Oprensning og visualisering af lipopolysaccharid fra Gram-negative bakterier ved varm vandig-phenolekstraktion

Summary

Vi beskriver en modificeret varm vandig ekstraktion med phenol fremgangsmåde til oprensning af lipopolysaccharid (LPS) fra gramnegative bakterier. Når først ekstraheres, kan de LPS efterfølgende analyseret ved SDS-PAGE og visualiseret ved direkte farvning eller Western immunoblot.

Abstract

Lipopolysaccharid (LPS) er en vigtig bestanddel af Gram-negative bakterielle ydre membraner. Det er et tredelt molekyle bestående af lipid A, der er indlejret i den ydre membran, en kerne oligosaccharid og gentagelse O-antigen-enheder, som strækker sig udad fra overfladen af cellen ^{1, 2.} LPS er en immundominant molekyle, som er vigtig for virulens og patogenesen af mange bakteriearter, herunder Pseudomonas aeruginosa, Salmonella-arter, og Escherichia coli ^3-5, og forskelle i LPS O antigen-præparat danner grundlaget for serotypning af stammer. LPS er involveret i binding til værtsceller ved initiering af infektionen og giver beskyttelse af komplement-medieret drab; stammer, som mangler LPS kan dæmpes for virulens ^6-8. Af disse grunde er det vigtigt at visualisere LPS, især fra kliniske isolater. Visualisering LPS båndmønstre og anerkendelse af specifik enntibodies kan være nyttige værktøjer til at identificere stamme slægter og at karakterisere de forskellige mutanter.

I denne rapport beskriver vi en varm vandig phenol fremgangsmåde til isolering og oprensning af LPS fra Gram-negative bakterielle celler. Denne protokol muliggør ekstraktion af LPS væk fra nukleinsyrer og proteiner, der kan interferere med visualisering af LPS, der forekommer med kortere og mindre intensive ekstraktionsmetoder ^9. LPS fremstillet på denne måde kan adskilles ved natriumdodecylsulfat (SDS)-polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) og direkte farvet med carbohydrat / glycoprotein pletter eller faste sølvfarvning metoder. Mange anti-sera til LPS indeholde antistoffer, som krydsreagerer med ydre membran-proteiner eller andre antigene mål, som kan hæmme reaktivitet blev observeret efter Western immunoblot af SDS-PAGE-separerede rå cellelysater. Proteasebehandling af rå cellelysater alene ikke altid en effektiv måde at fjerne dennebaggrund ved hjælp af denne eller andre visualisering metoder. Yderligere kan store proteasebehandling i et forsøg på at fjerne denne baggrund føre til dårlig kvalitet LPS, som ikke kan løses ved enhver af de førnævnte fremgangsmåder. Af disse grunde mener vi, at følgende protokol, tilpasset fra Westpahl og Jann ^10, er ideel til LPS ekstraktion.

Protocol

1. Fremstillinq af bakterier til LPS Ekstraktion

1. Begynder en overnatskultur i 5 ml Luria Broth (LB), suppleret med antibiotika, hvis nødvendigt. Vokser kultur natten over (12-18 timer) i en rysteinkubator ved 37 ° C og 200 rpm.
2. Fortynd kulturen 1:10 med LB og tage _en OD600 aflæsning i et spektrofotometer. Baseret på _OD600 aflæsning, en 1,5 ml suspension af Deres bakterier gør en _OD600 på 0,5.
3. Pellets af bakterier i en mikrocentrifuge ved 10.600 x g i 10 minutter. Fjern og kassér supernatanten. Pelleten kan opbevares ved -20 ° C, hvis LPS ikke vil blive ekstraheres øjeblikkeligt.

2. Ekstraktion af LPS

1. Første fremstille 2x SDS-buffer. Foretag en 50 ml opløsning af 4% β-mercaptoethanol (BME), 4% SDS og 20% ​​glycerol i 0,1 M Tris-HCI, pH 6,8. Tilsæt en knivspids af bromphenolblåt at farve løsningen. Lav en 1x SDS-buffer lager ved fortynding 2X stock 1:01 i sterilt destilleret _H2O Dette kan opbevares ved stuetemperatur.
2. Har tre separate 10 mg / ml opløsninger af DNase I, RNase og proteinase K i sterilt destilleret _H2O
3. Resuspendere de pelleterede bakterierne fra trin 1.3 i 200 pi 1x SDS-buffer. Sikre, at pelleten er fuldstændig resuspenderes ved pipettering af opløsningen langsomt op og ned. Må ikke vortex.
4. Kog suspenderet bakterier i et vandbad i 15 minutter. Lad opløsningen afkøle ved stuetemperatur i 15 minutter.
5. Tilsættes 5 ul af både DNase og RNase opløsninger fremstillet i 2,2. Inkuber prøverne ved 37 ° C i 30 minutter. * Dette trin er valgfrit, der er minimal forskel i kvaliteten af ​​LPS mellem nuklease-behandlede og ubehandlede prøver.
6. Tilsættes 10 ul af proteinase K-opløsning fremstilles i 2.2. Inkuber prøverne ved 59 ° C i 3 timer. Dette trin kan udføres natten over, hvis der er tidsbegrænsninger.
7. Til hver prøve, add 200 pi iskold Tris-mættet phenol (vand-mættet phenol kan anvendes som en erstatning, hvis Tris-mættet phenol ikke er tilgængelig). Sikre hætterne på rørene er lukket tæt, og vortex hver prøve til cirka 5 til 10 sekunder.
8. Inkuber prøverne ved 65 ° C i 15 minutter, vortexbehandling lejlighedsvis. Efter inkubering afkøles til stuetemperatur, tilsæt derefter 1 ml stuetemperatur diethylether til hver prøve og vortex i 5 til 10 sekunder. Sørg for at udføre håndtag ether i et stinkskab, som det er flygtigt.
9. Centrifugeres prøverne ved 20.600 x g i 10 minutter. Fjern forsigtigt prøver fra centrifugen og udtrække det nederste blå lag. Vær sikker på at undgå det øverste, klare lag. Efterlader en lille mængde af den blå lag er at foretrække frem for kontaminering med det øvre lag.
10. Gen-udpakke prøver ved at gentage trin fra 2,7 til 2,9. To ekstraktioner er normalt tilstrækkelig. Hvis prøverne synes uklar, kan mere ekstraktioner være performed.. Tilsæt 200 pi 2 x SDS-buffer til hver af de ekstraherede prøver før adskillelse ved SDS-PAGE. Kan køres på 8% -15% SDS-polyacrylamidgeler. Fem til femten pi LPS fremstillet ved denne metode er sædvanligvis tilstrækkelig til visualisering.

3. Repræsentative resultater

LPS prøver fremstillet som ovenfor, kan visualiseres ved direkte farvning efter separation ved SDS-PAGE under anvendelse af en standard sølvfarvningsteknikken protokol eller et kommercielt tilgængeligt LPS farvning kit. Alternativt kan LPS separeret på en polyacrylamidgel overføres til en nitrocellulose-membran og underkastet Western immunoblotting under anvendelse af LPS-specifikke anti-sera. For denne protokol, brugte vi Pro-Q Emerald 300 Lipopolysaccharid Gel Stain Kit (Molecular Probes), og fulgte producentens anvisninger.

Vist i figur 1 er et Pro-Q Emerald 300 farvet 12% SDS-polyacrylamidgel. Hver bane indeholder 15 pi LPS fremstillet ud fra forskelskellige stammer af Burkholderia dolosa isoleret fra spyt prøver af patienter med cystisk fibrose. Forskellige LPS banding stige mønstre, reflekterende forskellige numre O-antigen gentagne enheder bundet til kernen oligosaccharid, er indlysende ved hjælp af denne fremgangsmåde, for eksempel har prøver i bane 1 og 6 lignende båndmønstre til hinanden (indrammet i rødt).

Figur 1. Pro-Q Emerald 300 farvede LPS fra Burkholderia dolosa kliniske isolater. LPS fra syv B. dolosa stammer fra et udbrud i cystisk fibrose patienter blev isoleret som beskrevet i denne protokol. Femten ul blev separeret på en 12% SDS-polyacrylamid-gel og farvet med Pro-Q Emerald 300, ifølge producentens instruktioner. LPS kerne er angivet af en pil, og LPS viser lignende båndmønstre af O-antigen gentagelser er indrammet i rødt. M = molekylvægtmarkør.

Discussion

Vi har beskrevet en fremgangsmåde til oprensning af LPS fra andre cellulære bestanddele, herunder nukleinsyrer og proteiner. Denne fremgangsmåde tilvejebringer høj kvalitet LPS, som kan anvendes i en række forskellige visualisering metoder, herunder carbohydrat farvning af SDS-PAGE-geler, som vist i figur 1. Denne fremgangsmåde kan anvendes til serotype LPS fra forskellige stammer ved anvendelse af specifikke anti-sera, eller at vise slægtskab mellem isolater ved direkte visualisering. For eksempel fra en nylig genom hele sekventering projekt i kombination med LPS karakterisering et udbrud af B. dolosa førte til opdagelsen af en enkelt nukleotidpolymorfisme (SNP), som korrelerer med tilstedeværelsen og fraværet af LPS i disse stammer ^11. Vi mener, at denne metode er at foretrække frem proteasebehandling af hele cellelysater beskrevet af Hitchcock og Brown ^9, da det er en forholdsvis hurtig, men streng nok til opnåelse af høj kvalitet LPS til yderligere analysesek.

Mens vi kun viser et eksempel ved hjælp af Burkholderia dolosa, kan denne protokol kan tilpasses til andre Gram-negative arter også. Vi har med succes brugt denne protokol til at udtrække og visualisere LPS fra andre Burkholderia spp., Escherichia coli, Helicobacter pylori, Pseudomonas aeruginosa og Salmonella spp. Hvis protokollen resulterer i ringe eller ingen LPS udbytte, kan det være, at LPS fraktionerer til et andet lag i ekstraktionstrin, 2,7-2,9. For at løse dette problem, gentage protokollen og gemme en prøve af hvert lag under udvinding trin, kan disse visualiseres ved farvning af en SDS-PAGE gel med henblik på at fastslå, hvor LPS fraktionerer, og protokollen kan ændres i overensstemmelse hermed. Det skal også bemærkes, at denne protokol, mens ideel til analytiske formål, ikke giver LPS, der er passende for andre applikationer, såsom strukturelle analyser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DNase I recombinant, RNase-free	Roche Group	04716728001
RNase A	Roche Group	10109169001
Proteinase K	Fisher Scientific	BP1700
Tris-Saturated Phenol	Fisher Scientific	BP1750-100
Diethyl Ether	Thomas Scientific	C313K31
Pro-Q Emerald 300 Lipopolysaccharide Gel Stain Kit	Molecular Probes, Life Technologies	P20495