Summary
خلايا الكبد الأولية توفير أداة قيمة لتقييم البيوكيميائية، وظائف الجزيئية، والتمثيل الغذائي في نظام تجريبي ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. وصفنا بروتوكول موثوق لفأر في تروية الكبد الموقع، الذي يولد باستمرار خلايا الكبد قادرة على البقاء حتى to1.0 × 10
Abstract
الابتدائية ثقافة الكبدية هو أداة قيمة التي استخدمت على نطاق واسع في مجال البحوث الأساسية من وظائف الكبد، والأمراض، الفيزيولوجيا المرضية الصيدلة، والمواضيع الأخرى ذات الصلة. قدم للمرة الأولى في طريقة تقوم على نضح كولاجيناز من خطوتين لعزل خلايا الكبد سليمة من قبل بري وصديق في عام 1969 (1) ومنذ ذلك الحين، شهدت العديد من التعديلات. وقد وصفت هذه التقنية الأكثر استخداما من قبل Seglenin 1976 2. في الأساس، هي خلايا الكبد فصلها عن الجرذان الكبار تخدير عن طريق نضح كولاجيناز عدم اعادة توزيع من خلال الوريد البابي. ثم يتم تصفية الخلايا المعزولة من خلال 100 ميكرون فلتر حجم المسام شبكة النايلون، وتربيتها على لوحات. بعد 4 ساعات والثقافة، ويتم استبدال المتوسطة مع المتوسطة المحتوية على مصل أو مصل الحرة، على سبيل المثال HepatoZYME-SFM، لمزيد من الوقت لثقافة. هذه الإجراءات تتطلب خطوات ثقافة الجراحية والعقيمة التي يمكن البرهنة على نحو أفضل عن طريق الفيديو من قبل النص. Hيحرث، ونحن توثيق خطوات مفصلة لهذه الإجراءات من قبل كل من الفيديو وبروتوكول مكتوب، والتي تسمح باستمرار في توليد خلايا الكبد قادرة على البقاء في أعداد كبيرة.
Protocol
1. إعداد
وتعد طازجة جميع المخازن باستخدام تقنية معقمة وتصفية تعقيمها باستخدام فلتر كورنينج 0.22 ميكرون.
- إعداد الإرواء العازلة أنا من خلال إضافة ما يلي إلى الحل هانك في سولت المتوازن (HBSS، دون كا 2 + والمغنيسيوم 2 +، انظر الجدول 1): 2 ملغ + (MgCl 2) إلى 0.9 مم، EDTA إلى 0.5 ملم، وHEPES إلى 25 ملي.
- إعداد الإرواء الثاني عازلة عن طريق إضافة التالية إلى HBSS (مع الكالسيوم والمغنيسيوم 2 + 2 +، انظر الجدول 1): HEPES إلى 25 ملم.
- إعداد الإرواء الثاني العازلة زائد collagenaseII: ذوب كولاجيناز الثاني (1000 U) مع 300 مل الإرواء العازلة الثاني والحفاظ على حل الحار في حمام الماء قبل التروية. وينبغي استخدام هذا الحل في غضون 30 دقيقة وذلك لأن النشاط الثاني كولاجيناز انخفضت مع الوقت.
- إعداد متوسطة وليام الكامل: أضف ما يليإلى E ويليامز المتوسطة: L-الجلوتامين إلى 2 مم، الجنين مصل بقري (FBS) إلى 5٪؛ الأنسولين إلى 100 نانومتر، ديكساميثازون إلى 100 نانومتر، البنسلين إلى 100 وحدة دولية / مل والستربتوميسين إلى 100 ملغ / مل.
- وينبغي أن تكون درجة حرارة هذه المخازن المؤقتة لمدة 30 دقيقة في حمام ماء في 42 درجة مئوية، وهي درجة الحرارة المثلى المقابلة لدرجة حرارة مخرج في قنية من 37 درجة مئوية.
2. الإرواء الفئران لعزل الكبد
- نظام نضح يتكون من مضخة وأنابيب silastic autoclavable وحمام المياه (انظر الشكل 1). مسبقا تعيين معدل التدفق للمضخة نضح تحوي على 10 مل / دقيقة.
- 1 تخدير الفئران البالغة (300 وزن الجسم ز) مع الكيتامين (IP) داخل الصفاق (87 من وزن الجسم ملغ / كلغ) زائد زيلازين (13 ملغ / كلغ). وينبغي رصد عمق التخدير بواسطة قرصة اصبع القدم. عندما الفأر لم يعد يستجيب لتحفيز الضارة، حلاقة الشعر في البطن والإعدادية في البطن مع betadine والايثانول. ادخل من خلال شق خط الوسط.
- فضحفي الوريد البابي الكبدي عن طريق نقل بعناية الأحشاء إلى الخارج حق من تجويف البطن، وإدراج angiocath 18-قياس في الوريد البابي الكبدي (انظر الشكل 1).
- توصيل أنابيب سائل الإرواء إلى إبرة والشروع في ضخ في الوضع الطبيعي بمعدل تدفق منخفض (10 مل / دقيقة) مع (37 درجة مئوية) ما قبل حرارة الواق الإرواء أنا.
- إذا أجريت بشكل صحيح، وينبغي أن تبدأ على الفور في الكبد في تبييض. بمجرد تأكيد إقناء؛ إدخال القنية ناجحة، وجعل قطع في الوريد الأجوف السفلي (IVC) للسماح للهروب رأس المال (الشكل 1). يمكن إجراء اختبار آخر لإقناء؛ إدخال القنية ناجحة من خلال تطبيق ضغط خفيف مع مسحة معقمة على IVC؛ جميع فصوص الكبد يجب ان تبدأ بسرعة إلى تضخم.
- زيادة معدل تدفق إلى 25 مل / دقيقة. وينبغي أن الكبد أصبح شاحب اللون.
- تبديل حل نضح إلى العازلة الإرواء الثاني الثاني كولاجيناز زائد مع أي انقطاع في تدفق للحصول على 6 دقائق إضافية. <لى> دوري (5-10 مرات خلال الهضم) الضغط مع مسحة إلى IVC لمدة 5 الثانية وفترات. وسوف تضخم في الكبد، مما يؤدي إلى زيادة تفكك خلية الكبد، في المقابل خفض مجموع وقت الهضم، وزيادة العائد النهائي.
- بعد نضح كولاجيناز، ينبغي أن نبدأ في النظر الكبد طري. تشريح الكبد مجانا، مكان في كوب قبل مبرد العقيمة مع متوسط مل وليام البالغ عددها 20 كاملة، ومن ثم أخذه إلى خلية الأنسجة ثقافة غطاء محرك السيارة.
3. الكبدية زنزانة انفرادية
- داخل الخلية غطاء محرك السيارة والثقافة، واستخدام مكشطة خلية لتفريق بلطف الخلايا في متوسطة وليام كاملة داخل طبق بتري معقمة.
- تصفية تشتت الخلية من خلال 100 ميكرون مسام حجم مصفاة خلية في أنبوب مخروطية 50 مل من أجل إزالة الأنسجة الضامة وشظايا الأنسجة غير مهضوم.
- تعليق الخلايا في متوسطة مل وليام ال 40 كاملة وأجهزة الطرد المركزي في 50 XG لمدة 3 دقائق في درجة مئوية 4
- نضح طاف، وبلطف اعادة تعليق الخلايا في متوسطة 40 مل الباردة وليام الكامل لغسل الخلايا. كرر الطرد المركزي.
- نضح طاف، وبلطف اعادة تعليق الخلايا مع متوسط مل وليام ال 25 كاملة. إضافة 25 مل حل Percoll 90٪ في برنامج تلفزيوني في أنبوب وتخلط بلطف.
- الطرد المركزي في 200 XG لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. نضح الخلايا الميتة من أعلى التدرج لأن خلايا قابلة للحياة لا تزال في الجزء السفلي من التدرج Percoll.
- تعليق بيليه الخلية في 30 مل متوسطة وليام الحارة كاملة، ثم كرر الطرد المركزي وإعادة تعليق بيليه الخلية في 20 مل متوسطة وليام الحارة كاملة.
- عد الخلايا في تعليق خلية باستخدام عدادة الكريات وتحديد بقاء الخلية بواسطة تلوين أزرق التريبان.
4. الكبدية الثقافة
- تمييع الخلايا مع متوسط وليام دافئ الكامل لتركيز المفضلة، على سبيل المثال 2.5 × 10 5 خلية / مل. لوحة الخلايا في حجم المطلوب على لوحات ثقافة الخلية، على سبيل المثال. 5 × 10 5 خلية / 2 مل / جيد، 6 آبار / لوحة، أو 2.5 × 10 5 خلية / مل 1.5 / جيد، و 12 بئرا / لوحة. الأمم المتحدة المغلفة لوحة على ما يرام لزراعة الخلايا الكبدية.
- في الإعدادية النموذجية مع الخلايا> 85٪ قابلة للحياة، يجب أن كثافة الخلية تصل إلى حوالي 60-70٪ التقاء، والذي يسمح للخلية خلية الاتصال مع الحفاظ على مساحة كافية لخلايا الكبد في النمو إلى حجمها خلية كاملة وتسفر عن التقاء النهائي 90-95٪.
- من أجل تشكيل لأحادي الطبقة حتى من خلايا الكبد، وبعبارة أخرى، للحد من ميل للخلايا لتجميع في المنطقة الوسطى من البئر (على الأرجح نتيجة لتدفق الهواء داخل الحاضنة من الخلية)، والسماح لوحات على البقاء داخل هود ثقافة خلية لمدة 30 دقيقة قبل وضعها في الحاضنة.
- ثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو مرطب للهواء 95٪ و 5٪ CO 2. بعد 4 ساعات والثقافة، ويمكن للخلايا لا تزال إما في المتوسط مصل الدم المحتوية على نفسه أو استبدال المتوسطة مع F-المصلمتوسطة العناصر الأرضية النادرة، على سبيل المثال HepatoZYME-SFM (انظر الجدول 1). وسيلة خالية من مصل يساعد على الحفاظ على التشكل الخلية مع عدم وجود آثار ضارة من الهرمونات عند استخدام وسيلة خالية من المصل.
- السماح للخلايا من الانتعاش والنمو على الأقل خلال الليل قبل التجريب. من المستحسن استخدام الخلايا لاختبار في غضون 24 ساعة، لأن هذا قد يساعد في الحفاظ على وظيفة من الانزيمات الهامة (على سبيل المثال، P450s).
- استبدال متوسط النمو على فترات اليوم 2، إذا لزم الأمر.
5. ممثل النتائج
ووصف الظروف توليد بانتظام المحاصيل خلية من خلايا 1،0 10 8 س في إعداد من كبد الفئران واحد. وكانت صلاحية خلايا الكبد التي تقاس استبعاد أزرق التريبان باستمرار ضمن نطاق من 88 ~ 96٪.
كما هو مبين في الشكل 2، وخلايا الكبد والكلي كتلة شكل بعد البذر ساعة 4. معظم الخلايا المعزولة تتسطح وانتشرت في نمو أحادي الطبقة نموذجي . قبل 24 ساعة، وتحدد حواف الخلايا، سطح الخلايا على نحو سلس إلى حد ما، وقطرات دهن مرئية. هذه الخلايا لديها 1-3 نويات، والتي هي الجولة، التي تقع في مركز للخلايا، وحجم العرض نوى متسقة بين الخلايا (الشكل 2).
الشكل 1. رسم تخطيطي من نضح الكبد. يتم إدراج angiocath 18-قياس في الوريد البابي للكبد، متصلا ثم أنابيب سائل الإرواء إلى الإبرة. بمجرد تأكيد إقناء؛ إدخال القنية ناجحة، وجعل قطع في الوريد الأجوف السفلي (IVC) للسماح للهروب رأس المال.
الشكل 2. الصرف من خلايا الكبد مثقف على مر الزمن (4 ساعة إلى 24 ساعة)، والعاشر التكبير 200. بعد تربيتها لمدة 24 ساعة، والخلايا المنتشرة في نمو أحادي الطبقة نموذجي، وتقاطعات بين الخلايا هي الخطية.
| اسم كاشف | شركة | فهرس العدد |
| HBSS (دون كا 2 +، والمغنيسيوم 2 +) | إينفيتروجن | 14174 |
| HBSS (مع كا 2 +، والمغنيسيوم 2 +) | إينفيتروجن | 14025 |
| وليامز E متوسطة | إينفيتروجن | 12551-032 |
| Collegenase الثاني | ورثينجتون | LS004176 |
| خلية مصفاة (100 ميكرون) | دينار بحريني | 352360 |
| HepatoZYME-SFM | إينفيتروجن | 17705 |
| Percoll | سيغما | P4937 |
| Angiocath (18 عيار) | دينار بحريني | 381705 |
الجدول رقم 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ثقافة الرئيسي للخلايا الكبد هو نموذج في المختبر تستخدم على نطاق واسع لدراسة جوانب مختلفة من علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض في الكبد. على سبيل المثال، يتم استخدام الثقافة الأولية لتقييم التعبير وظيفة الإنزيمات المخدرات التأييض بما في ذلك السيتوكرومات P450، والتمثيل الغذائي للمخدرات، وتفاعلات العقاقير المخدرات، وآليات السمسة والسمية الجينية 3-7. ويتم تكييف البروتوكول وصف العزلة والثقافة في الخلايا الكبدية الفئران من التقارير السابقة من أيكن وآخرون. 8، وغيرها من 2،9،10 مع بعض التعديلات. ووصف الظروف تولد باستمرار خلايا الكبد قادرة على البقاء حتى الى 1.0 X 10 8 خلايا في إعداد مع بقاء الخلية بين 88 ~ 96٪. وفيما يلي الخطوات الحاسمة الأخرى:
- كما هو الحال مع أي بروتوكول يصف ثقافة الخلية، فإن الجانب الأكثر أهمية هو لتجنب التلوث من مسببات الأمراض البكتيرية أو الفطرية باستخدام تقنيات التعقيم الدقيق 11.
- جسيم رابط، المعروف أيضا باسم الملتصقة البقعة، هو بنية خلية متخصصة للخلية الى خلية التصاق. سلامة جسيم رابط يتطلب الكالسيوم، ويتم تقسيمها بواسطة EDTA وسائل الإعلام خالية من الكالسيوم. لا يمكن للكولاجيناز الانزيمات فصل في جسيم رابط، مما أدى إلى عزل الخلايا الكبدية. ولذلك، نضح يستخدم كا 2 + المتوسطة حرة وكاليفورنيا في وقت لاحق 2 + المتوسطة الغنية التي تحتوي على الكالسيوم 2 + كولاجيناز التابعة، لعملية الهضم.
- والعلاج الملائم كولاجيناز أمر جوهري للغاية لإعداد الكبدية. ينبغي إبقاء معدل تدفق الثاني Perfussion العازلة الثاني collegenase زائد في 25 مل / دقيقة. الأسباب الشائعة للثقافة الكبدية غير ناجحة ما يلي: 1) خلية الفقراء التفكك، والتي قد تكون راجعة إلى مخازن نضح حرارة غير ملائمة إلى 37 درجة مئوية و / أو بطء سرعة نضح؛ موت الخلايا و 2)، والذي قد يزيد عدد الجياعد يكون نتيجة لهضم كولاجيناز المفرطة.
- توخي الحذر عند تغيير وسائل الاعلام بعد ان ثقافة 4-H الأولى، كما في خلايا الكبد لا تزال هشة نسبيا ويمكن أن تتلف بسهولة أو تعطلت عن طريق الاتصال المباشر؛ ماصة فقط في جانب من البئر، وأبدا مباشرة على الجزء العلوي من الخلايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر السيد جوش Basford والدكتور لى شياو مين لتقديم المساعدة التقنية. وأيد هذا العمل في جزء من منح المعاهد الوطنية للصحة (DK70992 وDK92779 إلى ML).
References
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. J. Cell Biol. 43, 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).
- Saito, K., Kobayashi, K., Mizuno, Y., Fukuchi, Y., Furihata, T., Chiba, K., Schmidt, M., Schmitz, H. J., Baumgart, A., Guedon, D. Peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha) agonists induce constitutive androstane receptor (CAR) and cytochrome P450 2B in rat primary hepatocytes. Drug Metab. Pharmacokinet. 25, 108-111 (2010).
- Gomez-Lechon, M. J., Donato, M. T., Castell, J. V., Jover, R. Human hepatocytes in primary culture: the choice to investigate drug metabolism in man. Curr. Drug Metab. 5, 443-462 (2004).
- Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malar. J. 6, 169 (2007).
- Bu, S. Y., Mashek, D. G. Hepatic long-chain acyl-CoA synthetase 5 mediates fatty acid channeling between anabolic and catabolic pathways. J. Lipid Res. 51, 3270-3280 (2010).
- Aiken, J., Cima, L., Schloo, B., Mooney, D., Johnson, L., Langer, R., Vacanti, J. P. Studies in rat liver perfusion for optimal harvest of hepatocytes. J. Pediatr. Surg. 25, 140-144 (1990).
- Jauregui, H. O., McMillan, P. N., Hevey, K., Naik, S. A quantitative analysis of lectin binding to adult rat hepatocyte cell surfaces. In Vitro Cell. 24, 401-412 (1988).
- Klaunig, J. E., Goldblatt, P. J., Hinton, D. E., Lipsky, M. M., Trump, B. F. Mouse liver cell culture. II. Primary culture. In Vitro. 17, 926-934 (1981).
- Hay, R. J. Operator-induced contamination in cell culture systems. Dev. Biol. Stand. 75, 193-204 (1991).
