Summary
Denne artikkelen beskriver først en prosedyre for å isolere humane endotelceller fra navle årer og deretter viser hvordan å bruke disse cellene til å undersøke nøytrofile sjelevandring henhold strømningsforhold. Ved å bruke en lav-volum flyt kammer laget av en polymer med de optiske egenskapene til glass, er live-celle fluorescerende avbildning av sjeldne celle populasjoner også mulig.
Abstract
Nøytrofile er de mest tallrike type hvite blodlegemer. De danner en viktig del av det medfødte immunsystemet en. Under akutt betennelse, nøytrofile er de første betennelsesceller å migrere til området av skaden. Rekruttering av nøytrofile til en skade området er en trinnvis prosess som inkluderer første, utvidelse av blodkar for å øke blodgjennomstrømningen, andre, mikrovaskulære strukturelle endringer og rømme av plasmaproteiner fra blodet, for det tredje, rullende, heft og sjelevandring av nøytrofile over endotel, og fjerde akkumulering av nøytrofile på stedet av skader 2,3. Et bredt spekter av in vivo og in vitro metoder har utviklet seg slik at studiet av disse prosessene 4. Denne metoden fokuserer på nøytrofile sjelevandring tvers humane endotelceller.
En populær metode for å undersøke de molekylære prosessene som er involvert i nøytrofile sjelevandring benytter menneskelige neutrophils samspill med primære humane umbilical vein endotelceller (HUVEC) 5. Nøytrofile isolasjon har blitt beskrevet visuelt sted 6, derfor denne artikkelen vil vise metode for isolering av HUVEC. Når isolert og vokst til samløpet, er endotelceller aktivert resulterer i oppregulering av adhesjon og aktivering molekyler. For eksempel, aktivering av endotelceller med cytokiner som TNF-alfa resulterer i økt E-selektin og IL-8 uttrykk 7. E-selektin medierer fangst og rulling av nøytrofile granulocytter og IL-8 medierer aktivisering og fast vedheft av nøytrofile. Etter vedheft nøytrofile transmigrate. Sjelevandring kan forekomme paracellularly (gjennom endotelcelle veikryss) eller transcellularly (via endotelceller selv). I de fleste tilfeller er disse interaksjonene oppstår under strømningsforhold funnet i blodkar 7,8.
Parallellen plate flyt kammer er et mye brukt system som mimikrofoner den hydrodynamiske skjærspenninger funnet in vivo og muliggjør studiet av nøytrofile rekruttering henhold gjennomstrømning in vitro 9,10. Flere selskaper produserer parallelle plate flyt kamre og hver har sine fordeler og ulemper. Hvis fluorescerende bildebehandling er nødvendig, må glass eller en optisk lignende polymer som skal brukes. Endotelceller ikke vokse bra på glass.
Her presenterer vi en enkel og rask metode for fase-kontrast, DIC og fluorescerende avbildning av nøytrofile sjelevandring med et lavt volum ibidi kanal lysbilde laget av en polymer som støtter den raske heft og vekst av humane endotelceller og har optiske kvaliteter som er sammenlignbare med glass. I denne metoden, ble endotelceller vokst og stimulert i en ibidi μslide. Nøytrofile ble introdusert under strømningsforhold og sjelevandring ble vurdert. Fluoriserende avbildning av avkjøringene aktivert sanntid fastsettelse av omfanget av paracellular versustranscellular sjelevandring.
Protocol
1. Isolering og vedlikehold av human vaskulær endotelceller
- Nivå 2 biologisk prosedyrer må brukes når du arbeider med humant blod og vev. Bruke saks klippe ledningen fra morkaken og deretter nøye undersøke ledningen for blodpropp og skader forårsaket av klemming ledningen ved levering. Klipp ut og kaste slike deler av ledningen.
- Forbered frisk collagenase løsning på 1 mg / ml ved å helle 50 ml varm ledningen buffer til et rør som inneholder 50 mg collagenase.
- Endre til sterile hansker og åpne en autoklaveres instrument skuff inneholder sterilisert sløve kanyler, ledningen klemmer, sakser, tre-veis stop-cocks og gasbind i en laminær hette.
- Identifiser de to arteriene og singelen blodåre stede i ledningen. Arteriene er mindre og har en tendens til å være tett constricted, mens venen er stort og lett å cannulate. Å spyle blodet fra venen, forsiktig sette inn en kanyle med en to-veis stoppekran knyttet til det jegnto ene enden av venen og sted en klemme rundt kanyle å holde den fast i posisjon. Perfuse ledningen buffer gjennom venen. Gjenta til flyt gjennom er klar og så klemme på slutten av ledningen.
- Perfuse collagenase inn i venen, lukke vannkranen, legg ledningen inn i et begerglass som inneholder varm ledning buffer og inkuberes i 10 minutter. Etter 10 minutter, fjern ledningen og forsiktig massasje ledningen å løsne endotelcellene fra lumen av venen. Tapp løsningen inn i røret som inneholder endotelcelle media (ECM). Skyll med ledning buffer to ganger for å fjerne gjenværende celler. Tapp løsningen i samme røret.
- Sentrifuger cellene ved 350 xg i 10 minutter til pellet endotelceller.
- Fjern supernatanten og tilsett 10 ml av ECM til pellets. Forsiktig resuspender cellene i ECM, og overfør cellene til en T75 kolbe forbelagte med 0,2% gelatin. Pre-belegg med gelatin har blitt gjort i minst 1 time ved 37 ° C. Dyrk cellene ved 37 ° C og 5% CO 2.
- Den neste dagen, rist forsiktig på flasken for å fjerne eventuelle røde blodlegemer fjern supernatanten og vask med varmt Hank balanserte saltløsning (HBSS). Fjern HBSS og mate cellene med 10 ml varm ECM. Undersøk cellene under mikroskop for å sikre at de røde blodcellene ble fjernet. Vurdere graden av samløpet og morfologi av endotelceller. Endotelceller på dette stadiet bør forlenget med ingen tegn til vakuoler.
- Fortsett å endre media hver tredje dag inntil celler når confluency og deretter delt celler ved hjelp av en 0,08% løsning av trypsin som inneholder 1mm EDTA. Plate endotelceller i ønskede retter forbelagte med 0,2% gelatin. Cellene skal komme samløpet i 3-6 dager.
- Når du bruker ibidi kamre, pre-coat hvert kammer med 0,2% gelatin. Fjern overflødig gelatin og fibronectin og deretter legge 1,5 X 10 6 / ml av endotelceller suspendert i ECM inn i kammeret. Endre media annenhver dag frem til confluent. Cellene skal være konfluent i 2-3 dager avhengig av ledningen.
2. Utarbeidelse av nøytrofile
- Nøytrofile ble isolert fra perifert blod hos friske frivillige med tetthet sentrifugering. En detaljert protokoll med en visuell demonstrasjon for nøytrofile isolering kan finnes i den tidligere utgaven av magasinet seks. Når isolerte Resuspender nøytrofile ved en konsentrasjon på 1x10 6 / ml i HBSS inneholder 0,5% humant albumin.
3. Sette opp Ibidi Chamber
- Grow endotelceller i en gelatin-belagt ibidi kammer. Undersøke dem hver dag ved hjelp fasekontrast mikroskopi inntil de blir tett konfluent.
- Stimulere endotelceller til å øke uttrykket av adhesjon og aktivering molekyler. Ved anvendelsen av denne protokollen, ble endotelceller stimulert med 10 ng / ml rekombinant TNF-α i fire timer ved 37 ° C og 5% CO
- Klargjør mikroskop, og sprøytepumpe som visuelt beskrevet av Wiese og kolleger 11 bruker en tom ibidi kammer.
- Viktige forskjeller mellom denne protokollen og Wiese prosedyre inkluderer pre-fylling slangen for å hindre eksponering av endotelceller til luft, opprettholde buffer ved 37 ° C ved hjelp av et vannbad, ved hjelp PharMed slangen å holde buffer fra å miste temperatur og ved hjelp av ulike mål på mikroskopet avhengig av om bildebehandling med fase kontrast eller fluorescens.
- Når mikroskop er satt opp og slangen er fylt med HBSS, lukker alle stoppekraner og fjern tomme ibidi kammeret.
- Koble ibidi kammeret inneholder TNF-α stimulerte endotelceller til slangen.
4. Nøytrofile Rekruttering og Sjelevandring
- Visualisere endotelcelle monolayer i microscope bruke en 10x fasekontrast mål.
- Sett sprøyten pumpen å trekke og begynne flyten av HBSS på ønsket skjærspenning (typisk mellom 0,5 til 2 dyn / cm 2).
- På innløpssiden, bytte fra HBSS til isolerte nøytrofile (1x10 6 / ml) ved å vri treveis stop-kuk.
- Begynn innspillingen i en CCD-kamera koblet enten til en DVD-opptaker eller koblet direkte til datamaskinen. Start tidtakeren når nøytrofiler inn i kammeret. Perfuse nøytrofile for fire minutter. Totalt 3 mL av nøytrofile suspensjon er tilstrekkelig for en enkelt eksperiment.
- Etter fire minutter, bytte tilbake til HBSS å hindre vedlegget av nye nøytrofile. Dersom data for totalt antall interaksjoner, rullende og fast vedheft er ønsket, Bilde 6 tilfeldige felt i 10 sekunder hver med en 10x fasekontrast objektiv mellom minutter 4 og 5.
- Bytt til en 40x objektiv og registrere en enkelt synsfelt mellom 5 og 10 minutter. På 10 minutter, samlemellom 5 og 10 tilfeldige synsfelt.
- Stopp flyten og flytte til neste kammer.
5. Fluoriserende Imaging Under strømningsforhold Bruke en Ibidi Chamber
- Etiketten enten endotelceller eller nøytrofile med en fluorescerende probe av interesse. For eksempel kan en anti-VE-cadherin antistoff konjugert til Alexa-[547] brukes til å visualisere endotelcelle veikryss.
- Monter ibidi kammer på et mikroskop med differensial interferens kontrast (DIC) og fluorescerende evner. Vi bruker en FluoView 1000 confocal (Olympus) med en miljømessig kammer. Fokus bruker en objektiv designet for DIC og fluoriserende arbeid.
- Tilegne samtidige DIC og fluoriserende bilder ved hjelp av programvare som leveres av leverandøren mens du følger den tiden kurset er beskrevet i kapittel 4.
6. Analyse av Neutrofil Rekruttering
- Analyse av rullende og samhandle celler er beskrevet av Wiese et al 11. For å måle andelen av nøytrofile rullende på endotelial monolayer telle antall nøytrofile som har flyttet mer enn en celle diameter i en periode på 5 sekunder. Dividere dette tallet med det totale antall leukocytter i feltet for å bestemme hvor stor prosentandel av rullende celler. Forlengelsen av dette, blir de gjenværende cellene regnes fast tilhenger.
- Mål rullende hastighet nøytrofile ved å beregne avstanden til nøytrofile reist i en bestemt tidsperiode, og deretter dele det på den tiden i sekunder.
- Sjelevandring bestemmes ved å telle antall nøytrofile som har endret form og vandret under monolayer 10. Disse nøytrofile identifiseres ved at de endrer seg fra å være fase lys når de er på toppen av monolayer å være fase mørkt når under monolayer 10. Antall celler transmigrated kan uttrykkes som en prosentandel av det totale cellene i synsfeltet, eller som en rå nummenER av transmigrated celler per arealenhet. I denne modellen systemet, vanligvis 50% av nøytrofile transmigrate etter 10 minutter.
7. Representative Resultater
Unstimulated endotelceller støtter ikke nøytrofile rekruttering. I motsetning, stimulerer endotelceller med TNF-alfa resulterer i nøytrofile rullende, fast heft og sjelevandring. Et eksempel på disse dataene er vist i figur 1 og 2. Figur 1a viser nøytrofile samspill med TNF-α-stimulerte endotelceller. Disse interaksjonene kan kvantifiseres, avslører det totale antallet nøytrofile samhandle med endotelceller samt antall nøytrofile bølgende, fast tilhenger eller transmigrated (figur 2). Nøytrofile sjelevandring kan oppstå ved celle veikryss eller gjennom endotelceller selv. Å skille mellom disse to forholdene, er endotelceller merket med en anti-VE-c adherin antistoff og sjelevandring er scoret som skjer paracellularly eller transcellularly (Figur 1B og C). I denne modellen er tilnærmet all sjelevandring paracellular 7.
Figur 1. Samtidig DIC og fluorescens bildebehandling i henhold strømningsforhold ved hjelp av en ibidi kammer. (A) DIC bilde ferskt isolerte humane nøytrofile migrere over menneskelige umbilical vein endotelceller. Den gule pilspissen viser en tilhenger nøytrofile, den hvite pilspissen viser en transmigrating nøytrofile. (B) endotelcelle veikryss ble farget med en anti-VE-cadherin antistoff konjugert til Alexa-[547] og avbildes. (C) Viser overlegg av kanal A og B avslører at nesten alle transmigrating i denne modellen er paracellular. Klikk her for å se større figur .
Figur 2. Endotelceller ble etterlatt unstimulated eller ble stimulert med 10 ng / ml av TNF-α. Etter 4 timer ble en parallell plate flyt kammer montert og nøytrofile ble perfused bort på en dyn / cm 2. (A) Nøytrofile interaksjoner ble undersøkt og målt ved hjelp ImageJ programvare fra NIH. De totale samhandlende cellene ble karakterisert som (b) rulle, fast tilhenger eller (C) transmigrating. Data representerer gjennomsnittet + SEM på mellom tre og fem eksperimenter. Forskjellen mellom kontroll og TNF i paneler A og C var signifikant (p <0,001).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forskere har rutinemessig brukt endotelceller fra ulike vaskulære senger å studere nøytrofile rekruttering og sjelevandring. Eksempler omfatter, men er ikke begrenset til, dermale mikrovaskulære endotelceller 12, lever sinusformet endotelceller 13 og endotelceller fra menneskelig umbilical vein 10. Blant dem HUVEC oppnådd stor popularitet på grunn av sin relativt enkelt av isolasjon og tilgjengelighet. HUVEC er en mektig in vitro modell system som etterligner mange endotelceller prosesser som skjer in vivo. Denne modellen systemet har hjulpet i identifisering av adhesjonsmolekyler og chemokines kritiske i rekrutteringen av mange leukocytter subklasser og aktiverte detaljert analyse av hvordan disse prosessene er regulert. In vitro arbeid med HUVEC har dannet grunnlaget for in vivo studier som til slutt har gitt en bedre forståelse og behandling for sykdom hos mennesker 14.
e_content "> I denne artikkelen presenterer vi en rask og enkel metode for å studere nøytrofile rekruttering in vitro ved hjelp av en ibidi flyt chamber. Denne typen kammer har flere fordeler fremfor andre parallelle plate kamre beskrevet tidligere i dette tidsskriftet 11. er Ibidi kamre består av en polymer med optiske egenskaper som ligner på glass som gjør det mulig for brukeren å ta fluorescerende og DIC bilder i tillegg til fase-kontrast. Det er kamre som bruker glass Dekkglass å aktivere fluoriserende bildebehandling, men voksende endotelceller på glass er en utfordring som vedheft eiendom av disse cellene endrer seg vesentlig på glassflater 15. endotelceller følge godt å plastoverflate men fluorescens bildebehandling på plast overflaten ikke er oppnåelig. Bruke ibidi μ glir ikke bare eliminerer disse problemene, men også de krever mye mindre prøvevolum enn de andre metodene . Disse glir også aktivere samtidige parallelle eksperimenter med bare liten modificasjon.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi takker Dr. Pina Colarusso og Live Cell Imaging Facility for deres assistanse med bildebehandling og bildeanalyse, Ms Lailey for henne teknisk assistanse, og enhet 51 ved foten Hospital i Calgary, AB for å gi menneskelige navle snorer. Dr. KD Patel er en Alberta innovates: Health Solutions Scientist. Dette arbeidet ble støttet av en driftsstøtte fra det kanadiske Institutes for Health Research og utstyr og infrastruktur tilskudd fra det kanadiske Foundation for innovasjon og Alberta vitenskap og forskning Authority.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase Type 1 | Worthington | 4197 | |
| Cord buffer | Composition: 140 mM NaCl 4 mM KCl 10 mM D-glucose in 1mM NaH2PO4/Na2HPO4 buffer at pH 7.4 | ||
| Endothelial Cell Media (ECM) | M199 with eagle salts supplemented with 16% human serum containing 100 units of penicillin 100 μg of streptomycin and 0.3 mg of L-glutamine/ml | ||
| M199 | GIBCO | 31100-035 | |
| Penicillin Streptomycin Glutamate (100X) | Invitrogen | 10378-016 | |
| Ibidi chambers | Ibidi | 80606 | |
| TNF-α | Prepro Tech | 300-01A | |
| Human Albumin 20% solution | Gemini Bioproducts | 800120050 | |
| HBSS without Ca2+ and Mg2+ | Sigma | H2487-10X | |
| HBSS with Ca2+ and Mg2+ | Sigma | H1387-10X |
References
- Nathan, C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 173-182 (2006).
- Diacovo, T. G. Neutrophil rolling, arrest, and transmigration across activated, surface-adherent platelets via sequential action of P-selectin and the beta 2-integrin CD11b/CD18. Blood. 88, 146-157 (1996).
- Ley, K. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Petri, B. Endothelial LSP1 is involved in endothelial dome formation, minimizing vascular permeability changes during neutrophil transmigration in vivo. Blood. 117, 942-952 (2011).
- Chavakis, T. The junctional adhesion molecule-C promotes neutrophil transendothelial migration in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 279, 55602-55608 (2004).
- Oh, H., Siano, B., Diamond, S.
- Liu, Y. Regulation of leukocyte transmigration: cell surface interactions and signaling events. J. Immunol. 172, 7-13 (2004).
- Alcaide, P. Neutrophil recruitment under shear flow: it's all about endothelial cell rings and gaps. Microcirculation. 16, 43-57 (2009).
- Jutila, M. A. Measurement of neutrophil adhesion under conditions mimicking blood flow. Neutrophil Methods and Protocols. 412, 239-256 (2007).
- Cuvelier, S. L., Patel, K. D. Studying leukocyte rolling and adhesion in vitro under flow conditions. Basic Cell Culture Protocols. 290, 331-342 (2005).
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium. J. Vis. Exp. (24), e1009 (2009).
- Petzelbauer, P. Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture. J. Immunol. 151, 5062-5072 (1993).
- Bonder, C. S., Kubes, P. Modulating leukocyte recruitment to splanchnic organs to reduce inflammation. Am J Phys - Gastrointestinal and Liver Phys. 284, G729-G733 (2003).
- Cuvelier, S. L. Eosinophil adhesion under flow conditions activates mechanosensitive signaling pathways in human endothelial cells. J. Exp. Med. 202, 865-876 (2005).
- Massia, S. P., Hubbell, J. A. Human endothelial cell interactions with surface-coupled adhesion peptides on a nonadhesive glass substrate and two polymeric biomaterials. J. Biomed. Mat. Res. 25, 223-242 (1991).
