Summary
이 작품에서 우리는 ~ 8 μs 두 솔루션을 혼합 수 microfluidic 믹서의 제조 및 사용을 설명합니다. 또한 자외선 형광 및 형광 공명 에너지 전달을 (무서워)를 사용 spectroscopic 감지 이러한 믹서의 사용을 보여줍니다.
Abstract
그 기본 형태로 단백질 폴드는 생물학과 인간의 건강 아직은 저조한 이해 깊은 관련성이있는하는 과정입니다. 이것에 대한 한 가지 이유는 폴딩이 단백질의 1에 따라 나노 초에서 초 이상으로, timescales 다양한 통해 이루어지는 것입니다. 기존 정지 - 흐름 믹서는 접는 속도론의 측정은 약 1 MS에서 시작 허용했습니다. 우리는 최근 ~ 8 μs 2 denaturant는 ~ 100 배 dilutes microfluidic 믹서를 개발했습니다. 정지 - 흐름 믹서와 달리,이 믹서는 난기류가 발생하지 않습니다하는 층류 정권에서 운영하고 있습니다. 난류의 부재 3-4 실험하는 훌륭한 합의와 믹서 내의 모든 흐름의 정확한 숫자 시뮬레이션이 가능합니다.
층류는 ≤ 100을 다시 레이놀즈 번호에 대해 이루어진다. 수성 솔루션의 경우,이 마이크론 스케일의 형상을 필요로합니다. 우리는 실리콘 또는 융합된 sili로, 하드 기판을 사용CA, (그림 1 참조) 채널 5-10 μm의 넓은 및 10 μm의 깊이 있도록. 작은 크기는, 혼합 지역으로 입구 크기 1 μm의 순서에 있습니다. 이 칩은 광학 액세스 얇은 유리 또는 융합된 실리카 coverslip으로 날인합니다. 대표적인 총 선형 유속은 ~ 1 M / s의 매우 저조한 재 ~ 10이지만 단백질 소비가 전용입니다 ~ 0.5 NL / s 또는 1.8 μL / 시간.에게 단백질 농도는 검출 방법에 따라 다릅니다 : 트립토판 형광의 경우 전형적인 농도는 100 μm의 (1 TRP / 단백질의 경우)이며 전형적인 농도가 ~ 100 nm의입니다 안달을 위해.
접는 과정은 6 M에서 0.06 M 구아니딘 염산염으로 denaturant의 급속한 희석에 의해 시작됩니다. 높은 denaturant의 단백질은 중앙 채널 아래로 흐르고 denaturant합니다 (그림 2 참조) ~ 100 배 빠르게 이동하지 않고 버퍼에 의해 혼합 영역에서 양쪽에 만난됩니다. 이 기하학은 좁은으로 단백질 흐름의 급격한 수축을 초래제트 ~ 100 nm의 폭. 무거운 단백질 분자의 확산이 많이 느린 한 MS의 diffusing 미만 1 μm의 상태에서 빛을 denaturant 분자의 보급은 매우 빠른 속도이다. 단백질 주위 denaturant의 효과적인 농도를 감소 denaturant과 단백질 스트림에서 denaturant의 급속한 희석에있는 단백질 결과의 지속적인 확산의 차이,. 단백질 제트는 스캐닝 공촛점 현미경 5를 사용하여 관찰할 수있다 개고 동안 단백질의 관찰 채널 및 형광 아래로 일정한 속도로 흐른다.
Protocol
1. Microfluidic 혼합 칩의 제조
그림 3은 기본적인 제조 단계를 보여줍니다.
- 신선한 피라 냐가 솔루션 (H 2 O 2 3시 1분 H 2 SO 4) : 4 개 인치 (100 ㎜) 융합된 실리카 웨이퍼를 청소해) 열처리 황산 130 ° C에서 다음 과산화수소에 붓는다. 표면 거칠기와 융합된 실리카 웨이퍼의 평탄도가 최종 본딩 단계에서 중요한 역할을 사용합니다. II) 최소 30 분 동안 웨이퍼를 빠져. 3) 물, 건조 5 분 동안 씻어. 폴리 실리콘 (폴리) 코팅을 적용, 저압 화학 기상 증착 (LPCVD) 용광로를 사용하여 최종 microfluidic 채널의 각 대상 10 μm의 깊이 당 두께 ~ 1 μm의.
- 단계 1.1 피라 냐가 프로토콜을 사용하여 웨이퍼와 마스크를 청소합니다. 마스크에게 같은 방법으로 청소 후 아세톤, 메탄올 및 이소프로판올과 헹굼 즉시 건조 폭파. 15 뜨거운 접시에 웨이퍼를 탈수0 ° C에 대해 ~ 10 분 (거리 입자를 유지하기 위해 알루미늄 호일 텐트를 사용) 또는 최소 120 분 (야간 선호)에 대한 120 ° C 오븐 인치 포토 레지스트 접착력을 향상시키기 위해 즉시 5 분 HMDS 증기로 따뜻하게 웨이퍼를 쉽게받을 수 있습니다. ° C에서 직접 1 분 열판 또는 30 분 (그림 3 단계 1) 110 ° C에서 오븐에 90시 AZ5214 포토 레지스트와 부드러운 베이킹 중 ~ 900 nm의 두께의 레이어와 스핀 코트는 웨이퍼.
- 마스크를 정렬하고 하드와 진공 연락처를 확인하십시오. (그림 3, 2 단계) : 몇 초 (~ 103 MJ / ㎝ 2 총 에너지)의 자외선에 노출. 부드럽게 agitating 동안 ~ 50 초 동안 디 물로 4시 1분을 희석 AZ400K 개발자 (포토 레지스트가 완전히 개발되기 전까지)를 개발할 수 있습니다. 2 분 동안 물로 씻어. 현미경 기능 (그림 3, 3 단계)을 검사합니다. 기능이 저조한 해결하는 경우 포토 레지스트를 제거하고 1.2을 사용하여 다시 시작합니다. 베이킹 115 ° C에서 직접 2 열판에분.
- 100 W의 RF 전력으로 2.5 분 아셀 또는 O 2 플라즈마와 Descum 웨이퍼. 깊은 반응 이온 에칭 (DRIE), 아래 융합된 실리카 이르기까지 에칭 폴리 실리콘 계층은 모든 방법을 사용합니다. 10 분 동안 75 ° C에서 스트리퍼를 저항 PRS2000로 남아있는 포토 레지스트의 옷을 벗겨라. 린스와 건조. 그것 폴리 코팅 (그림 3, 4 단계)을 통해 모든 방법이다 보장하기 위해 에칭 깊이를 측정합니다.
- 이러한 ULVAC 네덜랜드-6000 식각 장치, 폴리 코팅 (그림 3, 5 단계)의 미크론 두께 회 ~ 10 μm의 깊이로 에칭 융합된 실리카 등의 산화물 수 DRIE 사용하기. 이 폴리 코팅은 에칭 동안 떨어져 착용되기 때문에 그것은 에칭 과정에서 주기적으로 코팅의 무결성을 확인 할 수 있습니다. 웨이퍼 표면의 의도 특색이 지역은 식각 동안 보호 폴리 코팅의 민둥산이 될 경우, 표면은 대부분 pitted되어 더 이상 결합 적합하지 않습니다생산의 최종 단계 인치 이 경우 웨이퍼는 대부분 더 이상 실용적입니다. 사분, 100 W의 RF 전력에 대한 매트릭스 아셀로 청소합니다. XeF이 식각 장치 (그림 3, 6 단계)와 폴리 실리콘을 벗겨. 그것은 포토 레지스트와 폴리 코팅을 모두 제거하는 단계 1.4이 단계 몇 번 반복해야 할 수도 있습니다.
- 후속 처리하는 동안 채널을 보호하기 위해 포토 레지스트의 새 ~ 1 μm의 레이어와 코트 웨이퍼를 봐. sandblaster (그림 3, 7 단계)와 다이아몬드 스쳐 드릴이나 수동으로 제어 컴퓨터를 사용하여 각 칩의 입구와 출구 구멍을 뚫어라. 드릴을 사용하면 거품 bonder 무료 유지를 돌보고, 아쿠아 본드 55 사용 희생 유리 접시에 웨이퍼 (기능 쪽 아래)를 탑재합니다. 마이크로-90 클리닝 솔루션을 드릴 시원한 시간을 보내세요. 이것은 그때 사용하는 동안 칩을 방해할 채널을 고집에서 유리의 작은 비트를 유지합니다.
- W를 주입하는 주사기를 사용하여 DI 워터로 웨이퍼를 씻어각 구멍에 ater. 시간 동안 비눗물로 만끽해보세요. 표면이 깨끗한 때까지 몇 시간 동안 60 ° C에서 푸에르 토리코 2000에 포토 레지스트 및 아쿠아 본드를 제거합니다. DI 워터 따뜻한 비눗물로 웨이퍼를 씻어. 에칭처리된 기능을 피하 주사하고 다시 각각의 구멍을 씻어. 질소로 및 진공 오븐에서 건조 웨이퍼는 120 ° C.로 설정 그들은 그릿 무료입니다 확인하고 필요에 따라 단계를 청소 반복 구멍을 검사합니다. 중 광학 또는 기계적인 표면 프로파일 (그림 3, 8 단계)과 채널의 깊이를 측정합니다.
- 클린 웨이퍼와 1의 동등한 수를 170 μm의 두께가 융합된 실리카 커버 유리) 피라 냐가 솔루션 (1~2시간 1.1의 절차에 따라), 2) RCA 2 (5시 1분 1초 DI : HCL : H 2 0 2 75 C에서 10 분) 솔루션, 3) RCA 1 용액 (5시 1분 1초 DI : 75C 22 분 H 2 0 2)) : NH 4 OH. 각 용액 사이에 5 분 디 물로 씻어.
- 놓으 웨이퍼 기능은 위에서 측면이러한 유리의 작은 패널로서 하드 평평한 표면 위에 놓여 3-4 청정실 잎사귀의 스택. 적어도 5 분 동안 질소 가스로 철저하게 웨이퍼를 건조합니다. 커버 유리로 반복합니다. 가장자리로 커버 유리를 들고 세련된 측면이 얼굴을 아래로 웨이퍼 위에 개최 평면 모서리를 맞춥니다되는 등 바꾸란. 조심스럽게 웨이퍼 위에 덮개 유리를 떨어뜨하고 정착하실 수 있습니다. 정렬을 조정하기 위해 수평에만으로 이동. 웨이퍼의 중심에 하나 손가락으로 눌러 줘요. 하나는 본딩 전선이 밖으로 방출되기 시작 나타납니다. 필요한 경우, 본딩 프런트 (그림 3, 9 단계)을 진행하기 위해 웨이퍼 주변의 다른 위치로 추가적인 압력을 적용합니다.
- ° C에서 또 다른 1.2 시간 이상 1100-800에서 다음, 적당한 온도에서 ° C 3시간 800로 진입로로 설정한 고온의 오븐에 봉인된 웨이퍼를 놓습니다. 2 시간 1100 ° C 정도로 유지하고 다른 1.5 시간 이상 상온에 내려 램프.
- 웨이퍼 다이싱있는 주사위 내로 봤다ndividual 칩 (그림 3 단계 10).
- 프로토콜은 자외선 감지에 필요한 비교적 드문 융합된 실리카 기판의 채널의 제조에 대해 설명합니다. 그러나이 프로토콜은 또한 하나의 에칭 2 단계를 필요로하는 실리콘 기판에 맞게 조정 할 수 있습니다. 유리 (하지만 융합된 실리카) 커버 유리 양극 접합을 사용하여 웨이퍼를 접착하실 수 있습니다.
2. 칩을 장착하고로드
- 혼합 칩 및 솔루션을 보유하기위한 다기관 같은 Lexan이나 플렉시 글라스, 또는 온도 제어를위한 알루미늄 (그림 4 참조)으로, 플라스틱으로 만들 수 있습니다. 알루미늄을 사용하는 경우 솔루션 저수지는 저수지에 소금 솔루션에 의해 알루미늄의 해산을 방지하기 위해 parylene로 코팅되어야합니다. 열전 장치는 측면과 전자식 컨트롤러 장착으로 전체 매니폴드, 솔루션 및 칩의 온도는 제어할 수 있습니다.
- 칩은 매니큐어로 성관계를하고 있습니다O-링 작은이 칩을 중심의 명확한 광학 볼 수있게 유지 반지 장소에서 개최하여 배. O-링 홈이 칩에 너무 많은 압력을 적용하지 않고 좋은 짝짓기를 위해 표준보다 얕은이어야합니다 즉, 002 O-링은되어야 0.025 "깊이. 칩이 탑재되면 중앙과 측면 저수지에 솔루션을 추가 , 우물의 바닥에 갇혀있는 기포를 출시할 관리 하는것.
- 이 믹서에 사용되는 볼륨이 너무 작기 때문에, 흐름 솔루션 우물 위에 적용되는 공기 압력으로 제어할 수 있습니다. 그림 4는 O-링을 칩 매니폴드의 상단에 성관계 압력 매니폴드를 보여줍니다. 압력 매니폴드는 ~ 2-80 PSI의 압력을 유지할 수있는 컴퓨터 제어 압력 트랜스 듀서에 연결됩니다. 칩은 센터와 사이드 채널에서 동일한 압력 선형 유속에서 ~ 100 배 비율을 생산하는 등 설계되었습니다. 20 PSI에서 출구 채널의 선형 유속은 ~ 1 미터/ s의.
- 거꾸로 현미경에 매니폴드를 삽입하고 접안 렌즈 또는 카메라의 출력으로 영역을 혼합 검사합니다. 매니폴드 위에 놓여 백열 전등 충분한 빛을 제공할 것이다. 제트로 볼 중앙 채널에 굴절 솔루션의 염료이나 높은 지수 (IE 6 M 구아니딘 염산염)를 사용합니다.
- 중앙과 측면 채널에서 동일한 압력에서 제트기가 눈으로 볼 수 있도록 0 PSI에 사이드 채널 압력으로 시작하고 서서히 동등한 압력을 증가시키기 어려울 것이다. 한쪽 채널이 막힌 경우 제트는 출구 채널의 벽 중 하나에 대해 적용됩니다. 보이는 덩어리가 나타나는 경우, 그것은 주사기와 출구 채널에 압력이나 진공을 적용하여 dislodged 수 있습니다.
- 단백질이나 기타 유기 물질이 칩을 나막신있다면, 그것은 하룻밤 Pirhana 용액에 몸을 담글하여 청소하실 수 있습니다.
3. 데이터 수집
그림 5는 기본적인 광학 계기 레이아웃을 보여줍니다.
- 현미경 외부 중 내부 또는 이색성 거울을 사용하여 연구 수준의 현미경으로 collimated 레이저 광선을 가져와. 포커스가 다소 혼합 지역 근처의 접안 렌즈 또는 카메라에서 볼 수 있도록 레이저를 맞춥니다.
- 믹서에있는 단백질의 형광은 객관적이 수집하여 이색성 거울을 통해 전송, 핀홀에 렌즈에 의해 초점과 광자 카운터에 몇 군데 있습니다. 이미지 혼합 지역 (전형적인 단계의 크기는 2 μm의입니다)에 x와 y의 압전 스캐너를 사용하여 칩을 스캔. 수직 채널의 중심에 초점을 찾을 수있는 x와 z는의 제트와 검사에 대한 위치를 선택합니다. 현미경 분야의 깊이 채널 깊이보다 훨씬 적은이며 유속은 벽면의 1 μm의 내의를 제외한 채널에 균일입니다. 따라서 관찰된 형광 반응의 시간적 해상도는 주로 공촛점 장소의 크기에 의해 결정됩니다.
- 출구 채널 (일반적인 단계들 내에서 수평 스캔이지는는 제트 전역에서 0.2 μm의입니다 ~ 1 MS 당 입장에 대한 관찰 제트를 따라 100 μm의 단위에서 제트 따라 2 μm의) (그림 6 참조). 나중에 시간을 캡처하는 제트를 따라 80-90 μm의에 의해 현미경으로 무대를 이동합니다.
- 양자 택일로, 라이트는 입구 슬릿 향해 빛을 초점 렌즈를 사용하여 이색성 거울 후에 분광기와 CCD까지 감지가 가능하다. 데이터 수집은 광자 카운터 (위치 당 일초)에 비해 느린이기 때문에 일반적으로 제트는 광자 카운터 처음에 몇 군데 있으며 다음 제트 따라 포인트는 (그림 7 참조) 분광기로 측정합니다.
- 광자 카운터의 데이터는 강도 대 거리의 플롯을 만드는 각각의 위치에서 제트 주위에 3-5 픽셀을 합산하여 분석됩니다. 시간은 적용 압력 (그림 8 참조)을 기반으로 계산 속도를 사용하여 먼 거리에서 계산됩니다.
- 분광기의 데이터가 가지 방법 중 몇 가지를 분석할 수 있습니다. 내용은 channe를 걱정"기증자"과 "수용체"로 지정 이거는 각 표현과 근접 비율 E = I / (I D + I D) 계산 (그림 9 참조). 수 있습니다 또는 단일 값 분해 같은 단백질 폴드 등 트립토판 방출 스펙트럼의 변화와 같은 시간 대 독립 스펙트럼 구성 요소를보고 수행할 수 있습니다.
- 출구 채널 내의 거리가 적용된 압력의 사이드 채널을 결정 일정한 유속을 사용하여 시간에 변환할 수 있습니다. 출구 채널의 처음 2 μm의 내에서 단백질 제트의 유동 비율은 ~ 100x 가속하고 해당 지역의 시간 (시간이 그림 8에 꾸몄다 제작) 합리화의 유한 요소 분석으로 계산되어야합니다. 속도가 일정하게되어 대개 혼합보다 훨씬 느린 반응 속도론을 측정에 무시해도됩니다 뒤 가속은 ~ 1-2 μs 오프셋을 생산하고 있습니다.
4. 대표 결과
그림 6은 광자 카운터로 측정 혼합 지역의 강도의 윤곽 플롯을 보여줍니다. 제트 이외의 출구 채널의 배경은 검출기의 잡음 플로어 가까이 있어야하며 일반적으로 빼서되지 않습니다. 높은 배경은 가난한 정렬을 나타낼 수도 있고 단백질은 채널의 벽을 지키는되어 있는지 확인하시기 바랍니다. 특히 혼합 지역 근처 kinked 또는 구부러진 보이는 제트는 노즐의 가난한 에칭을 나타냅니다.
그림 7은 시간 알렉사 488와 알렉사 647로 표시된 단백질 아실 - 보조 효소 결합 단백질 (ACBP)에서 스펙트럼을 해결 보여줍니다. 이 데이터는 배경은 어두운 요금 및 레이저 신호를 제거하는 빼서되었습니다. 배경 신호는 0 PSI로 설정된 중앙 채널의 압력과 함께 찍은.
혼합 시간은 같은 TRP 형광 담금질 B로 믹싱보다 훨씬 빠르고 신속한 반응을 측정하여 측정 가능Y KI 있고 또는 레이블 단일 좌초된 DNA의 붕괴는 NaCl의 추가에 의해 염료를 무서워. 제트기가 현미경의 광학 해상도보다 작은이기 때문에 제트 형태로 혼합 지역의 큰 강도 드롭이 있습니다. 이 악기 응답이 더 용액 조건의 변화. 그림 8은 혼합의 비율 (400 MM로 KI)과 N-아세틸 트립토판 아미드 형광 비 혼합 실험을 보여주지하는 제어 측정함으로써 제거할 수 있습니다. 라인은 COMSOL 시뮬레이션에서 KI의 예측 농도를 보여줍니다. 믹싱 시간, 80 % 감소하는 농도의 시간으로 측정으로, 8 μs이다.
데이터가 500 μm의 길이의 출구 채널을 따라 100 μm의 단위로 수집되기 때문에 데이터가 여러보기에서 함께 붙여넣어야합니다. 이 칩은 현미경 스테이지에 의해 이동되기 때문에 초점의 작은 변화로 인한 가능성이 전망 사이의 신호에서 가끔 작은 오프셋이 있습니다. 무대를 이동하여 80 또는 90볼 당 μm의 이러한 오프셋은 중복 데이터를 검사하여 제거 할 수 있습니다. 일반적으로 오히려 광학 또는 플로우 효과보다 단백질의 실제 spectroscopic 변화로 인해 데이터가 두 개 이상 유동 속도로 수집하고 데이터는 모든 신호 변화를 확인하기 위해 결합된다. 그림 9의 희석 후 단백질 ACBP의 변화를 안달 보여줍니다 는 걱정부터 6 M에서 0.06 엠이 데이터에 denaturant는 제어 실험이 필요없는 것은 이미 비율이며 악기 응답이 이미 제거됩니다. T = 0 근처의 급격한 점프가 혼합 시간 내에 신호를 걱정에서 급격한 변화를 나타냅니다.
그림 1. 전자 현미경으로 측정 혼합 영역의 레이아웃.
그림 2. 단백질 접힘 연구를 혼합 유체의 도식. 단백질,그것을 펼쳐 높은 denaturant에 녹아있는, 그것이 버퍼 ~ 100 배 빠르게 흐르는 충족 혼합 지역에 대한 중앙 채널을 아래로 흐르고있다. 층류는 denaturant 분자가 빠르게 확산 수있는 좁은 제트로 단백질 스트림을 강요합니다. 제트기가 출구 채널을 흐르는으로 단백질은 공촛점 현미경을 사용하여 높은 공간 및 시간 해상도로 볼 수 있습니다.
그림 3. 융합된 실리카 제조. 1) 프로세스는 상단과 하단 표면에 예금 폴리 실리콘의 레이어 (폴리)와 고도로 세련된 500 μm의 두께가 융합된 실리카 기판 ()로 시작 (B)와 포토 레지스트 (C)의 레이어와 스핀 - 코팅. 2) photomask이 (e)를 INT를 데려갑니다 웨이퍼와 포토 레지스트와 O 하드 연락처가 자외선 (D)에 노출됩니다. 3) 웨이퍼는 개발자 욕조에 배치하고 패턴은 포토 레지스트로 드러났습니다. 4) 웨이퍼는 DRIE에 배치되며 기능은 상단 폴리 코팅에 새겨져있다. 포토 레지스트 뺍니다. 융합된 실리카 기판에 40 μm의 - 5) 폴리 다음 웨이퍼 산화물 식각 장치에 배치되고 기능 10 새겨져 있습니다 마스크 역할을합니다. 6) 폴리 코팅 후 XeF이 에칭으로 제거됩니다. 7) 웨이퍼는 열 활성 밀봉제 (G), 아래 기능 측면과 뒷면에서 - 구멍을 통해 다이아몬드 드릴 비트 (F) abrasively 훈련과 희생 유리 플레이트에 접착된다. 8) 표면 프로파일 (H)는 다음 직접 에칭처리된 기능 깊이를 측정합니다. 9) 170 μm의 두께가 융합된 실리카 coverslip 웨이퍼 직접 웨이퍼의 상단 표면에 접착된다. 10) 웨이퍼는 개별 microfluidic 칩으로 몸이 다 절단한다.
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그림 4. 믹서 매니폴드. microfluidic 칩은 가공 알루미늄 페이스 플레이트와 ~ 200 μL 저수지 아래의 네 O-링과 솔루션 매니폴드로 보안이됩니다. 큰 구멍은 과도한 자외선 빛이 매니폴드 자체에서 backscattering, 억제하는 자동 형광없이 탈출 있도록하고 눈으로 칩의 직접 조명을 허용하는 직접 부착된 microfluidic 칩의 혼합 영역 위의 매니폴드의 중심을 통해 가공된다 정렬 또는 카메라. 각각의 공기 압력이 외부 압력 제어 상자를 통해 제어할 수있는 에어 매니폴드 바다표범 같은 저수지의 각.
그림 5. 광학 공촛점 현미경의 도식.
그림 6. 트립토판의 윤곽 플롯microfluidic 믹서에 형광. 혼합 지역은 Y 축에서 ~ 90 μm의에 있습니다.
그림 7. 믹서 내에서 수집된 시간 종속 형광 스펙트럼. 녹색과 빨간색 사각형은 각각 기증자 및 수용체 채널로 지정 파장을 보여줍니다.
그림 8. 칼륨 요오드화물 (포인트 및 오른쪽 축)에서 트립토판의 형광 담금질에 의해 측정 및 유한 요소 분석 (라인과 왼쪽 축)에 의해 계산 혼합 시간.
그림 9. 단백질 ACBP의 접는 동안 측정된 변화를 무서워. t = 0 근처의 급속한 상승은 혼합 시간 내에 버스트 위상을 상징하고 느린 상승은 점진적 accumula을 나타냅니다단백질 폴드와 같은 구조의 기. 데이터는 두 개의 서로 다른 흐름 속도로 이동하고 다른 시간에 측정의 서로 다른 밀도로 이어지는, 중첩되었다.
Discussion
그것이 긴 biomolecules의 분자 프로세스 picoseconds에서 초에 이르기까지 다양한 시간 단위를 통해 발생하는 인식 되었기 때문에 급속한 믹싱은 수년 동안 단백질 폴딩의 필드에 대한 개발 목표왔다. 기존 정지 - 흐름 믹서는 주로 난류에 의해 제한되는 1-5 MS의 죽은 시간이 있습니다. 30-300 μs의 혼합 시간과 지속적인 난류 유동 믹서는 그룹의 소수에 의해 지난 15 년간 개발된지만 일반적으로 다음과 믹싱 시간을 달성하기 위해 높은 유량을 필요로하므로 샘플 6-8를 많이 사용되었습니다.
이 프로토콜은 층류 정권에 신속하게 희석를 달성하기위한 microfluidic 혼합 칩의 사용을 설명합니다. 가이 정권 내에서 작동으로 여러 장점이 있지만 기본 하나 하나가 혼합 반응을 수정할 수있는 높은 정밀도와 전체 믹싱 과정을 시뮬레이션할 수있는 능력입니다. 간단한 geom 다른 그룹에 의해 개발된 T-믹서etries는 주로 채널 9-10의 크기에 의해 제한되었다 100-200 μs의 혼합 시대를 증명하고있다. 10 μm의 나이트로 채널의 크기를 축소함으로써 ~ 10 μs 11 ~ 혼합 시간 단축. 야오와 Bakajin은 기하학의 작은 변화가 혼합 시간 4의 상당한 개선으로 이어질 수 있다고했다. 그러나 그 작품은 혼합의 가속도도뿐만 아니라 느린 단계로 이어질 수있다 보여주었다. 이 작품은 12-13에 사용되는 디자인 denaturant 농도의 느린 지수 붕괴를 최소화하고 또한 DRIE 에칭의 기능이 더욱 재현할 수 있도록 참조 4의 두 최고의 디자인 사이의 타협이다.
혼합 시간의 정의를 통해 믹싱 ultrarapid의 분야에서 어떤 논쟁이 일어났습니다. 그것은 "혼합 시간"과 "죽은 시간"의 차이를 인식하는 것이 중요합니다. 죽은 시간 동안 measuremen 시간을 난류 믹서에서 정의됩니다T는 만들 수 없으며 실제로는 실제 혼합 시간보다 훨씬 더 오래있을 수 있습니다. 그것은 일반적으로 다양한 농도에서 의사 최초 주문 bimolecular 반응 (예 : N bromosuccinate 의한 트립토판 형광 담금질 등)의 여러 측정함으로써 결정됩니다. 관찰된 지수 붕괴는 t = 0의 것으로 추정 하나의 값으로 수렴하기 위해 장착하고 그 시점과 첫 번째 측정 시점 사이의 시간은 죽은 시간이다됩니다. 도 죽은 시간에만 믹싱 시간이 없다 있도록 판상 흐름 믹서의 경우 성능은 믹싱 과정에서 만들 수 있습니다. 혼합 시간은 단순히 충분한 균일에 도달할 때까지 서로 다른 두 솔루션을 결합하는 시간입니다. 우리는 이전에 10분의 90 시간, unmixed 가치의 10 % ~ 90 % 감소한하기 denaturant의 농도에 대한 시간이 될 혼합 시간을 정의했습니다. 그러나, 혼합 곡선의 형태는 작은 지수 구성 요소를 갖는 부패의 꼬리와 완벽하게 대칭이 아닙니다. 또한, 단백질 폴딩이있다denaturant 농도에서 높은 비선형 의존도 그 접는가 자주 denaturant가 두 배 이상 감소되는 경우에도 개시하게 할수 있습니다. 따라서 우리는 최근 80 % denaturant 농도를 감소시키는 시간으로 혼합 시간을 정의했습니다. 물론 다른 정의는 실험의 요구에 따라 사용할 수 있습니다.
단백질 접힘 연구를 위해이 믹서의 사용은 지속적으로 놀라운 결과를 발표했다. 오랫동안 지속적인 흐름 믹서로 여러 개의 접는 단계와 초기 결과를 가지고 연구되어 시토크롬 C와 apomyoglobin의 개고 것은 ~ 100 μs timescale 10,14-15에서 발생하는 붕괴를 보여주었다. 이 믹서와의 측정합니다 (느린 단계 다음 믹서의 혼합 시간 내에, 매우 빠르고 가능성이 불특정, 붕괴합니다 (TRP 형광 스펙트럼의 변화로 측정)이 timescale에 최소한 2 단계가있을 보여준 ) 총 TRP 방출의 담금질에 의해 측정된 그 가능성 F입니다기본 구조 5 irst 형성. 우리는 또한이 단백질은 2 주 폴더에 13이라는 종래의 해석을 overturning, 단백질 L의 지하 도메인에 50 μs 과정을 관찰했습니다.
이러한 급속한 믹서의 장점은 일반적 nanosecond T-점프 악기에 의한 measureable 있었 빠른 접는 단백질의 폴딩을 알아내기 수있다는 것입니다. T-점프는 일반적으로 개고 / 단백질의 녹는 온도 근처에서 휴식을 펼쳐 따라서 전체 인구의 접는을 따르고 절대 관찰이 필요합니다. 이 믹서를 통해 우리는 TRP 총 방출 및 스펙트럼 시프트 모두와 γ-억제의 폴딩 (λ 6-86)를 방문한 적이 있으며 단백질 이전 T에 액세스할 수 없다는 강한 접는 조건 하에서 개고 아무 장애가 없다는 증거를 발견했습니다 측정에게 12 - 점프. 마지막으로 우리는, T 중 하나를 villin의 투구 HP-35 접는을 측정했습니다그는 빠른 폴더는 아직 측정 및 혼합 후 측정 접는 비율이 동일한 조건 16 세 미만 T-점프로 측정하는 것보다 ~ 5 배 느립니다 것으로 나타났습니다. 이것은 접는 속도론이 분야의 주요 가정을 overturning, 시작 조건에 따라하는 것이 좋습니다.
Disclosures
우리는 공개 할게 없다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 과학 재단 FIBR (NSF EF-0623664)와 IDBR (NSF DBI-0754570)에 의해 지원됩니다. 이 작품은 부분적으로 협동 협정 PHY 0,120,999하에 캘리포니아 대학, 데이비스에 의해 관리 Biophotonics, NSF 과학 기술 센터를위한 센터에서 관리 국립 과학 재단 FIBR 그랜트 0,623,664로부터 자금 지원에 의해 지원되었다. 리사 Lapidus, 박사의 연구 버로우즈 웰컴 기금에서 과학 인터페이스에서 경력 수상에 의해 부분적으로 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AZ P4110 Photoresist | AZ Electronic Materials | ||
| AZ 400 K Developer | AZ Electronic Materials | ||
| Baker PRS 2000 photoresist stripper | Avantor Performance Materials | ||
| AquaBond | AquaBond Technologies | AquaBond 55 | |
| 500 μm cover wafer | SENSOR Prep Services | : 100 mm ± 0.5 mm Thickness: 0.5 mm ± 0.025 mm Standard Tolerances (Unless Noted) Surface Finish: SI: 4-8Å; SII: 8-12Å Flats: One Primary SEMI-STD; One Scribe Clean and Polished, Both Sides |
|
| 170 μm cover wafer | SENSOR Prep Services | 7980 2G Wafers | : 100 mm ± 0.5 mm Thickness: 0.17 mm ± 0.025 mm Standard Tolerances (Unless Noted) Surface Finish: SI: 4-8Å; SII: 8-12Å Flats: One Primary SEMI-STD; One Scribe Clean and Polished, Both Sides |
| Deep reactive ion etcher for oxides | ULVAC | ULVAC NL-6000 | |
| Argon Ion Laser | Cambridge Laser Laboratories | Lexel 95-SHG | λ=258 nm |
| Argon Ion Laser | Melles Griot | λ=488 nm | |
| Microscope | Olympus Corporation | IX-51 | |
| Microscope Objective | Thorlabs Inc. | OFR LMU-40X-UVB 0.5 NA | λ= 258 nm |
| Microscope Objective | Olympus Corporation | UPLSAPO 60XW 1.2 NA | λ=488 nm |
| Nanopositioner | Mad City Labs | Nano-LP100 | |
| Motorized Translation Stage | Semprex Corp | KL-Series 12-6436 | |
| GaAsP Photon Counter | Hamamatsu Corp. | H7421-40 | |
| Monochrometer | Horiba Instruments Inc | MicroHR | |
| CCD camera | Andor | iDus 420A-BU | |
| Guanidine hydrochloride (GuHCl) | Sigma-Aldrich | G4505 |
References
- Eaton, W. A. Fast kinetics and mechanisms in protein folding. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 29, 327-359 (2000).
- Hertzog, D. E. Femtomole mixer for microsecond kinetic studies of protein folding. Analytical Chemistry. 76, 7169-7178 (2004).
- Hertzog, D. E., Ivorra, B., Mohammadi, B., Bakajin, O., Santiago, J. G. Optimization of a microfluidic mixer for studying protein folding kinetics. Analytical Chemistry. 78, 4299-4306 (2006).
- Yao, S., Bakajin, O. Improvements in Mixing Time and Mixing Uniformity in Devices Designed for Studies of Protein Folding Kinetics. Analytical Chemistry. 79, 5753-5759 (2007).
- Lapidus, L. J. Protein Hydrophobic Collapse and Early Folding Steps Observed in a Microfluidic Mixer. Biophysical Journal. 93, 218-224 (2007).
- Bilsel, O., Kayatekin, C., Wallace, L. A., Matthews, C. R. A microchannel solution mixer for studying microsecond protein folding reactions. Review of Scientific Instruments. 76, (2005).
- Chan, C. -K. Submillisecond protein folding kinetics studied by ultrarapid mixing. PNAS. 94, 1779-1784 (1997).
- Shastry, M. C. R., Luck, S. D., Roder, H. A continuous-flow capillary mixing method to monitor reactions on the microsecond time scale. Biophysical Journal. 74, 2714-2721 (1998).
- Pollack, L. Compactness of the denatured state of a fast-folding protein measured by submillisecond small-angle x-ray scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 10115-10117 (1999).
- Takahashi, S. Folding of cytochrome c initiated by submillisecond mixing. Nature Structural Molecular Biology. 4, 44-50 (1997).
- Knight, J. B., Vishwanath, A., Brody, J. P., Austin, R. H. Hydrodynamic focusing on a silicon chip: Mixing nanoliters in microseconds. Physical Review Letters. 80, 3863-3866 (1998).
- DeCamp, S. J., Naganathan, A. N., Waldauer, S. A., Bakajin, O., Lapidus, L. J. Direct Observation of Downhill Folding of lambda-Repressor in a Microfluidic Mixer. Biophysical Journal. 97, 1772-1777 (2009).
- Waldauer, S. A.
- Shastry, M. C. R., Roder, H. Evidence for barrier-limited protein folding kinetics on the microsecond time scale. Nature Structural Biology. 5, 385-392 (1998).
- Uzawa, T. Collapse and search dynamics of apomyoglobin folding revealed by submillisecond observations of alpha-helical content and compactness. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 1171-1176 (2004).
- Zhu, L. Evidence of Multiple Folding Pathways for the Villin Headpiece Subdomain. The Journal of Physical Chemistry B. 115, 12632-12637 (2011).
