Summary
En este trabajo se explica la fabricación y el uso de un mezclador de microfluidos capaz de mezclar dos soluciones en ~ 8 mS. También demuestran el uso de estos mezcladores con detección espectroscópica utilizando fluorescencia UV y la transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET).
Abstract
El proceso por el cual una proteína se pliega en su conformación nativa es de gran importancia para la biología y la salud humana y aún poco conocidos. Una razón para esto es que plegado tiene lugar en un amplio rango de escalas de tiempo, de nanosegundos a segundos o más, dependiendo de la proteína 1. Convencionales de flujo detenido mezcladores han permitido la medición de la cinética de plegado a partir de alrededor de 1 ms. Recientemente hemos desarrollado un mezclador de microfluidos que diluye desnaturalizante ~ 100 veces en ~ 8 mS 2. A diferencia de un mezclador de flujo detenido, este mezclador opera en el régimen de flujo laminar en el que la turbulencia no se produce. La ausencia de la turbulencia permite la simulación numérica precisa de todos los flujos dentro de la mesa de mezclas con un acuerdo excelente para experimentar 3-4.
El flujo laminar se logra para números de Reynolds Re ≤ 100. Para soluciones acuosas, esto requiere geometrías micras escala. Nosotros utilizamos un sustrato duro, tal como el silicio o silicio fundidoCA, para hacer micras canales 5-10 ancho y profundo 10 micras (Ver Figura 1). Las dimensiones más pequeñas, en la entrada a la zona de mezcla, son del orden de 1 micra de tamaño. El chip se sella con un vidrio delgado o cubreobjetos de sílice fundida para el acceso óptico. Las velocidades típicas del flujo total son lineales aproximadamente 1 m / s, dando Re ~ 10, pero el consumo de proteínas es sólo ~ 0,5 nl / s ó 1,8 l / h. La concentración de proteína depende del método de detección: Para triptófano fluorescencia la concentración típica es de 100 micras (1 para Trp / proteína) y para FRET la concentración típica es de ~ 100 nM.
El proceso de plegado se inicia por dilución rápida de desnaturalizante de 6 M a 0,06 M de hidrocloruro de guanidina. La proteína en desnaturalizante alta fluye hacia abajo un canal central y se reunieron a ambos lados en la región de mezcla por tampón desnaturalizante sin mover ~ 100 veces más rápido (ver Figura 2). Esta geometría causa constricción rápida del flujo de proteína en un estrechochorro ~ 100 nm de ancho. La difusión de las moléculas desnaturalizantes de luz es muy rápida, mientras que la difusión de las moléculas de proteína pesados es mucho más lenta, se difunden a menos de 1 micra de 1 ms. La diferencia en la constante de difusión del desnaturalizante y los resultados de proteínas en dilución rápida del desnaturalizante de la corriente de la proteína, lo que reduce la concentración efectiva del desnaturalizante alrededor de la proteína. El chorro de proteína fluye a una velocidad constante por el canal de observación y la fluorescencia de la proteína durante el plegado puede observarse usando un microscopio confocal de barrido 5.
Protocol
1. La fabricación de chips de microfluidos de mezcla
La Figura 3 muestra las etapas de fabricación básicos.
- Limpiar 4 pulgadas (100 mm) obleas de sílice fundida con una solución fresca Piraña (03:01 H 2 SO 4: H 2 O 2): i) Calentar el ácido sulfúrico a 130 ° C y verter en el agua oxigenada. Nótese que la rugosidad superficial y la planitud de las obleas de sílice fundido utilizado jugar un papel importante para la etapa de unión final. ii) Sumergir las obleas por lo menos 30 minutos. iii) Se lava durante 5 minutos con agua y secar. Aplique una de polisilicio (poli) recubrimiento, ~ 1 m de espesor por cada m de profundidad destinado 10 de los canales de microfluidos final, utilizando un producto químico de baja presión de deposición de vapor (LPCVD) horno.
- Limpie las obleas y la máscara que utilizan el protocolo de la piraña en el paso 1.1. Limpie la máscara de la misma manera, luego enjuague con acetona, el metanol y el isopropanol y secar inmediatamente. Deshidratar las obleas sobre una placa caliente a 150 ° C durante ~ 10 minutos (utilizar una tienda de campaña papel de aluminio para mantener las partículas de distancia) o en un horno de 120 ° C durante al menos 120 minutos (durante la noche preferiblemente). Para aumentar la adhesión fotorresistente, inmediatamente exponer las obleas calientes a HMDS de vapor durante 5 minutos. Capa centrifugado las obleas con una capa gruesa 900 nm ~ AZ5214 de fotoresist y hornear suave a 90 ° C directamente sobre una placa caliente durante 1 minuto o en un horno a 110 ° C durante 30 minutos (Figura 3, etapa 1).
- Alinear la máscara y hacer un contacto duro y vacío. Exponer a la luz ultravioleta durante varios segundos (total de la energía: ~ 103 mJ / cm 2) (Figura 3, paso 2). Desarrollar con AZ400K desarrollador, diluido 4:1 con agua desionizada durante aproximadamente 50 segundos (hasta que fotosensible está completamente desarrollado), mientras agita suavemente. Enjuagar con agua durante 2 minutos. Inspeccionar características con microscopio (Figura 3, paso 3). Si las características no están bien resueltos, pele la capa de protección y empezar de nuevo de 1,2. Hard hornear 115 º C directamente sobre una placa caliente durante 2minutos.
- Obleas Descum con Asher o de O 2 en plasma de 2,5 minutos a 100 W de potencia de RF. El uso de un grabador de iones reactivos profunda (DRIE), grabar la capa de polisilicio hasta el final de la sílice fundida a continuación. Pele el fotoresist restante con PRS2000 resistir separador a 75 ° C durante 10 minutos. Enjuague y seque. Medir la profundidad de grabado para asegurar que es todo el camino a través del revestimiento de poli (Figura 3, paso 4).
- Usando un DRIE óxido capaz como un ULVAC NLD-6000 grabador, sílice fundida etch a una profundidad de aproximadamente 10 micras de espesor micras del revestimiento de poli (Figura 3, paso 5). Este revestimiento poli se desgasta durante el grabado, por lo que puede ser necesario para comprobar la integridad del revestimiento periódicamente durante el proceso de grabado. Si las regiones intencionalmente sin rasgos de la superficie de la oblea se han convertido al desnudo de la capa de poli protectora durante el grabado, la superficie ha más probable convertirse en hueso y ya no será adecuado para la uniónen las etapas finales de producción. En este caso, la oblea es más probable ya no es viable. Limpie con la Matriz de Aser durante 4 minutos, 100 W de potencia de RF. Pele el polisilicio con un grabador XeF 2 (Figura 3, paso 6). Puede ser necesario repetir el paso 1,4 y este paso varias veces para eliminar todos los revestimientos fotorresistente y poli.
- Gira obleas de capa con una nueva capa de m ~ 1 de fotoprotección para proteger a los canales durante la posterior manipulación. Taladre orificios de entrada y salida en cada chip utilizando un ordenador controlado con punta de diamante de perforación o de forma manual con un chorro de arena (Figura 3, el paso 7). Si se utiliza un taladro, montar la oblea (función hacia abajo) sobre una placa de vidrio con sacrificio de Aqua Bond 55, teniendo cuidado de mantener el adhesivo libre de burbujas. Enfriar el taladro con una solución de limpieza de micro-90. Esto mantiene pequeños trozos de vidrio se pegue a los canales que luego obstruyen el chip durante el uso.
- Lavar la oblea con agua DI usando una jeringa para inyectar water en cada agujero. Remojar en agua jabonosa por una hora. Retire fotosensible y Bond Aqua con ERP 2000 a 60 ° C durante varias horas hasta que la superficie esté limpia. Enjuague con agua desionizada la oblea y el agua tibia y jabón. Enjuagar cada agujero de nuevo con una jeringa, evitando características grabadas. Oblea en seco con nitrógeno y en un horno de vacío ajustado a 120 ° C. Inspeccione los orificios para asegurar que estén libres de arena y repita la limpieza medidas que sean necesarias. Medir la profundidad de los canales, ya sea con un perfilador superficie óptica o mecánica (Figura 3, paso 8).
- Obleas limpias y un número equivalente de 170 micras de espesor vidrios fusionados cubierta de sílice con 1) solución Piraña (1-2 horas de acuerdo con el procedimiento en 1,1), 2) 2 RCA (05:01:01 DI: HCl: H 2 0 2 ) solución durante 10 minutos a 75 ° C, 3) RCA 1 solución (5:1:1 DI: NH 4 OH: H 2 0 2) durante 22 minutos a 75C). Enjuagar con agua DI durante 5 minutos entre cada solución.
- Coloque una oblea características hacia arriba en la parte superior de launa pila de toallitas salas blancas 3-4 colocados en la parte superior de una superficie plana y rígida, tales como un pequeño panel de vidrio. Secar la oblea a fondo con gas nitrógeno durante al menos 5 minutos. Repita el procedimiento con cubierta de vidrio. Recogida de vidrio cubierta por el borde y se invierte de manera que el lado pulido está boca abajo a cabo sobre la oblea y alinear los bordes planos. Con cuidado, colocar la tapa de vidrio sobre la oblea y deje que se asiente. Empujar sólo horizontalmente para ajustar la alineación. Empujando hacia abajo con un dedo en el centro de la oblea. Uno debe ver un frente de unión empiezan a irradiar hacia el exterior. Si es necesario, aplicar presión adicional a otras posiciones alrededor de la oblea para avanzar el frente de unión (Figura 3, paso 9).
- Colocar las obleas sellados en un horno de alta temperatura fijado a la rampa de temperatura ambiente a 800 ° C durante 3 horas, a continuación, 800 a 1100 ° C durante otras 1,2 horas. Mantener a 1100 ° C durante 2 horas y, a continuación la rampa hasta la temperatura ambiente durante otras 1,5 horas.
- Dados con un corte en anillos de obleas vio en ifichas INDIVIDUALES (Figura 3, paso 10).
- El protocolo se describe la fabricación de canales en el sustrato de sílice fundida bastante inusual que es necesaria para la detección UV. Pero este protocolo también se puede adaptar para un sustrato de silicio que sólo requiere un paso de mordentado 2. Un vaso (pero no de sílice fundido) cubierta de vidrio se pueden unir a la oblea usando unión anódica.
2. Montaje y carga de chips
- El colector para mantener el chip de mezcla y soluciones pueden ser de plástico, tal como Lexan o plexiglás, o aluminio para el control de temperatura (véase Figura 4). Si se utiliza aluminio, los depósitos de solución debe ser revestido con parileno para prevenir la disolución de aluminio por las soluciones de sal en los depósitos. La temperatura del colector de todo, las soluciones y el chip se puede controlar con dispositivos termoeléctricos montado en los lados y un controlador electrónico.
- El chip está acoplado a la maniveces por pequeñas juntas tóricas y una mantiene en su lugar con un anillo de retención que permite una vista clara óptica del centro del chip. Las ranuras de junta tórica debe ser menos profunda que el estándar para asegurar un buen acoplamiento sin aplicar una presión excesiva en el chip, es decir, un 002 o-anillo debe ser 0,025 "de profundidad. Una vez que el chip está montado, añadir soluciones a los depósitos centrales y laterales , teniendo cuidado para liberar las burbujas atrapadas en el fondo de los pocillos.
- Debido a que los volúmenes utilizados en este mezclador son tan pequeñas, el flujo puede ser controlado con presión de aire aplicada por encima de los pocillos de la solución. Figura 4 muestra el colector de presión acoplado a la parte superior del colector de chip por juntas tóricas. La presión en el colector está conectado a transductores de presión controlados por el ordenador que pueden mantener las presiones de ~ 2-80 PSI. El chip ha sido diseñado de tal manera que las presiones iguales en los canales centrales y laterales producir un ~ 100-pliegue relación de las tasas de flujo lineal. A 20 psi, la velocidad de flujo lineal en el canal de salida es de ~ 1 m/ S.
- Coloque colector en un microscopio invertido y examinar mezclando región con el ocular o salida de la cámara. Una linterna incandescente colocada en la parte superior del colector proporcionará suficiente luz. Utilizar un índice de tinte o alta de la solución de refracción (es decir, 6 M de hidrocloruro de guanidina) en el canal central para ver del chorro.
- Al igual presión en los canales centrales y laterales, el chorro será difícil de ver por el ojo a fin de comenzar con la presión de canal lateral a 0 psi y aumente lentamente a la misma presión. Si un canal lateral está obstruido, el chorro será empujado contra una de las paredes del canal de salida. Si una obstrucción visible aparece, puede ser desalojado por la aplicación de presión o vacío para el canal de salida con una jeringa.
- Si la proteína u otro material orgánico obstruye el chip, se puede limpiar por inmersión en una solución Pirhana durante la noche.
3. Recopilación de datos
La Figura 5 muestra la disposición básica instrumento óptico.
- Llevar un rayo láser colimado en un microscopio de investigación de calidad usando un espejo dicroico, ya sea dentro o fuera del microscopio. Alinear el láser de manera que el enfoque se puede ver en el ocular o la cámara algo cerca de la región de mezcla.
- Fluorescencia de la proteína en el mezclador es recogido por el objetivo y se envía a través del espejo dicroico, enfocado por una lente a un agujero y la imagen en un contador de fotones. Analizar el chip usando un escáner piezoeléctrico en X e Y a la imagen de la región de mezcla (tamaño de paso típico es de 2 micras). Elija una posición en el chorro y exploración en X y Z para encontrar el foco en el centro del canal vertical. La profundidad de campo del microscopio es mucho menor que la profundidad del canal y el caudal es uniforme en el canal, excepto dentro de 1 micra de las paredes. Por lo tanto la resolución temporal de la fluorescencia observada está determinada principalmente por el tamaño de la mancha confocal.
- Scan horizontalmente dentro del canal de salida (típico paso sIze es de 0,2 m en todo el chorro, 2 micras a lo largo del chorro) en incrementos de 100 micras a lo largo del jet, de observación del ~ 1 ms por la posición (ver Figura 6). Mueva la platina del microscopio por 80-90 micras a lo largo del avión para captar los últimos tiempos.
- Alternativamente, la luz puede ser detectada por un espectrógrafo y CCD después de que el espejo dicroico utilizando una lente para enfocar la luz en la rendija de entrada. Dado que la recogida de datos es más lenta que para el contador de fotones (1 segundo por posición), típicamente el chorro se forma la imagen primero con el contador de fotones y, a continuación puntos a lo largo del chorro se miden con el espectrógrafo (ver Figura 7).
- Los datos del contador de fotones se analiza mediante la suma de 3-5 píxeles alrededor del avión en cada posición para crear un gráfico de intensidad frente a la distancia. El tiempo se calcula a partir de distancia usando una velocidad calculada sobre la base de las presiones aplicadas (ver Figura 8).
- Los datos de la espectrógrafo se puede analizar un par de maneras. Para FRET, canalizaráls designados como "donante" y "aceptor" cada uno puede ser resumido y la relación de proximidad E = I A / (I D + I D) calculada (véase Figura 9). Alternativamente, la descomposición solo valor se puede realizar a mirar independientes componentes espectrales en función del tiempo, tales como el cambio en el espectro de emisión triptófano como pliegues de proteínas.
- Distancia dentro del canal de salida se puede convertir en el tiempo mediante la velocidad de flujo constante determinada por la presión aplicada a los canales laterales. Dentro de los primeros 2 micras de la canal de salida, el caudal del chorro de proteína acelera ~ 100x y los tiempos en que la región debe ser calculado con el análisis de elementos finitos de las líneas de corriente (que produce los tiempos trazado en la Figura 8). Esta aceleración produce un desplazamiento de ~ 1-2 mS después de que la velocidad se hace constante y por lo general puede ser ignorado en la medición de la cinética mucho más lento que el de mezcla.
4. Los resultados representativos
La figura 6 muestra un gráfico de contorno de la intensidad en la región de mezcla medido por el contador de fotones. El fondo en el canal de salida fuera del chorro debe estar cerca de la base de ruido del detector y es típicamente no resta. Un fondo superior puede indicar una mala alineación o que la proteína se adhiera a las paredes del canal. Un avión que se ve doblada o torcida, especialmente cerca de la zona de mezcla, indica un grabado pobres de las boquillas.
La figura 7 muestra el tiempo de resolver los espectros de la proteína acil-coenzima A-proteína de unión (ACBP) marcado con Alexa 488 y Alexa 647. Estos datos se han restado de fondo para eliminar la carga oscura y la señal de láser. La señal de fondo fue tomada con la presión del canal central ajustado a 0 PSI.
El tiempo de mezclado se puede medir mediante la medición de una reacción rápida que es mucho más rápido que la mezcla tales como Trp extinción de fluorescencia by KI o colapso de ADN monocatenario, marcado con FRET colorantes, mediante la adición de NaCl. Debido a que el chorro es más pequeña que la resolución óptica del microscopio, hay una caída de gran intensidad en la zona de mezcla como las formas de chorro. Esta respuesta del instrumento puede ser retirado mediante una medición de control en el que ningún cambio solución condiciones. Figura 8 muestra la relación de mezcla (en 400 mM de KI) y no mezclar experimentos de N-acetil fluorescencia amida triptófano. La línea muestra la concentración prevista de KI de las simulaciones de COMSOL. El tiempo de mezcla, medido como el tiempo de la concentración para disminuir un 80%, es de 8 mS.
Puesto que los datos se recogen en incrementos de 100 micras a lo largo del canal de salida de 500 m de largo, los datos deben ser pegados juntos desde múltiples puntos de vista. Hay compensaciones ocasionalmente pequeñas en señal entre estos puntos de vista, probablemente debido a pequeños cambios en el foco como el chip se mueve por la platina del microscopio. Al mover la etapa 80 o 90micras punto de vista, estas compensaciones pueden ser eliminados mediante el examen de los datos se superponen. Típicamente los datos se recogen por lo menos con dos caudales y los datos se combinan para confirmar los cambios de señal son debidos a cambios reales espectroscópicas en la proteína, en lugar de efectos ópticos o de flujo. Figura 9 muestra la FRET cambios en la ACBP proteína después de la dilución de desnaturalizante de 6 M a 0,06 M. Estos datos no necesita de un experimento de control desde el FRET es ya una relación, y la respuesta del instrumento se retira ya. El salto rápido cerca de T = 0 representa un cambio rápido en FRET señal dentro del tiempo de mezclado.
Figura 1. Diseño de la región de mezcla medida por microscopía electrónica.
Figura 2. Esquema de hidrodinámica mezclando para estudiar el plegamiento de proteínas. La proteína,disuelto en desnaturalizante de alto para desplegarla, fluye por el canal central hacia la zona de mezcla donde se une con buffer de flujo de ~ 100 veces más rápido. El flujo laminar obliga al corriente de las proteínas en un estrecho chorro de la que las moléculas pueden difundir rápidamente desnaturalizantes. A medida que el chorro fluye hacia abajo del canal de salida, la proteína se puede observar con alta resolución espacial y tiempo utilizando un microscopio confocal.
Figura 3. Fabricación de sílice fundida. 1) El proceso se inicia con una muy pulida 500 micras de espesor del sustrato de sílice fundida (a) con una capa de polisilicio (poli) depositada sobre las superficies superior e inferior (b) y spin-revestido con una capa de fotoresist (c). 2) Un fotomáscara (e) se llevó int o contacto duro con la oblea y la fotoprotección es expuesto a luz UV (d). 3) La oblea se coloca en un baño de revelado y el patrón se revela en la fotoprotección. 4) La oblea se coloca en un DRIE y las características están grabados en el revestimiento superior de poli. El fotorresistente se retira entonces. 5) El poli actúa entonces como una máscara cuando la oblea se coloca en un grabador de óxido y las características están grabados 10 a 40 micras en el sustrato de sílice fundida. 6) El revestimiento poli se retira entonces en un grabador XeF 2. 7) La oblea está unido a una placa de vidrio de sacrificio con un sellador activado por calor (g), características lado hacia abajo, y una broca de diamante (f) abrasivamente taladros a través de los agujeros de la parte trasera. 8) Una perfiles de superficie (h) y luego mide directamente las profundidades de funciones grabadas. 9) A 170 m de espesor oblea fusionado cubreobjetos sílice está directamente unido en la superficie superior de la oblea. 10) La oblea se corta formando individuales chips de microfluidos.
3976/3976fig4.jpg "/>
Figura 4. El colector mezclador. El chip de microfluidos está asegurado al colector de solución con una placa frontal de aluminio mecanizado y cuatro juntas tóricas en los reservorios de ~ 200 l. Un agujero grande se mecaniza a través del centro del colector directamente encima de la región de mezcla de la fijada microfluidos chip, permitiendo que el exceso de luz UV para escapar sin retrodispersión, inhibiendo cualquier auto-fluorescencia del propio colector y permitir la iluminación directa del chip por ojo o una cámara para la alineación. Los sellos de colector de aire cada uno de los reservorios de tal manera que la presión del aire en cada pueden ser controlados a través de un cuadro de control de presión externa.
Figura 5. Esquema de microscopio confocal óptica.
Figura 6. Gráfico de contorno de triptófanofluorescencia en la mesa de mezclas de microfluidos. La región de mezcla se encuentra en ~ 90 micras en el eje y.
Figura 7. El tiempo depende espectros fluorescentes recogidos dentro de la mezcladora. Los rectángulos verdes y rojos muestran las longitudes de onda designados como canales donante y aceptor, respectivamente.
Figura 8. Tiempo de mezcla medida por extinción de la fluorescencia de triptófano por el yoduro de potasio (puntos y ejes de la derecha) y se calculó mediante el análisis de elementos finitos (de línea y eje izquierdo).
Figura 9. FRET cambios medidos durante el plegamiento de la proteína ACBP. El rápido aumento de cerca de t = 0 representa una fase de explosión en el tiempo de mezclado y el aumento más lento representa una acumulación gradual deción de la estructura como los pliegues de proteínas. Los datos se obtuvieron en dos caudales diferentes y superpuestos, dando lugar a diferentes densidades de mediciones en diferentes momentos.
Discussion
La mezcla rápida ha sido un objetivo de desarrollo para el campo de plegamiento de las proteínas durante muchos años, ya que hace tiempo se reconoce que los procesos moleculares de las biomoléculas se producen en escalas de tiempo que van desde picosegundos a los segundos. Convencionales de flujo detenido mezcladores tienen tiempos muertos de 5.1 ms, el cual está limitado principalmente por la turbulencia. Turbulentos mezcladores de flujo continuo con tiempos de mezcla de 30-300 mS se han desarrollado durante los últimos 15 años por un pequeño número de grupos, pero generalmente requieren altas velocidades de flujo para lograr estos tiempos de mezcla y por lo tanto, utilizan una gran cantidad de la muestra 6.8.
Este protocolo se describe el uso de chips de microfluidos de mezcla para lograr una rápida dilución en el régimen de flujo laminar. Hay múltiples ventajas para trabajar dentro de este régimen, pero un uno primaria es la capacidad para simular el proceso de mezcla con alta precisión que permite una para modificar la respuesta de mezcla. T-mezcladores desarrollados por otros grupos con un simple geometríaetries han demostrado tiempos de mezcla de 100-200 mS que estaban limitados principalmente por el tamaño de los canales 9-10. Por escalar el tamaño de los canales a Knight micras 10 reduce el tiempo de mezcla a 10 ~ 11 mS. Yao y Bakajin mostraron que pequeños cambios en la geometría podría conducir a mejoras significativas en el tiempo de mezclado 4. Sin embargo, ese trabajo muestra que la aceleración de la mezcla también se puede llevar a más lentas fases también. El diseño utilizado en este trabajo 12 a 13 es un compromiso entre los dos mejores diseños en la referencia 4 para minimizar la descomposición más lenta exponencial de la concentración de desnaturalizante y también para hacer que la característica más reproducible en el grabado DRIE.
Ha habido una cierta controversia en el campo de la mezcla ultrarrápida sobre la definición del tiempo de mezclado. Es importante reconocer la diferencia entre "tiempo de mezcla" y "tiempo muerto". El tiempo muerto se define en un mezclador turbulento como el tiempo durante el cual un MEDIDASt no se pueden hacer y de hecho puede ser significativamente más largo que el tiempo de mezcla real. Se determina típicamente por hacer varias mediciones de una reacción de pseudo primer orden bimolecular (tales como enfriamiento de triptófano fluorescencia por N bromosuccinate) a diversas concentraciones. Los decaimientos exponenciales observados están equipados para converger en un solo valor supone que t = 0 s y el tiempo entre dicho punto y el primer punto medido es el tiempo muerto. Para mezcladores de flujo laminar, las mediciones se pueden hacer durante el proceso de mezclado así que no hay tiempo muerto, sólo un tiempo de mezclado. El tiempo de mezclado es simplemente el tiempo para combinar dos soluciones hasta uniformidad suficiente se alcanza. Hemos definido previamente el tiempo de mezcla para ser un tiempo 90/10, el tiempo para la concentración de desnaturalizante para disminuir de 90% a 10% del valor sin mezclar. Sin embargo, la forma de la curva de mezcla no es perfectamente simétrico con la cola de la caries que tiene un componente exponencial pequeño. Además, el plegamiento de proteínas tiene unaltamente no lineal dependencia de la concentración de desnaturalizante de modo que a menudo plegable puede comenzar incluso si el desnaturalizante sólo se reduce por dos veces. Por lo tanto, se han definido más recientemente el tiempo de mezcla como el tiempo para reducir la concentración desnaturalizante en un 80%. Ciertamente otras definiciones se pueden utilizar dependiendo de los requerimientos del experimento.
El uso de este mezclador para estudiar el plegamiento de proteínas ha revelado consistentemente resultados sorprendentes. Plegado de citocromo C y apomyoglobin han sido estudiados para tener varios escalones plegables y los primeros resultados con los mezcladores de flujo continuo mostraron colapso que se produzca en el plazo de tiempo ~ 100 mS 10,14-15. Nuestras mediciones con este mezclador mostraba que había un mínimo de 2 pasos en esta escala de tiempo, un muy rápido, probablemente no específica, colapso (medida por fluorescencia Trp cambio espectral) dentro del tiempo de mezcla del mezclador seguido por una fase más lenta (como medido por el enfriamiento del total de emisiones Trp) que es probable que el frimero formación de la estructura nativa 5. También hemos observado un proceso de 50 mS en el dominio B1 de la proteína L, el vuelco a la interpretación convencional de que esta proteína es una carpeta de 2 estados 13.
Una ventaja de este mezclador rápido es que se puede investigar el plegamiento de las proteínas más rápidas plegables que han sido por lo general sólo medible por nanosegundos salto de T-instrumentos. T-salto requiere típicamente observación de plegado / desplegado relajación cerca de la temperatura de fusión de la proteína y por lo tanto, nunca sigue el plegamiento de toda la población. Con este mezclador hemos visto en el plegamiento de las γ-represor (λ 6-86) tanto con las emisiones totales Trp y desplazamiento espectral y no han encontrado evidencia de que la proteína no tiene ningún obstáculo para doblar en condiciones de fuerte plegables que no eran accesibles a T anteriores -salta las medidas 12. Finalmente hemos medido el plegado de la pieza de cabeza villina HP-35, una de tél más rápidas carpetas todavía midió y se encontró que la tasa de plegado medido después de la mezcla es de ~ 5 veces más lento que medido por T-salto en las mismas condiciones 16. Esto sugiere que la cinética de plegado depende de las condiciones de partida, el vuelco una suposición importante en el campo.
Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo es apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias FIBR (NSF EF-0623664) y IDBR (NSF DBI-0754570). Este trabajo fue parcialmente financiado por fondos de la National Science Foundation Grant FIBR 0623664 administrado por el Centro para la Biofotónica, una Ciencia NSF y el Centro de Tecnología, gestionado por la Universidad de California en Davis, conforme al Acuerdo Cooperativo PHY 0120999. La investigación de Lisa Lapidus, Ph.D. está apoyado en parte por un premio a la Trayectoria en la interfaz de la Ciencia con cargo al Fondo Burroughs Welcome.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AZ P4110 Photoresist | AZ Electronic Materials | ||
| AZ 400 K Developer | AZ Electronic Materials | ||
| Baker PRS 2000 photoresist stripper | Avantor Performance Materials | ||
| AquaBond | AquaBond Technologies | AquaBond 55 | |
| 500 μm cover wafer | SENSOR Prep Services | : 100 mm ± 0.5 mm Thickness: 0.5 mm ± 0.025 mm Standard Tolerances (Unless Noted) Surface Finish: SI: 4-8Å; SII: 8-12Å Flats: One Primary SEMI-STD; One Scribe Clean and Polished, Both Sides |
|
| 170 μm cover wafer | SENSOR Prep Services | 7980 2G Wafers | : 100 mm ± 0.5 mm Thickness: 0.17 mm ± 0.025 mm Standard Tolerances (Unless Noted) Surface Finish: SI: 4-8Å; SII: 8-12Å Flats: One Primary SEMI-STD; One Scribe Clean and Polished, Both Sides |
| Deep reactive ion etcher for oxides | ULVAC | ULVAC NL-6000 | |
| Argon Ion Laser | Cambridge Laser Laboratories | Lexel 95-SHG | λ=258 nm |
| Argon Ion Laser | Melles Griot | λ=488 nm | |
| Microscope | Olympus Corporation | IX-51 | |
| Microscope Objective | Thorlabs Inc. | OFR LMU-40X-UVB 0.5 NA | λ= 258 nm |
| Microscope Objective | Olympus Corporation | UPLSAPO 60XW 1.2 NA | λ=488 nm |
| Nanopositioner | Mad City Labs | Nano-LP100 | |
| Motorized Translation Stage | Semprex Corp | KL-Series 12-6436 | |
| GaAsP Photon Counter | Hamamatsu Corp. | H7421-40 | |
| Monochrometer | Horiba Instruments Inc | MicroHR | |
| CCD camera | Andor | iDus 420A-BU | |
| Guanidine hydrochloride (GuHCl) | Sigma-Aldrich | G4505 |
References
- Eaton, W. A. Fast kinetics and mechanisms in protein folding. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 29, 327-359 (2000).
- Hertzog, D. E. Femtomole mixer for microsecond kinetic studies of protein folding. Analytical Chemistry. 76, 7169-7178 (2004).
- Hertzog, D. E., Ivorra, B., Mohammadi, B., Bakajin, O., Santiago, J. G. Optimization of a microfluidic mixer for studying protein folding kinetics. Analytical Chemistry. 78, 4299-4306 (2006).
- Yao, S., Bakajin, O. Improvements in Mixing Time and Mixing Uniformity in Devices Designed for Studies of Protein Folding Kinetics. Analytical Chemistry. 79, 5753-5759 (2007).
- Lapidus, L. J. Protein Hydrophobic Collapse and Early Folding Steps Observed in a Microfluidic Mixer. Biophysical Journal. 93, 218-224 (2007).
- Bilsel, O., Kayatekin, C., Wallace, L. A., Matthews, C. R. A microchannel solution mixer for studying microsecond protein folding reactions. Review of Scientific Instruments. 76, (2005).
- Chan, C. -K. Submillisecond protein folding kinetics studied by ultrarapid mixing. PNAS. 94, 1779-1784 (1997).
- Shastry, M. C. R., Luck, S. D., Roder, H. A continuous-flow capillary mixing method to monitor reactions on the microsecond time scale. Biophysical Journal. 74, 2714-2721 (1998).
- Pollack, L. Compactness of the denatured state of a fast-folding protein measured by submillisecond small-angle x-ray scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 10115-10117 (1999).
- Takahashi, S. Folding of cytochrome c initiated by submillisecond mixing. Nature Structural Molecular Biology. 4, 44-50 (1997).
- Knight, J. B., Vishwanath, A., Brody, J. P., Austin, R. H. Hydrodynamic focusing on a silicon chip: Mixing nanoliters in microseconds. Physical Review Letters. 80, 3863-3866 (1998).
- DeCamp, S. J., Naganathan, A. N., Waldauer, S. A., Bakajin, O., Lapidus, L. J. Direct Observation of Downhill Folding of lambda-Repressor in a Microfluidic Mixer. Biophysical Journal. 97, 1772-1777 (2009).
- Waldauer, S. A.
- Shastry, M. C. R., Roder, H. Evidence for barrier-limited protein folding kinetics on the microsecond time scale. Nature Structural Biology. 5, 385-392 (1998).
- Uzawa, T. Collapse and search dynamics of apomyoglobin folding revealed by submillisecond observations of alpha-helical content and compactness. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 1171-1176 (2004).
- Zhu, L. Evidence of Multiple Folding Pathways for the Villin Headpiece Subdomain. The Journal of Physical Chemistry B. 115, 12632-12637 (2011).
