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Immunology and Infection

Diferenciação de células Dirigido tronco pluripotentes induzidas no sentido de Linfócitos T

Published: May 14, 2012 doi: 10.3791/3986
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, Pennsylvania State University College of Medicine

Summary

Geração de linfócitos T de tronco pluripotentes induzidas (iPS) células dá uma abordagem alternativa de utilização de células-tronco embrionárias para T imunoterapia baseada em células. O método mostra que, utilizando quer

Abstract

Transferência adoptiva de células (ACT) de linfócitos-antigénio específico CD8 + T citotóxicos (CTLs) é um promissor no tratamento de uma variedade de doenças malignas 1. CTLs podem reconhecer as células malignas, interagindo antigénios tumorais com os receptores de células T (TCR), e citotoxinas de libertação, bem como as citocinas para matar as células malignas. Sabe-se que menos diferenciadas e central-memória (denominado como altamente reactivo) CTLs são a população óptima para ACT-baseado em imunoterapia, porque estes CTLs têm um elevado potencial proliferativo, são menos propensas a apoptose de células mais diferenciadas e têm uma maior capacidade de responder às citocinas homeostáticos 2-7. No entanto, devido a dificuldades na obtenção de um elevado número de CTLs tais partir de pacientes, há uma necessidade urgente de encontrar uma nova abordagem para gerar altamente reactivos Ag-CTLs específicos para o êxito ACT-terapias baseadas.

TCR transdução do caule auto-renovávelAs células para a reconstituição imunológica tem um potencial terapêutico para o tratamento de doenças 8-10. No entanto, a abordagem para obter células-tronco embrionárias (CES) de pacientes não é viável. Embora a utilização de células estaminais hematopoiéticas (HSCs) para fins terapêuticos tem sido amplamente aplicada na clínica 11-13, HSCs ter reduzido a diferenciação e capacidades proliferativas, e HSCs são difíceis de expandir-se em cultura de células in vitro 14-16. Tecnologia de célula iPS recente eo desenvolvimento de um sistema in vitro para a entrega do gene são capazes de gerar células iPS de pacientes sem qualquer abordagem cirúrgica. Além disso, como os CES, as células iPS possuem capacidade proliferativa indefinido in vitro, e têm sido mostrados para se diferenciarem em células hematopoiéticas. Assim, as células iPS têm um maior potencial para ser usado em ACT-baseado em imunoterapia em comparação com os CES ou HSCs.

Aqui, nós apresentamos métodos para a geração de linfócito Tcitos de iPS células in vitro, e em programação in vivo de antigénios específicos de CTLs de iPS células para promover a vigilância do cancro imune. Estimulação in vitro com um ligando Notch impulsiona a diferenciação das células T a partir de células iPS, e os resultados de genes de TCR de transdução em células iPS diferenciar em específicas de antigénio de células T in vivo, o que impede o crescimento do tumor. Assim, demonstramos antigénio-específica diferenciação de células T a partir de células iPS. Os nossos estudos proporcionam uma abordagem potencialmente mais eficiente para a geração de antigénio-CTLs específicos para o ACT terapias baseadas e facilitar o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para doenças.

Protocol

1. Cultura de Células

  1. Preparação das células de alimentação irradiadas SNL76 / 7 (irSNL76 / 7) para a cultura.
    SNL76 / 7 células são geralmente mantidas em 10% de soro fetal bovino (FBS) Dulbecco modificado por Eagle (DMEM) meios de comunicação.
    1. Um prato de cultura ou frasco vai ser revestida com 0,1% de solução de gelatina em 37 ° C; incubadora durante 30 minutos, antes de recuperar SNL76 / 7 células a partir de azoto líquido.
    2. Quando SNL76 / 7 células atingem a confluência, as células serão tripsinizadas fora, centrifugado a 400 g durante 5 min e ressuspensas em meio fresco.
    3. Ressuspensas SNL76 / 7 células serão irradiados num irradiador de 60 Co com uma dose de 5000 rads.
      Abordagem alternativa, as células SNL76 / 7 poderia ser substituído por fibroblastos embrionários (MEF) e mitomicina inactivação podem substituir-se a irradiação.
    4. Após a irradiação, as células serão centrifugado a 400 g durante 5 min e ressuspensas em 10% sulfóxido de dimetilo (DMSO) FBS tampão de congelação, em alíquotacriotubos e conservados em azoto líquido para uso futuro.
  2. Preparação de OP9-DL1 células para diferenciação in vitro.
    OP9-DL1 células serão geralmente mantidas em 20% de FBS médio α-mínimo essencial (MEM)-α meios de comunicação. Quando eles atingem a confluência as células será dividida em uma diluição de 1:5.
  3. Preparação de células E.G7 timoma.
    E.G7 células timoma será geralmente mantidas em 10% de FBS Roswell Park Memorial Institute (RPMI) -1640 meios de comunicação. Quando eles atingem a confluência, as células será dividida em uma diluição de 1:10.
  4. Manutenção geral de iPS e as células TCR-transduzidas iPS.
    1. Um prato de cultura irá ser revestida com 0,1% de solução de gelatina em 37 ° C durante 30 minutos antes da semeadura células alimentadoras irSNL76 / 7 um dia antes da recuperação ou de divisão de células iPS.
    2. Para IPS divisão das células, as células serão tripsinizadas fora, centrifugado a 400 g durante 5 min e ressuspensas em 15% de FBS meio DMEM.
    3. IPS tripsinizadascélulas serão incubados num prato de cultura fresco durante 30 minutos em 37 ° C antes da semeadura incubadora no prato de células frescas irSNL76 / 7 alimentador pré-revestidas de excluir células diferenciadas e células de alimentação de resíduos.
    4. Após a incubação, 4 x 10 6 células serão semeadas em um prato de cultura de 100mm.

2. Em programação vitro

  1. In vitro sistema de cocultura.
    1. No Dia 0, as células 5x10 4 iPS será semeadas num prato de cultura contendo 100 milímetros monocamada de células confluentes OP9-DL1 em 20% de FBS α-MEM meios de comunicação.
    2. No Dia 3, meios de cultura será alterada por novos.
      1. No Dia 5, as células serão tripsinizadas fora e centrifugado a 400 g durante 5 min antes da incubação num prato de cultura fresco 100 milímetros por 30 minutos em 37 ° C incubadora.
      2. Células flutuantes serão recolhidas e contadas, 5x10 5 células serão transferidos para uma cultura frescaprato contendo monocamada de células confluentes OP9-DL1 em ​​20% de FBS α-MEM mídia. Cytokine mFlt-3L (concentração final: 5 ng / mL) será adicionado na cultura.
      1. No Dia 8, as células frouxamente conectados será gentilmente pipetar para baixo.
      2. Lavar a fase de alimentação OP9-DL1 com 10 mL de PBS mais uma vez para obter a recuperação máxima de células parcialmente diferenciadas iPS.
      3. Após a colheita de células a partir da co-cultura, as células serão centrifugado a 400 g durante 5 min e ressuspensas em 20% de FBS a-MEM meios suplementados com mFlt-3L (5 ng / mL) e mIL-7 (1 ng / mL).
      4. As células serão transferidos para uma placa de cultura de 6 poços revestidos com confluentes OP9-DL1 células. Normalmente as células iPS recuperados a partir de um prato de cultura 100 milímetros será transferido para um poço da placa de 6 poços.
      1. A partir do dia 10, os meios de cultura será alterada em todos os outros dias (20% de FBS α-MEM meios supplemented com mFlt-3L (5 ng / mL) e mIL-7 (1 ng / mL)).
      2. As placas de cultura revestidas com alimentador OP9-DL1 células serão alterados em 4-6 dias, dependendo do crescimento das células de alimentação.
  2. Em maturação in vivo de células diferenciadas parcialmente iPS.
    1. No Dia 22 de co-cultura, as células iPS será tripsinizadas fora, centrifugado a 400 g durante 5 min e incubou-se em um prato de cultura fresco em 37 ° C durante 30 minutos.
    2. Células flutuantes serão recolhidos, passados ​​através de 70 coador de nylon iM para excluir aglomerados de células que podem causar embolia pulmonar a ratinhos e lavado três vezes em PBS frio.
    3. As células serão ressuspensas em PBS com uma concentração de 1.5x10 7 células / mL.
    4. As células serão mantidas em gelo antes da injecção.
    5. Antes de injecção iv através da veia da cauda, ​​os ratinhos irá ser colocado sob uma luz infravermelha para dilatar a sua veia da cauda.
    6. Depois veia dilatation, 200 ul de suspensão de células ou 3x10 6 células serão adotivamente transferida para um semanas de idade 4 B6.129S7-RAG1 tm1Mom / J-rato através da sua veia da cauda. Três semanas são permitidos para a maturação in vivo de células parcialmente diferenciadas iPS.
  3. Avaliação.
    1. As alterações morfológicas de células diferenciadas e as taxas de recuperação celular. Figura 1.
      1. Em dias diferentes de co-cultura com células OP9-DL1, imagens de células vivas será levado ao microscópio convencional.
      2. As taxas de recuperação de células será calculado com base no número de células que colhidas a partir de cultura.
    2. Análise de citometria de fluxo de alterações marcador de superfície. Figura 2a.
      1. No dia diferentes de co-cultura, as células serão removidas da cultura por tripsinização e lavada com PBS frio antes de prosseguir para a coloração da superfície celular.
      2. Antes da coloração, sagacidadeh diferentes fluorocromos anticorpos conjugados, as células será bloqueado pelo bloqueador de Fc 24G2 em 4 ° C durante 20 minutos.
      3. Após 20 minutos de coloração em 4 ° C, as células serão lavadas três vezes em PBS frio antes do exame por citometria de fluxo.
    3. Ativação de células in vitro diferenciados iPS Figura 2b..
      1. Um dia antes do ensaio de activação, pré-revestimento de uma placa de 24 poços com anti-CD3 (concentração final: 4 ug / mL, em PBS) a 4 ° C durante a noite.
      2. No dia 22 de co-cultura, as células iPS derivadas de células T serão colhidas a partir de cultura e lava-se com PBS frio antes de estimular com a placa revestida com anti-CD3 e anti-CD28 solúvel anticorpos (concentração final: 4 ug / mL).
      3. De incubação serão levadas a cabo em 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora durante 40 horas e em seguida Befeldin A irá ser adicionados em cultura durante mais 4 horas.
      4. No final da co-cultura, as células serão Haradquirido, lavou-se e bloqueado por bloqueador Fc, tal como descrito acima. Células bloqueadas serão coradas para marcadores de superfície como CD8 e TCR cadeia Vp usando fluorocromos anticorpos conjugados.
      5. Após a coloração da superfície celular, as células serão fixadas usando formaldeído a 4% e permeabilizadas usando kit Biolegend de permeabilização.
      6. Depois de permeabilização, as moléculas intracelulares como IL-2 e IFN-γ serão coradas usando fluorocromos anticorpos conjugados.
      7. Antes do exame por citometria de fluxo final, as células serão lavadas três vezes em PBS frio para excluir anticorpos excessivos.
    4. Maturação em Rag-/ - ratos.
      1. Após três semanas de desenvolvimento in vivo, Rag-/ - ratinhos serão sacrificados, baço e nódulos linfáticos será removido de ratos.
      2. Células individuais serão processadas através de avaria mecânica. As células vermelhas do sangue irá ser lisadas usando tampão de lise ACK emononucleocytes serão recolhidos e lavados duas vezes em PBS frio.
      3. Após lavagem, as células serão bloqueadas com um bloqueador de Fc 24G2 em 4 ° C durante 20 minutos e ao fim de bloqueio, as células serão coradas com diferentes fluorocromos conjugados anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8 e anti-TCRβ anticorpos no 4 ° C durante 20 minutos.
      4. No final da coloração, as células serão lavadas três vezes em PBS frio antes do exame por citometria de fluxo.

3. Em programação vivo

  1. Geração de construção retroviral.
    1. MSCV-IRES-DsRED vector (IDRM) é construído com base em MSCV-IRES-GFP vector através da substituição do gene GFP com o gene DsRED.
    2. OT-I T gene do receptor de célula é subclonado no vector MIDR para fazer OT-I/MiDR construir.
  2. Transdução retroviral e separação de células.
    1. Plat-E embalagem células ARe usada para gerar pseudovirus que será usado para a transdução seguinte.
      1. 3x10 6 Plat E-células são semeadas num prato de cultura 100 milímetros um dia antes da transfecção.
    2. No dia 0, Plat-E células serão transfectadas com OT-I MIDR plasmídeo usando GeneJamma reagente de transfecção.
    3. No dia 1, 6 1x10 células iPS será semeadas em um poço de uma placa de 0,1% de gelatina de 24 poços pré-revestidas.
      1. No dia 2, pseudovirus contendo sobrenadante de cultura Plat-E serão recolhidos e passada através de um 0,4 uM filtro para excluir contaminantes potenciais.
      2. Transdução irá ser realizado sob a condição de 32 ° C de centrífuga a 1400 rpm durante 1 hora na presença de 5 ug / ml de polibreno.
      3. Após centrifugação baseado transdução, as células serão colocados em 32 ° C, 5% de CO 2 incubadora durante a noite.
    5. No dia 3, repita o dia 2 transduction procedimento como descrito acima. Uma placa de 6 poços serão pré-revestidos com células irSNL76 / 7 de alimentação para uso futuro.
    6. No dia 4, as células transduzidas iPS será tripsinizadas fora, centrifugado a 400 g durante 5 min e semeado em células de alimentação pré-revestidas irSNL76 / 7.
    7. Na confluência, as células serão tripsinizadas fora, centrifugado a 400 g durante 5 min e processados ​​para separação de células. GFP e DsRED células duplo positivas serão classificados por MoFlo classificador de células. Células classificadas serão cultivadas em células irSNL76 / 7 de alimentação para uso futuro.
  3. Transferência adotiva e desafio tumor.
    OT-I TCR transduzidas IPS (OT-I/iPS) células são geralmente mantidas em células alimentadoras irSNL76 / 7 como descrito acima.
    1. No dia da transferência adoptiva, as células são tripsinizadas OT-I/iPS fora, centrifugado a 400 g durante 5 min e ressuspensas em meio fresco.
    2. 30 minutos de incubação em um prato de cultura fresco em 37 ° C incubadora é necessária para eliminar a célula diferenciadae alimentadores células remanescentes.
    3. No final da incubação, as células flutuantes será recolhido e centrifugado a 400 g durante 5 min.
    4. Pellet celular irá ser lavadas em PBS frio, por três vezes, e as células será passada através de um filtro de nylon 70 uM em duas lavagens de entre a excluir aglomerados de células (2X filtração).
    5. Após lavagem, as células serão contadas e ressuspensas em PBS frio numa concentração de 1.5x10 7 células / ml.
    6. As células serão mantidas em gelo antes da injecção.
    7. Para a transferência adoptiva, 4-6 semanas de idade ratinhos fêmea C57BL/6J será usado. Antes iv injeção através da veia da cauda, ​​os camundongos serão colocados sob uma luz infravermelha para dilatar veias da cauda.
    8. Depois de dilatação da veia, 200 ul de suspensão de células ou 3x10 6 células serão adotivamente transferida através da veia da cauda. Seis semanas serão permitidos para a maturação in vivo de OT-I TCR transduzidas células iPS.
      1. Após seis semanas de injecção iv, 4x10 células E.G7 6 timoma irá ser inoculados por via intraperitoneal.
      2. E.G7 células timoma serão colhidas a partir de cultura e lavadas três vezes em PBS.
      3. No final da lavagem, as células são suspensas em PBS frio numa concentração de 8x10 7 células / ml.
      4. 50 ul de suspensão de células ou 4x10 6 células será injectado na cavidade peritoneal.
  4. Avaliação.
    1. In vitro caracterização de OT-I TCR transduzidas células iPS.
      1. Fluorescente exame microscópico de DsRED, GFP duplas células positivas irá ser realizada sob microscópio de fluorescência convencional com células vivas não fixadas.
      2. Integração de genes e expressão serão analisados ​​por ambos os PCR e análise de RT-PCR.
        1. DNA ou RNA celular irá ser isolado separadamente a partir de amostras usando DNA Qiagen ouRNA kit de isolamento.
        2. PCR e RT-PCR será realizada utilizando iniciadores que reconhecem especificamente a região VDJ recombinada de TCR cadeia Vβ5.
    2. Desenvolvimento da célula T e maturação. Figura 3a.
      1. Na semana 2, 4 e 6 pós célula de transferência animal, serão sacrificados e os gânglios linfáticos, baço, será removido do animal.
      2. Suspensão de células única será feita através de avaria mecânica. As células vermelhas do sangue irá ser lisadas usando tampão de lise ACK e mononucleocytes serão recolhidos e lavados duas vezes em PBS frio.
      3. Após lavagem, as células serão bloqueadas com um bloqueador de Fc 24G2 em 4 ° C durante 20 minutos e ao fim de bloqueio, as células serão aliquotado e coradas com anticorpos conjugados diferentes fluorocromos em 4 ° C durante 20 minutos.
      4. No final da coloração, as células serão lavadas três vezes em PBS frio antes de carregar no citómetro de fluxo.
    3. Estimulação péptido. Figura 3b.
      1. No dia 50 de desafio tumor, os animais serão sacrificados e os gânglios linfáticos, baço, será removida a partir de animais.
      2. Suspensão de células única será feita através de avaria mecânica. As células vermelhas do sangue irá ser lisadas usando tampão de lise ACK e mononucleocytes serão recolhidos e lavados duas vezes em PBS frio.
      3. Células T CD8 + irá ser isolado usando CD8 Miltenyi Biotec de + T kit de isolamento de células. Células isoladas T CD8 + vai ser misturado com esplenócitos irradiados isoladas de ratinhos naive C57BL/6J na proporção de 1:10 e pulsadas com 0,5 mmol / OVA ml 257-264 péptido durante 40 horas. Posteriormente, Brefeldin Um será adicionado à cultura durante mais 4 horas.
      4. No final da co-cultura, as células serão colhidas, lavadas e bloqueadas por bloqueador Fc, tal como descrito acima.
      5. Células bloqueadas será manchada por marca sobre a superfícieers como CD8 e TCR cadeia Vβ5 usando fluorocromos anticorpos conjugados.
      6. Após a coloração da superfície celular, as células serão fixadas usando formaldeído a 4% e permeabilizadas usando kit permeabilização celular.
      7. Depois de permeabilização, as moléculas intracelulares como IL-2 e IFN-γ serão coradas usando fluorocromos anticorpos conjugados.
      8. Antes do exame por citometria de fluxo final, as células serão lavadas três vezes em PBS frio para excluir anticorpos excessivos.
    4. In vivo matando ensaio. Figura 3C.
      1. Esplenócitos de ratinhos naive C57BL/6J irá ser isolado e marcado com carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) como células alvo.
      2. Células marcadas com 5 mmol / CFSE ml (células hi CFSE) será pulsadas com 10 ug / ml OVA 257-264 péptido e células marcadas com 0,5 mmol / CFSE ml (células CFSE Io) não irá ser pulsada. Uma mistura de 2.5x10 6 células CFSE hi mais 2.5x10 6 células CFSE Io será adotivamente transferido por injecção iv em destinatário indicado.
      3. Após 16 horas, os esplenócitos de ratinhos esses serão isoladas e células + CFSE serão analisados ​​por citometria de fluxo.
    5. Contagem de células intraperitoneal tumor. Figura 4.
      No dia 20 de desafio do tumor, os ratos serão sacrificados e lavagem da cavidade peritoneal será executada usando PBS frio. Lavagem peritoneal recuperado células tumorais serão contadas.
    6. Tumor infiltrante células T de identificação. Figura 5.
      1. Na fase tardia da inoculação do tumor, os ratos serão sacrificados e tumor será removido a partir da cavidade peritoneal a partir de diferentes grupos.
      2. Tumor será cortado em pedaços; uma peça vai ser colocado em um criotubo e colocados em gelo seco imediatamente, a outra metade será corrigido em paramaldehyde e uma terceira peça irá ser preservada em condicionado RPMI-1640 suportes para uso futuro.
      3. Coloração H & E será realizada de acordo com o protocolo geral de fixo formaldeído e amostras envoltos em parafina.
      4. Coloração imunofluorescente serão realizados em amostras criopreservadas.
        1. Tecido será seccionado e conservado em -20 ° C antes da utilização.
        2. As secções de tecido será seco ao ar 15 minutos antes dos 15 minutos de fixação acetona fria.
        3. Após a fixação, as secções será seco ao ar durante mais 15 minutos antes de 5 minutos de lavagem PBS.
        4. Depois de lavagem, de lugar lâminas numa câmara húmida e cobrir a secção de tecido com 30 ul de BSA a 3% em PBS durante 30 minutos para bloquear a ligação não específica.
        5. No final de bloqueio, blot fora tampão de bloqueio e cobrir secções de tecido com uma mistura de 50 ul de anticorpos Vα2 PE-anti-TCR e FITC-anti-OVA anticorpos diluídos em BSA a 3%em PBS.
        6. Incubar numa câmara húmida durante 2 horas e no final da incubação, as lâminas serão lavadas três vezes em PBS frio e montado com um suporte à base de água de montagem antes fluorescente exame microscópico.
      5. Análise de citometria de fluxo de tumor infiltrante células T.
        1. Tumor será comprimida em suspensão de células individuais e as células vermelhas do sangue irá ser lisadas por tampão de lise ACK.
        2. Após lavagem e bloqueio, as células serão marcadas com diferentes fluorocromos anticorpos conjugados que reconhecem especificamente células CD8, TCR Vα2 e TCR V β5 moléculas que expressas na superfície celular.
    7. Sobrevivência Mouse. Figura 6.
      Após a inoculação do tumor, a sobrevida do mouse irá ser cuidadosamente monitorizados.

4. Os resultados representativos

CD3 e TCRβ são utilizados como marcadores de Tcélulas. Para determinar se a estimulação de células iPS com o ligando Notch DL1 poderia contribuir para a diferenciação de células T, avaliou-se a expressão de CD3 + e TCRβ sobre IPS células derivadas das células, e de expressão ainda analisada de células T CD4 e CD8, gating em CD3 + e + TCRβ população. Como mostrado aqui, no dia 22, CD3 + TCRβ + CD4 - CD8 + individuais células positivas (SP) T foram gerados a partir de iPS células in vitro. Além disso, as células iPS células derivadas de SP foram capazes de produzir IL-2 e IFN-γ quando estimulados in vitro por placa revestida anti-CD3 e anti-CD28 solúveis anticorpos (Fig. 2), sugerindo que as células iPS derivado As células T são funcionais.

Após a transferência adoptiva em ratinhos receptores, a maioria dos TCR-gene células transduzidas iPS foram submetidos a diferenciação em células CD8 + CTLs, que responderam à estimulação in vitro de péptidos por si sócreting IL-2 e IFN-γ (Fig. 3). Mais importante ainda, a transferência adoptiva de células transduzidas TCR-iPS gerou infiltração de OVA-reactivos CTLs em tecidos tumorais e animais protegidos do desafio do tumor (Fig. 5-6). Células Assim, o gene do TCR-transduzidas IPS pode diferenciar-se em funcionais específicas de antigénio CTLs in vivo.

A Figura 1
Figura 1. Morfologia de iPS diferenciação celular. Em vários dias, as células iPS rato foram co-cultivados com OP9-DL1 células em α-MEM suplementado com FCS 20% e bicarbonato de sódio 2,2 g / L, na presença de 5 ng / ml mFlt3L e 1 ng / ml mIL-7 .

A Figura 2
Figura 2. Diferenciação de células T a partir de células iPS. As células de rato iPS foram co-cultivados com OP9-DL1 células, como descrito na Figura 1. Em day 22, iPS células derivadas de células foram isolados e analisados. A) CD4 + CD8 - ou CD4 - células CD8 + após gating sobre CD3 + e TCRβ + de populações. B) As células foram estimuladas com placa revestida com anti-CD3 e anti-CD28 solúvel anticorpos durante 5 horas a 37 ° C a 5% de CO 2. IL-2 e IFN-γ foram analisados ​​por coloração intracelular, após gating em CD4 vivos - células T CD8 +.

A Figura 3
Figura 3. Antigen-CD8 + específicas de desenvolvimento de células T a partir de iPS células in vivo. Células OT-I TCR gene transduzidas iPS foram injectados iv em ratinhos C57BL / 6. Depois de seis a dez semanas, OVA-CD8 + específicas Vβ5 + desenvolvimento de células T foi determinada. A) As células CD8 + Vβ5 + T a partir de LNs pooled e baço foram analisadas por citometria de fluxo, após gating em CD8 populações +. B) A IL-2 e IFN-γ de produção (linhas escuras; áreas sombreadas indicam controlos isotípicos) foram determinados através de coloração de citocinas intracelular, após gating em + Vβ5 as CD8 + populações. C) In vivo ensaio de proliferação / citotoxicidade. CFSE oi (picos à direita) e eis CFSE (picos à esquerda), células alvo foram pulsadas com o péptido 257-264 OVA e do controlo, respectivamente, e foram injectados em ratinhos dez semanas após a transferência de células iPS ou um dia após OT-I de transferência de CTL.

A Figura 4
Figura 4. A transferência adoptiva de OT-I TCR-gene células transduzidas iPS suprime o crescimento do tumor. Células OT-I TCR gene-transduzidas iPS foram transferidos adotivamente em camundongos C57BL / 6. Um grupo de ratinhos foi injectado com OVA-reactivo células T CD8 + a partir de OT-I TCRatinhos transgénicos R, e um grupo de ratinhos não tinham transferência de células. Após ambos os seis semanas ou no dia seguinte, após a transferência de células, os ratinhos foram submetidos a desafio com células tumorais de E. G7. No dia 20, células tumorais na cavidade peritoneal foram enumerados.

A Figura 5
IPS Figura 5. Derivada da célula antigénio específico CTLs infiltrado em tecidos tumorais. No dia 30-35 após a inoculação do tumor, os tecidos tumorais foram examinados para tumor reactivo infiltração de células T. A) coloração H & E. As células inflamatórias infiltradas nos tecidos tumorais (↓). B) coloração imuno. OVA-específica Vα2 + CTLs (vermelho), infiltrados em OVA-expressam tecidos tumorais (verde). C) Single-celulares suspensões a partir de tecidos tumorais foram analisados ​​para a expressão de Vα2 + e Vβ5 + por citometria de fluxo, após gating sobre a população CD8 +.

"Figura Figura transferência 6. Adotiva de OT-I TCR gene-transduzidas células iPS sustenta a sobrevivência mouse. TCR OVA-gene células transduzidas iPS foram transferidos para adotivamente C57BL / 6 ratos que foram submetidos a desafio com E. G7 células tumorais como descrito na fig. 4. Sobrevivência do rato no dia 50 foi mostrado por curvas de sobrevivência Kaplan-Meier (n = 6).

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Discussion

Para ACT-terapias baseadas, o em geração in vitro de um grande número de altamente reactivos Ag-específicos de células T in vivo para re-infusão é uma abordagem ideal. Embora o nosso método in vitro dá origem de células T funcionais a partir de células iPS, um grande número de iPS células derivadas de células morrem em quatro semanas, especialmente na quarta semana. Concluímos que os sinais de sobrevivência a partir do entalhe de sinalização mediada pelo DL1, bem como a IL-7 e FLt3L não são suficientes para manter a sobrevivência de células derivadas iPS células T progenitoras, os factores de sobrevivência outros podem ser cooperativa regular estas maturação da célula. TCR transdução de genes e estimulação in vitro com o ligando Notch diferenciação celular em grande parte directa T a partir de células iPS, no entanto, o IPS células derivadas de antigénios específicos de células T ainda não é possível a sobrevivência mais longo, o que impede a obtenção de um número adequado de iPS derivada da célula-antigénio células T específicas para o ACT-baseado em imunoterapia.

ve_content "> O desenvolvimento dos linfócitos T no timo é um processo bem ordenada. Os timócitos imaturos que faltam expressão de CD4 e CD8 são referidos como duplos negativos (DN) células. precursores DN são divididos em subconjuntos de desenvolvimento baseado na expressão de CD44 e CD25:. DN1 (CD44 + CD25 -), DN2 (CD44 + CD25 +), DN3 (CD44 - CD25 +) e DN4 (CD44 - CD25 -) Somente DN3 células que geraram uma cadeia TCRβ funcional, que os pares com a invariantes pré-Tα e CD3 cadeias para formar uma pré-TCR e são selecionados para uma maior diferenciação. Este evento, denominado β-selecção, representa o primeiro ponto de verificação durante o desenvolvimento de células T. Pré-TCR formação proliferação de sinais, a rescisão de rearranjo lócus TCRβ , e diferenciação de timócitos DN para as células CD4 + CD8 + duplo positivo fase (PD) 17. O nosso estimulação in vitro wom o entalhe ligando DL1 dirige as células iPS para passar através do ponto de verificação β-selecção em 2 semanas, e tornar-se pré-células T (CD3 + TCRβ +; CD25 - CD44 -; CD4 - CD8 -). A estimulação de 2 semanas adicionais permite pré-células T para o trânsito em madura células T CD8 + (CD3 + +; TCRβ CD4 CD8 + -; CD62L + CCR7 + CD27 + CD127 +). As células maduras SP T morrerão na ausência de um estímulo mais pelo TCR e complexo CD3.

Em programação in vivo de antigénios específicos de CTLs de iPS células podem ultrapassar a deficiência para obter um número suficiente de células T para ACT-terapias baseadas. Apesar do controlo do crescimento do tumor observada, identificou-se algumas limitações de ACT com células de TCR-gene transduzidas iPS. Em primeiro lugar, pelo menos, seis semanas em desenvolvimento in vivo é essencial para a diferenciação de células-T derivado do transferred células iPS. Em segundo lugar, notamos a perda da pele, osteoporose e outras pequenas manifestações auto-imunes em camundongos que receberam TCR-transduzidas células iPS como observado em alguns estudos clínicos administram imunoterapia de câncer de células T-based. Estes efeitos podem ser causados ​​pela geração de outros tipos de células imunitárias a partir das células transferidas iPS. No entanto, como estas células são geradas in vivo permanece desconhecida. Transferência, Terceira adoptiva de células de TCR-gene transduzidas iPS tem o risco de gerar teratoma por causa do seu fenótipo haste. Mas até agora em nosso estudo, apenas identificado massa extrathymic em um RAG1 - / - mouse e não observaram anormalidade na C57BL convencional / 6 ratos. Portanto, sugerimos, para ganhar o máximo de eficiência, é melhor ter jogo de fundo genético para diferenciação in vivo iPS.

Em contraste com os derivados dos CES, a expressão do gene anormal em algumas células diferenciadas a partir de células iPS têm a potential para induzir células T dependente da resposta imune em receptores singénicos 18. Portanto, a imunogenicidade de células derivadas de células específicos do paciente iPS deve ser avaliada antes de qualquer aplicação clínica destes células autólogas é contemplado. Através da análise dos perfis de expressão genética de IPS-célula células derivadas, tem sido mostrado que um grupo de 9 genes (Hormad1, Zg16, Cyp3a11, Lce1f, Spt1, Lce3a, Chi3L4, Olr1, RETN) foram expressos em níveis anormalmente elevados . Além disso, a expressão indução de três destes genes (Hormad1, Zg16 e Cyp3a11) em células ES aumentou significativamente a imunogenicidade de transplante em receptores geneticamente compatíveis 18. Assim, o grupo de 9 proteínas tem o potencial para causar a rejeição imunitária das células derivadas iPS células após a transferência adoptiva, e podem representar marcadores imunogénicas. Não obstante, a imunogenicidade potencial de célula-de iPSOs linfócitos T RIVED não foi determinada.

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Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Agradecemos ao Dr. Shinya Yamanaka (Universidade de Kyoto) para a prestação de iPS-MEF-Ng-20D-17 linha celular, Dr. Dario Vignali (Hospital St. Jude Children Research) para apoiar a OT1-2A • pMig II construção, Dr. Juan Carlos Zuniga-Pflucker (Departamento de Imunologia da Universidade de Toronto) para apoiar a linha celular OP9-DL1, e Dr. Kent E Vrana (Departamento de Farmacologia, da Universidade Penn State College of Medicine) para ajudar o projeto deste estudo. Este projecto é financiado, em bolsas com o número de Grant K18CA151798 do Instituto Nacional do Câncer, o Trust Barsumian eo Melanoma Research Foundation (Song J.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6J mice Jackson Laboratory 000664
B6.129S7-Rag1tm1Mom/J Jackson Laboratory 002216
Anti-CD3 (2C11) antibody BD Biosciences 553058
Anti-CD28 (37.51) antibody BD Biosciences 553295
Anti-CD3 (17A2) antibody BioLegend 100202
Anti-CD4 (GK1.5) antibody BioLegend 100417
Anti-CD8 (53-6.7) antibody BioLegend 100714
Anti-CD25 (3C7) antibody BioLegend 101912
Anti-CD44 (1M7) antibody BioLegend 103012
Anti-CD117 (2B8) antibody BioLegend 105812
Anti-TCR-β (H57597) antibody BioLegend 109220
Anti-IL-2 (JES6-5H4) antibody BioLegend 503810
Anti-IFN-γ (XMG1.2) antibody BioLegend 505822
DMEM Invitrogen ABCD1234
α-MEM Invitrogen A10490-01
FBS Hyclone SH3007.01
Brefeldin A Sigma-Aldrich B7651
Polybrene Sigma-Aldrich 107689
GeneJammer Integrated Sciences 204130
RNA kit Qiagen 74104
DNA kit Qiagen 69504
CD8 Isolation Kit Miltenyi Biotec 130-095-236
ACK lysis buffer Lonza Inc. 10-548E
mFlt-3L PeproTech Inc 250-31L
mIL-7 PeproTech Inc 217-17
Gelatin Sigma-Aldrich G9391
FITC-anti-OVA antibody Rockland Immunochemicals 200-4233
Permeabilization buffer Biolegend 421002
BSA Sigma-Aldrich A7906
Formaldehyde Sigma-Aldrich F8775
0.4 μm filter EMD Millipore
Moflo Cell Sorter Dako
Calibur Flow Cytometer BD Biosciences
LSR II Flow Cytometer BD Biosciences
Mouse restrainer Braintree Scientific, Inc.

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References

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Lei, F., Haque, R., Xiong, X., Song, J. Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes. J. Vis. Exp. (63), e3986, doi:10.3791/3986 (2012).

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