localização de EGFP-expressar e MPIO GB enxertos BMSC-Luc/eGFP rotulados. (Ii) detalhe ampliação elevada de (i). (Iii) coloração imunofluorescente para o antigénio GFAP, indicando o desenvolvimento de tecido cicatricial no astrocítica circundante de GB MPIO rotulado BMSC-Luc/eGFP. (Vi) coloração de imunofluorescência para Iba-1 antígeno, indicando a invasão e ao redor da GB MPIO rotulado BMSC-Luc/eGFP por microglia.

Discussion

Neste relatório, nós descrevemos um protocolo otimizado para a combinação de três modalidades de imagem complementares (BLI, ressonância magnética e histologia) para a caracterização detalhada dos implantes celulares no sistema nervoso central de camundongos imunes competentes. Uma combinação de rotulagem de gene repórter de células, com base na modificação genética com os genes repórter luciferase do pirilampo e EGFP, e uma célula de rotulagem directa com a GB MPIO, conduz a uma avaliação precisa de enxertos de células estaminais in vivo.

Para a rotulagem de partícula de CTMMO, o tamanho de partícula GB MPIO (1.63μm) em combinação com a superfície aniónico (substitutos carboxilo) é sugerido para facilitar a absorção endocítica destas partículas por células fagocíticas ^não-16-18. No entanto, deve ser mencionado que o tempo de incubação para obter eficiência de marcação elevada é tipo de célula dependente. Por exemplo, as células fagocitárias (como macrófagos e células dendríticas) são capazes de internalizar estas partículas mais rapidamente (tempo de incubação de 0,5-1 hr), em comparação com os tipos de células não-phaghocytic (como células-tronco CTMMO ou neural), que têm um tempo de incubação de 16 hr mínimo para rotulagem eficiente. Isso precisa ser levado em conta durante a execução de experimentos com células de rotulagem e de eficiência de rotulagem devem ser sempre determinadas com antecedência usando a microscopia de fluorescência e / ou análise por citometria de fluxo. Como etiquetagem de populações de células com GB MPIOs não influencia a viabilidade celular, proliferação celular ou fenótipo de célula ^5, a combinação de óxido de ferro e um fluoróforo nessas partículas, por conseguinte, cria uma oportunidade ideal para visualizar os dois por imagem ressonância magnética e óptica. Além disso, devido ao elevado teor de ferro e tamanho de partícula grande, as partículas MPIO pode ser usado para única célula ^12,19,20 e de imagem única partícula ²¹ por MRI. Isto é extremamente interessante quando se trata de estudar a migração de células como as células individuais podem ser observadas. No entanto, o elevado teor de ferro do utilizado GB MPIOpartículas tem também algumas desvantagens quando com o objetivo de delinear o tamanho exato do local do enxerto por ressonância magnética. O teor de ferro muito elevado de MPIOs não só cria inomogeneidades magnéticos no local do implante, mas também na envolvente do implante celular, resultando em um superestimação do volume local do implante e um discriminação menos precisa entre as células implantadas eo tecido circundante. Por conseguinte, o tipo de partícula, necessária para marcação celular, dependerá do desenho do estudo. Quando com o objetivo de determinar a migração de células-tronco, uma sensibilidade muito elevada e, portanto, de ferro contendo MPIOs serão necessários. Por outro lado, quando se pretende para a localização precisa de enxertos de células estaminais, SPIOs menores com um menor teor de ferro pode ser uma alternativa preferível ^22. Além disso, as partículas de ferro gerar contraste negativo introduzindo um outro problema relativo à discriminação entre células implantadas e sangrando celular após enxertia. Portanto, muita pesquisa está acontecendoem direcção à utilização de agentes de contraste positivo para marcação celular. Em seguida para o tipo de partículas, o tipo de sequência utilizada para a aquisição RM também depende do objectivo do estudo. Quando MRI é usado para delinear o implante para se obter informação precisa sobre a localização do implante e do volume do implante, a sequência T2 (spin echo) é favorável uma vez que fornece informação anatómica com alta precisão. Por outro lado, a sequência T2 * (gradiente de eco) é uma sequência utilizada para estudar eventual migração de células enxertadas como esta sequência tem em conta todas as heterogeneidades do campo magnético tornando uma maior sensibilidade em relação a compostos que influenciam o campo magnético. Esta sequência é absolutamente necessário, quando se trata para a detecção de uma pequena quantidade de células que podem ter migrado para fora da região implantado. Usando esta sequência fomos capazes de concluir que as células BMSC-Luc/eGFP não migram após o implante do estriado no SNC de ratos.

EnquantoMRI fornece dados sobre a localização do implante de células, análise BLI adicional fornece dados sobre a sobrevivência da célula implante ^2,4,11. À medida que a reacção enzimática entre a enzima luciferase e da luciferina substrato necessita da presença de O ₂ e ATP, é uma técnica de confiança para estudar a sobrevivência celular. Células necróticas não irá expressar a enzima luciferase e não de O ₂ e ATP estará presente. Além disso, apenas as células que expressam a enzima luciferase é capaz de catalisar a reacção, resultando na produção de luz, que se assemelha a alta sensibilidade da técnica. BLI pode ser realizada de uma forma quantitativa, porque a quantidade de luz produzida é proporcional com a quantidade de luciferase-expressando células. No entanto, considerações importantes precisam de ser tomadas em consideração ao executar BLI quantitativamente como vários factores diferentes quantidades de células pode influenciar o nível de expressão de luciferase ou a quantidade de luz detectada. Por exemplo, anesthesium nível pode influenciar a enzima luciferase e / ou a disponibilidade luciferina ^23, diferentes factores e compostos podem influenciar a disponibilidade do substrato e / ou actividade absorção ^24-26 ou ^27-30 promotor, resultando em diferenças de saída de sinal. Além disso, a utilização de BLI está limitado a pequenos animais como a técnica é restrita a penetração nos tecidos baixo de luz. Por conseguinte, quando se pretende realizar BLI quantitativa para acompanhar a sobrevivência da célula após o transplante, todos os parâmetros possivelmente influenciando as variações de sinal devem ser mantidos como padrão quanto possível. Por exemplo, a profundidade implantação de enxertos celulares, anestesia e via de administração de nível / quantidade de substrato administrado antes da aquisição BLI, de corte adequado da pele do animal, etc

Tendo em conta o acima descritos vantagens e desvantagens de imagem molecular, os resultados obtidos sempre precisam ser validados por análise histológica. Nisto varionos fenótipos celulares e interações celulares entre diferentes tipos de células podem ser visualizados com maior sensibilidade pós-mortem. Apesar do facto de que esta técnica é a ferramenta de validação de escolha, a presença de fluorescência de fundo criado por células inflamatórias em torno e / ou invasão do local do enxerto deve ser considerado, como isso pode levar a resultados falsos positivos. No entanto, a utilização de um sistema de rotulagem dupla com um gene repórter fluorescente, tal como EGFP, e de uma sonda fluorescente, tal como GB MPIO, reduz a possibilidade de erros de identificação (isto é, as células enxertadas deve exibir ambas as fluorescências específicas, sem exibir a fluorescência de fundo em luz irrelevante canais).

Resumindo, enquanto BLI é uma técnica única para controlar a sobrevivência das células em vez de uma forma quantitativa com a sensibilidade muito elevada, mas de baixa resolução, a MRI é a técnica de escolha para superar a baixa resolução obtida com BLI. Combinação destes in vivo técquestão torna informação suficiente sobre a sobrevivência e localização das células enxertadas in vivo de uma forma não-invasiva. Finalmente, as interacções celulares com enxerto de tecido circundante e / ou endógenos células inflamatórias pode ser facilmente monitorado post mortem usando histologia. Embora, no momento, este último ainda precisa ser feito por análise histológica, os principais desafios para o futuro é melhorar a existente nas modalidades in vivo de imagem molecular para permitir a avaliação em tempo real dos parâmetros com resolução semelhante e sensibilidade obtidos utilizando análise histológica.