Summary
Ett strömlinjeformat arbetsflöde för att studera DNA-metylering och genförändringar uttryck vid tidiga liv stress visas. Med utgångspunkt från moderns separation av nyfödda möss och isolering av diskreta hjärnan vävnader, representerar vi ett protokoll för att samtidigt isolera DNA och RNA från stansar hjärnvävnad för efterföljande bisulfit sekvensering och RT-PCR-analys.
Abstract
Exponering för kost, kan droger och tidigt i livet motgångar under känsliga fönster i livet 1,2 leda till varaktiga förändringar i genuttryck som bidrar till visningen av fysiologiska och beteendemässiga fenotyper. Sådan miljö programmering är sannolikt att öka känsligheten för metaboliska och kardiovaskulära och psykiska sjukdomar 3,4.
DNA-metylering och histon modifieringar anses viktiga processer i förmedlingen av genen och miljö dialog och verkar också underlag miljön programmering 5. Hos däggdjur, innefattar DNA-metylering typiskt kovalent addition av en metylgrupp vid 5-positionen av cytosin i samband med CpG-dinukleotider.
CpG metylering sker i en mycket vävnads-och cell-specifikt sätt vilket gör det till en utmaning att studera diskreta, små regioner i hjärnan där cellulära heterogenitet är hög och vävnad antal begränsade. Dessutom because genexpression och metylering nära samband händelser kan ökas värdet uppnås genom att jämföra båda parametrarna i samma prov.
Här är en steg-för-steg-protokollet (figur 1) för undersökning av epigenetiska programmering i hjärnan med hjälp av den "moderliga separation" paradigm tidigt i livet motgångar i illustrativt syfte. Protokollet beskriver framställningen av micropunches från differentiellt åldrade mus hjärnor som DNA och RNA kan samtidigt isoleras, så att DNA-metylering och gen analyser uttryck i samma prov.
Protocol
1. Programmering i början av Life Motgångar
Maternell separation (MS) utförs för att framkalla tidiga liv stress (ELS) i ungar som levererats av tidsbestämd-gravida C57BL/6N möss (postnatal dag 0 (P0) på dag av födelse).
- Individuella kullar placeras i rena burar (med värmedyna) under 3 timmar dagligen P1-10.
- Kontroll (icke-ELS) valpar kvar ostört i moderns boet hela tiden.
- Ungar hålls med sina mödrar fram till avvänjning (P21), varefter de är inrymda i sex-matchade grupper (3-5 möss per bur) under normala boendeförhållanden laboratorium djurens.
2. Isolering och Dissektion av hjärnvävnad
- Möss dödade önskade åldrar genom halshuggning Anm.: Eftersom detta protokoll innebär en stress paradigm, ingen bedövning ges före halshuggning, för att undvika att störa normala fysiologiska regleringen av stresshormoner. Skallar öppnas ochHjärnorna avlägsnades försiktigt och omedelbart snabbfrystes genom nedsänkning i iso-pentan-torr is innan de lagrades vid -80 ° C.
- Hjärnor är cryosectioned (10 | im tjocklek); sektioner är monterade på SuperFrost glasskivor och hölls vid -20 ° C. Hänvisning till en vanlig mus stereotaxisk atlas (t.ex. Paxinos 6) används för att verifiera anatomiska precision och för att säkerställa införandet av regionen av intresse (t.ex. för nervceller i paraventrikulära kärnan - PVN - samla delar med början på nivå rostral PVN, bregma -0,75 till -0,85).
- Sektioner färgas med kresylviolett för att underlätta identifiering av olika hjärnstrukturer. Slag (0,8 mm) av regionerna av intresse (t.ex. PVN) erhålls av i lok mikrodissektion.
3. Nukleinsyra Utsug från Brain stansar
En optimerad protokoll för att samtidigt utvinna DNA och RNA från små neuroanatomically definierade hjärnan regjoner för bisulfit och genuttryck analyser beskrivs 7.
Notera: Med tanke på att RNA är mindre stabilt än DNA i GTC-buffert, rekommenderar vi att behandla RNA först. Homogenatet användes för DNA-rening kan förvaras vid rumstemperatur (RT) under denna tid.
- Homogenisera stansar med en pipett och virvelanordningen i 400 | il av guanidinium-tiocyanat (GTC)-buffert (4,5 M guanidiniumtiocyanat, 2% N-lauroylsarkosin, 50 mM EDTA, pH 8,25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 M beta-merkaptoetanol, 0,2% skumdämpare A) vid RT, som passerar flera gånger genom en injektionsspruta (29 g) (Figur 2).
- Delas lysatet i lika stora delar, både RNA och DNA kan extraheras samtidigt eller separat, beroende på speciella experimentella behov.
- För RNA-rening tillsätt 1/10 volym NaOAc, 1 volym AquaPhenol (Appligene) (pH 4) och 1/2 volym kloroform: isoamylalkohol (24:1) till lysatet. Vortex kraftigt efter varje steg ochinkubera på is under 10 min, centrifugera (20 min vid 10.000 g vid 4 ° C), tillsätt en lika stor volym av 70% EtOH för att aequous fas.
- Överföra blandningen till en RNA-spinn-kolonn (t.ex. Nucleospin RNA II från Macherey-Nagel) och utför i kolonnen DNas-digerering och tvättningssteg (följa tillverkarens protokoll); eluerar RNA i 25 pl H 2 O
- För DNA-rening ett optimerat protokoll för Qiagen DNeasy blod och vävnad Kit används. Jämvikta lysatet med lika stora volymer av buffert AL och 100% EtOH, belastning på en spinnkolonn centrifug (1 min vid 10.000 g vid RT) och kassera genomflöde.
- Tillsätt 500 pl buffert AW1 inklusive 5 il RNas (1 mg / ml) till kolonnen och inkubera 10 minuter vid rumstemperatur. Spinn (1 min vid 10.000 g, RT) och kassera genomflöde.
- Tvätta kolonnen med 500 | il buffert AW2 kasseras genomströmning och centrifugeras tom kolonn (1 min vid 15.000 g).
- Tillsätt förvärmd (70 ° C) buffert AE och inkubera kolonner för 10 minuter vid 70 ° C. Eluera genom centrifugering (1 min, 10.000 g), re-tillämpa genomströmning och upprepa centrifugering steg.
Använda en spektrofotometer för att bestämma DNA-och RNA-koncentrationen. En typisk PVN punch ger ~ 600 ng DNA och ~ 400 ng RNA. För genexpression analys med kvantitativ PCR (qPCR), använder vi typiskt ~ 100 ng RNA i den omvända transkriptionsreaktionen.
4. Bisulfit Omvandling
Natriumbisulfit används för att omvandla icke-metylerade cytosiner för att uraciler. Däremot är denaturerad cytosiner skyddas från omvandling. Därför är alla cytosiner som upptäcks i den slutliga sekvenseringen av bisulfit PCR-amplikonet representerar metylerade cytosiner.
Bisulfit omvandling förorsakar väsentlig DNA-nedbrytning som kan vara en begränsande faktor i PCR-analys. Optimerade reaktionsbetingelser som maximerar cytosin omvandling, minska DNA-fragmentering och bibehålla enkelsträngat DNA och med vid lägre temperaturer kan uppnås med användningQiagens EpiTect bisulfit Kit. I våra händer ~ 200 ng DNA renat från micropunches tillhandahålla en tillräcklig mängd av utgångsmaterialet för bisulfit reaktionen.
För att förhindra skillnader i effektivitet omvandlingsreaktionen, bör mängden DNA-mall hållas konstant mellan alla prover som behandlas under ett experiment. Dessutom läser sekvens bör granskas för att verkningsgraden genom att undersöka graden av icke-omvandlade icke-CpG. Denna ränta bör överstiga 98%. Lägre värden anger ofullständig eller ineffektiv bisulfit omvandling och de underliggande sekvenserna bör undantas från analysen.
5. Bisulfit PCR
- Konstruktion bisulfit sekvensering primrar som är specifika för bisulfitkonverterat DNA (se diskussion); Metyl Primer Express mjukvara ( https://products.appliedbiosystems.com/ab/ Sv / US / adirect / ab? Cmd = catNavigate2 & catid = 602.121) kommer att hjälpa detta och bidra till att fastställa optimala glödgningstemperaturer i pilotförsök.
- Framställa PCR-Master-blandning (för en reaktion) enligt följande:
2,5 pl 10 x PCR-buffert
0,5 | il 10 mM dNTP
1 il 10 | iM framåtriktad primer
1 il 10 nM omvänd primer
0,125 jil Qiagen Hotstart Taq Plus
fylla upp till 23 pl med H2O - Tillsätt 2 pl bisulfit-behandlade DNA till reaktionen.
- Amplifiera användning av följande betingelser:
1 cykel 6 min 95 ° C
45-50 cykler av 1 min 95 ° C, 1 min vid optimala härdningstemperaturen, 1 min 72 ° C
1 cykel 5 min 72 ° C
Analysera 7 pl av PCR-produkten genom elektrofores på agarosgel för att verifiera storleken av amplikon och rena återstående PCR-reaktion för efterföljande ligering med användning av en kommersiellt tillgänglig PCR upprensnings-kit (t ex Macherey-Nagel Nucleospin Extrahera). Om ytterligare oönskade PCR-produkter framställs är gelrening rekommenderas.
6. Bisulfit Sekvensering
Högupplösta DNA metylering-profiler härledda från enstaka klon avläsningar kan upptäcka små förändringar i DNA-metylering och identifiera regulatoriska regioner som är mottagliga för behandling (miljö programmering). Den bisulfit sekvenseringen består av tre på varandra följande arbetssteg. För det första är PCR-produkter erhållna genom tidigare bisulfit PCR ligerades in i en vektor och transformeras in i bakterier. För det andra är koloni-PCR från enkla kloner användes för att bestämma den korrekta storleken av skäret. För det tredje är positiv koloni PCR saneras och utsätts för Big-Dye sekvensering reaktion. Efter en sanering steg, produkter elektrofores på en kapillär sequencer.
6,1 Ligering och transformation
Obs: Vi använder rutinmässigt pGEM-T-vektor cloning kit (Promega). Enligt vår erfarenhet är beroende av kloningseffektiviteten kritiskt på inlägget som skall ligeras. Olika vektorer bör testas vid låga antalet rekombinanta kloner upprepade gånger erhålls.
- Inrättat ligeringsreaktion:
5 | il 2x ligeringsbuffert
1 il pGEM-T-vektor
1 il T4-ligas
3 | il rensade PCR-produkt - Blanda reaktionen genom pipettering och inkubera över natten vid 4 ° C.
Notera: Ligering kan också utföras under 1 h vid RT också. Att öka antalet rekombinanta kloner, över natten ligering vid 4 ° C föredrages.
- Sanering av ligeringsprodukter med etanol nederbörd:
- Tillsätt 1 pl glykogen, 1 | il 3 M NaAc och 25 | il 100% EtOH för att ligeringsreaktionen och fällningen under 1 minut i flytande kväve.
- Centrifug (15,0000 g under 30 min vid 4 ° C) och kasta supernatanten.
- Tvätta med 300 | il70% EtOH och centrifug (15.000 g under 20 min vid 4 ° C), kasta supernatanten och torr pellet vid RT (10 min).
- Återsuspendera pelleten i 10 pl H 2 O
6,2 Omvandling av ligeringsprodukter produkter i elektrokompetenta bakterier
- Förkyla elektroporering kyvetter (1 mm bredd) på is och tina alikvot av elektrokompetenta DH5a bakterier på is.
- Lägg 45 pl DH5a bakterier 10 pl städas upp ligeringsprodukten (se ovan) och transfer till kyvett.
- Transformera bakterier vid 1,5 kV, Ω 200, 15 | iF och tillsätt 1 ml förvärmd SOB-medium direkt efter pulsen leverans.
- Återhämta bakterier under 1 h vid 37 ° C, spred 100 | il av suspensionen på LB / ampicillin-plattor belagda med IPTG / X-Gal.
- Inkubera plattorna över natten vid 37 ° C.
6,3 Colony PCR
Obs: Colony PCR från enstaka kloner genomföras för att säkerställa att insatserna ärav förutsagda storleken. Fördröjd färgutveckling från den blå / vit screening, oönskade rekombinationshändelser händelser under ligering, inkorporering av oligomera primerpar eller trunkerade PCR-produkter kan annars leda till felaktiga sekvensering resultat. Vi använder rutinmässigt T7-och SP6-primers för att amplifiera insättningar klonade; Detta tillvägagångssätt resulterar i ytterligare vektorsekvenser av ca 150 bp. T7-primer används i sekvenseringsreaktionen i ett senare steg.
- Inrättat koloni-PCR reaktionen i 96-brunnars platta. För en reaktion använda:
3 | il 2,5 mM MgCl2
2,5 pl 10 x Taq-buffert
1,5 | il 10 mM dNTP
2 | il 2,5 mM T7-primer
2 ^ 2,5 mM SP6 primer
1 il Fermentas Taq-polymeras
fylla upp till 25 pl med H2O - Dispensera 25 ul / brunn av huvudblandning i varje brunn i en 96-brunnsplatta.
- Välj positiva (vit) klon från plattan med pipett spets och dopp i PCR-reaktionen.
- Amplifiera användning följande villkor:
1 cykel 4 min vid 95 ° C
10 cykler 30 s vid 94 ° C, 30 s vid 56 ° C och 30 s vid 72 ° C
30 cykler 30 s vid 94 ° C, 30 s vid 48 ° C och 30 s vid 72 ° C
1 cykel 5 min vid 72 ° C - Ladda 5 pl av koloni-PCR på en agarosgel och bestämma reaktioner som innehåller den rätta insättningsstorlek.
- Kolonistimulerande PCR innehållande de önskade amplikoner städas upp med användning av ett kommersiellt tillgängligt kit (Machery Nagel Nucleofast).
6,4 Big-Dye terminator reaktion och sekvensering
- Förbered Master Mix för Big-Dye reaktion. För en reaktion använda:
1 | il H2O
0,5 | il Big-färgreagens
1,5 | il buffert Sekvensering - Dispensera 3 pl / brunn i varje brunn i en 96-brunnsplatta, till varje brunn tillsattes 2 | il av saneras koloni-PCR-produkten och kördes reaktionen på en termocykler med följande parametrar: 35 cykler av 10 s vid 96 ° C, 5 s vid 50 ° C och 4 minuter vid 60 ° C
- The Big-Färg reaktion städas upp med ett kommersiellt kit (Millipore Montage 96 Sekvensering Clean-Up Kit) och bearbetas på ett kapillär sequencer (t.ex. ABI 3100 DNA).
- Sekvenser analyseras med hjälp av BIQ Analyzer ( http://biq-analyzer.bioinf.mpi-sb.mpg.de/ ) eller online-verktyget Bisma ( http://biochem.jacobs-university.de/BDPC/BISMA/ ) att härleda metyleringsmönstret för den undersökta DNA-regionen (figur 4).
7. Representativa resultat
För att få insikt i påverkan av ELS på avp uttrycket och metylering status, var C57BL/6N mössen behandlades enligt arbetsflödet ovan beskrivna. I korthet var en grupp C57BL/6N möss subjected till ELS medan kontrollgruppen fick stå ostörd. Den PVN och supraoptiska kärnan (SON) stansades och DNA och RNA isolerades samtidigt från de enskilda slag. RNA transkriberades omvänt och nivåerna av AVP transkript mättes med qPCR analys och normaliserades till uttrycket av HPRT och GAPDH-gener housekeeping. DNA var bisulfit behandlas, amplifieras med primrar som är specifika för AVP förstärkare (Figur 4a) och PCR-produkterna klonades och sekvenserades. Minst 20 rekombinanta kloner från varje mus / PCR analyserades för att bestämma metylering frekvenser för de CpG i det PCR-amplikon (figur 4b). Jämfört med kontroller ELS inducerade en betydande hypometylering på CpG10, CpG12, CpG13 och Cpg14 av avp förstärkare (p <0,05, n = 6-8 djur) antyder epigenetisk märkning av detta reglerande regionen genom tidiga livserfarenheter. I motsats till den PVN, metylering avAVP förstärkaren var opåverkad av ELS i Sonen visar vävnaden specificitet epigenetisk märkning (figur 4c). Analys av DNA-metylering status vid CpG10 och avp genuttryck i kontrolldjur (n = 6) framgår en negativ korrelation pekar på en roll för DNA-metylering i finjustering av AVP genuttryck (Figur 4d).
Figur 1. Micropunches erhålls från dissekerade hjärnor från kontroll-och tidiga liv stressade möss. Efter DNA-och RNA-isolering, är genuttryck bestäms genom QRT-PCR, medan bisulfit behandlade DNA amplifieras och renade produkter klonas i en lämplig vektor som möjliggör identifiering av rekombinanta kloner genom blå / vit selektion. Korrekta insats storlekar kontrolleras avkoloni-PCR före utförandet Big Dye-reaktion och behandling på ett kapillär-sekvenserare. Metylering mönster visualiseras med lämpliga programverktyg. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. Tidslinjen från DNA / RNA-extraktion till bisulfit-sekvensering.
Figur 3. Arbetsflöde för samtidig extraktion av DNA och RNA. Stansen av hypotalamuskärna paraventricularis, en liten avp gen som uttrycker hjärnregion, placeras i 400 | il GTA buffert, virvlades tills sönderdelas och vidare homogeniseras genom att passera genom en spruta (29 g). Homogenatet delas sedan för rening av RNA och DNA. Uppdelningen kan vara 1:1 eller olika proportioner beroendepå den speciella experimentella fråga. Homogenat bör behandlas inom några timmar.
Figur 4. CpG-metylering vid avp-lokuset i 6 veckor gamla kontroll och ELS djur. (A) ordning för AVP och oxytocin gener orienterad svans till svans och åtskilda av intergenregionen (IGR). Exoner visas med ofyllda (numrerad) lådor. Fördelningen av CpG rester indikeras och storleken och placeringen av de respektive PCR-amplikon som innehåller CpG-10 till CpG14 markeras av en tjock linje. (B) Metylering av AVP förbättrare i PVN i kontrolldjur och ELS djur (n = 6-8). (C) Metylering av AVP förbättrare i SON i kontroll och ELS djur (n = 8-10). (D) avp-genexpression korreleradesmed metylering vid CpG10 (n = 6). Klicka här för att visa en större bild .
Discussion
Epigenetisk programmering alltmer som en viktig mekanism bakom hälsa och sjukdom. Här presenterar vi en förfinad metod för samtidig isolering av DNA och RNA från micropunches och de efterföljande åtgärder för att få DNA-profiler metylering genom bisulfit sekvensering. Den optimerat arbetsflöde möjliggör bekväm analys av epigenetisk programmering i hjärnan som svar på stimuli från omgivningen. Dessutom underlättar detta tillvägagångssätt utredningen av det funktionella sambandet mellan DNA-metylering och genuttryck som både analyseras från samma prov. Slutligen kan antalet djur som behövs för försöket att minska avsevärt.
Vissa försiktighetsåtgärder och riktlinjer ska följas när de utför den presenterade arbetsflödet. Överväger den mycket komplicerade och heterogenitet av hjärnan och sedan metylering och uttrycksmönster kan variera i en cell-och vävnads-specifikt sätt är det av ytterstavikt att micropunching utförs på ett standardiserat sätt. Som ett typexempel är epigenetisk programmering av avp detekteras i paravaventriuclar, men inte i supraoptiska kärnan (Figur 4b-d), två avp uttrycker områden i hypotalamus 4. I detta avseende är tillgången på DNA och RNA från samma vävnad punch fördelaktigt eftersom RNA uttryck för vissa vävnadstyper specifika markörgener kan användas i vissa fall intyga att rätt område stansades. Även micropunching kan minska cellulär heterogenitet, måste det komma ihåg att detta tillvägagångssätt inte leder till isolering av enskilda celltyper eller populationer. Ytterligare reningssteg kan anses att ta itu med detta ämne.
För bisulfit sekvensering optimal primer design för PCR-amplifiering efter sulfit behandling är nödvändig. PCR-produkter som överstiger 400 bp i längd kan vara problematisk på grund av nedbrytning av DNA genom b.isulfite behandling. Det bör också noteras att innesluten PCR kan ge missvisande resultat om endast några få intakta mallar bidra till amplifieringsprocessen. Primerpar som är specifikt för den modifierade amplikon bör utformas; deras sekvenser får inte innehålla CpG-dinukleotider, för att undvika metylering-förspända amplifiering. Dessutom bör primrar innehålla icke-CpG-cytosiner för att förhindra amplifiering av omodifierad eller ofullständigt omvandlade DNA. Förstärkning av vissa mallar kan dra nytta av att genomföra Hot-start PCR. I varje fall bör lämpligheten av primerpar verifieras i pilotförsök för att förhindra förruttnelse av värdefulla experimentella prover.
Bisulfit sekvensering är en standardmetod för platsspecifik metylering analys som den kan tillförlitligt och exakt detekterar metylering av enstaka CpG rester i en allel-specifikt sätt 8. Direkt sekvensering av PCR-produkten rekommenderas inte som blandad metylering oFA CpG rester visas som en C / T dubbel topp i elektroferogrammet, som kan hindra kvantifiering av metylering på det berörda området. Av detta skäl en mellanliggande kloningssteg utförs och flera kloner sekvenserades (~ 20-30) för att bestämma graden av metylering. Pyrosekvensering representerar en alternativ metod för att kvantifiera DNA-metylering. Den utnyttjar även bisulfit-omvandling och bisulfit PCR men i stället för kloning och sekvensering av amplikon utsätts för en direkt pyrosekvensering reaktion där metyleringsstatus för en CpG-rest läses som en C / T enstaka nukleotidpolymorfism som lätt kan kvantifieras. Båda metoderna upptäcka liknande nivåer av metylering 9 men eftersom kloning steg kan utelämnas Pyrosequencing är mer tidseffektivt. Emellertid, beroende på templatet endast 40-100 nukleotider kan sekvenseras samtidigt så att ett flertal omgångar av pyrosekvensering med olika sekvenseringsprimer är nödvändiga. Detta är en kritisk begränsning, ges that större mängder av DNA (ca 1 g per reaktion) krävs, vilket förutses överstiger de belopp som finns tillgängliga från små slag hjärnvävnad. Således första avsökning av områdena i området av flera kilobaser med pyrosekvensering visas mindre lämpade som enda klon behandling. Bör dock efter på identifiering av en liten region av intresse Pyrosequencing övervägas.
Sammantaget ger det protokoll som beskrivits ovan ett korrekt, effektivt och rationellt sätt för snabb och kostnadseffektiv analys av hjärnans micropunches för epigenetiska förändringar. Multipla prover kan bearbetas i en enda körning och metoderna är lämpliga vid körning prover från intermediär storlek experiment.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av Max Planck Institute of Psychiatry och Europeiska unionens Marie Curie Initial Training Network (NINA Contract 238.665).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Nucleospin RNA II | Macherey-Nagel | 740955.50 | |
| Epitect Bisulfite Kit | Qiagen | 59104 | |
| Nucleospin Extract | Macherey-Nagel | 740609.50 | |
| pGEM-T Vector Cloning Kit | Promega | A3600 | |
| Nucleofast 96 | Macherey-Nagel | 743100.50 | |
| Montage 96 Sequencing Clean-Up | Millipore | LSK09624 | |
| Hotstar Taq Polymerase | Qiagen | 203203 | |
| Taq Polymerase | Fermentas | EP0401 |
References
- Jirtle, R. L., Skinner, M. K. Environmental epigenomics and disease susceptibility. Nat. Rev. Genet. 8, 253-262 (2007).
- Murgatroyd, C., Spengler, D. Epigenetic programming of the HPA axis: Early life decides. Stress (Amsterdam, Netherlands). , (2011).
- Gluckman, P. D., Hanson, M. A., Buklijas, T., Low, F. M., Beedle, A. S. Epigenetic mechanisms that underpin metabolic and cardiovascular diseases. Nat. Rev. Endocrinol. 5, 401-408 (2009).
- Murgatroyd, C. Dynamic DNA methylation programs persistent adverse effects of early-life stress. Nat. Neurosci. 12, 1559-1566 (2009).
- Murgatroyd, C., Wu, Y., Bockmühl, Y., Spengler, D. Genes learn from stress: How infantile trauma programs us for depression. Epigenetics. 5, (2010).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact: The Coronal Plates and Diagrams: Compact. The Coronal Plates and Diagrams. , Elsevier Science Publishing Co Inc. (2008).
- Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics. BMC research notes. 4, 314 (2011).
- Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).
- Reed, K., Poulin, M. L., Yan, L., Parissenti, A. M. Comparison of bisulfite sequencing PCR with pyrosequencing for measuring differences in DNA methylation. Anal. Biochem. 397, 96-106 (2010).
