Summary
ونحن نقدم بسيطة، وشبه كمي للتحقيق في طريقة تشكيل بيوفيلم
Abstract
الأغشية الحيوية، أو سطح المرفقة المجتمعات من خلايا مغلفة في المصفوفة خارج الخلية، وتمثل نمط حياة مشتركة لالعديد من أنواع البكتيريا. في غضون بيوفيلم، الخلايا البكتيرية في كثير من الأحيان معرض للتغيير علم وظائف الأعضاء، بما في ذلك تعزيز المقاومة للمضادات الحيوية وغيرها من الضغوط البيئية 1. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن الأغشية الحيوية تلعب دورا هاما في استضافة ميكروب التفاعلات. الأغشية الحيوية تتطور عندما البكتيريا الانتقال من الفردية، وخلايا العوالق لتشكيل معقدة، متعددة الخلايا المجتمعات 2. في المختبر، يتم دراسة الأغشية الحيوية من خلال تقييم تطور الظواهر بيوفيلم محددة. النمط الظاهري بيوفيلم مشترك ينطوي على تشكيل مستعمرات البكتيريا التجاعيد أو مغضن على أجار صلب وسائل الإعلام 3. التجاعيد تشكيل مستعمرة يوفر وسيلة بسيطة للغاية ومفيدة لتحديد وتوصيف سلالات بكتيرية واظهار الظواهر بيوفيلم تتغير، والتحقيق في الظروف البيئية التي تؤثر على تشكيل بيوفيلم. WRInkled تشكيل مستعمرة تخدم كمؤشر على تشكيل بيوفيلم في مجموعة متنوعة من البكتيريا، بما في ذلك البكتيريا إيجابية الجرام على حد سواء، مثل العصوية الرقيقة 4، والبكتيريا سالبة الجرام، مثل الكوليرا الضمة 5، الضمة نظيرة الحالة للدم 6، الزائفة الزنجارية 7، و الضمة fischeri 8.
هذه البكتيريا البحرية V. لقد أصبح fischeri نموذجا لتشكيل بيوفيلم نظرا للدور الحاسم من خلال الأغشية الحيوية الاستعمار المضيف: الأغشية الحيوية التي تنتجها V. fischeri تعزيز استعمارها من هاواي قصير الذيل 8-10 الحبار scolopes Euprymna. الأهم من ذلك، لاحظ الظواهر بيوفيلم في المختبر ترتبط قدرة V. خلايا fischeri لاستعمار على نحو فعال الحيوانات المضيف: سلالات ضعاف لتشكيل بيوفيلم في المختبر تملك عيب الاستعمار 9،11، في حين زادت الضغوط العارضةوتتعزز الظواهر بيوفيلم عن الاستعمار 8،12. V. fischeri بالتالي يوفر النظام نموذج بسيط لتقييم الآليات التي تنظم تشكيل بيوفيلم البكتيريا وكيف الأغشية الحيوية تأثير الاستعمار المضيف.
في هذا التقرير، وصفنا أسلوبا شبه كمي لتقييم تشكيل بيوفيلم باستخدام V. fischeri كنظام نموذج. هذا الأسلوب ينطوي على الحذر اكتشاف الثقافات البكتيرية بتركيزات محددة وحدات التخزين على وسائط أجار الصلبة؛ ثقافة المرقطة هو مرادف لمستعمرة بكتيرية واحدة. ويمكن استخدام هذه التقنية "ثقافة رصدت" للمقارنة بين الظواهر بيوفيلم الإجمالي في، واحد نقاط محددة من الوقت (نقطة النهاية المقايسات)، أو لتحديد وتوصيف الظواهر بيوفيلم خفية من خلال الوقت طبعا المقايسات للتنمية بيوفيلم وقياسات القطر مستعمرة ، ويتأثر التي كتبها تشكيل بيوفيلم. وبالتالي، هذا الأسلوب يوفر تحليل شبه كمي لتشكيل بيوفيلم، فيmitting تقييم للتوقيت والزخرفة للتنمية مستعمرة التجاعيد والحجم النسبي للبنية النامية، والخصائص التي تمتد إلى ما بعد التشكل مجمل بسيط.
Protocol
1. الأولي توصيف واعتبارات
- ويتأثر عموما تشكيل بيوفيلم من كثافة الخلايا ومعدل النمو. لذا، من الضروري تحديد معدل نمو (الزيادة في الكثافة الضوئية (OD) مع مرور الوقت) والعائد (نهائي عدد الخلية) من سلالة (ق) من الفائدة من خلال إجراء بسيط منحنى النمو والمقايسات طلي الخلية. عيوب في النمو، أو عدم وجود علاقة بين التطوير التنظيمي وعدد الخلايا، يجب أن تؤخذ في الاعتبار عند تفسير النتائج من تحديد موقع التجارب.
- وتشمل الضوابط المناسبة الإيجابية والسلبية على نفس الصفيحة عند تقييم التجاعيد تشكيل مستعمرة، وقاصر لوحة إلى لوحة اختلاف قد تؤثر على التنمية بيوفيلم.
- تحديد أفضل الظروف لاكتشاف، أي تلك التي تكشف عن فروق واضحة بين معظم مراقبة ومتحولة (ق) من الفائدة. زراعة سلالات في ثقافة السائل في ظل ظروف مختلفة، مثل وسائل الإعلام المختلفة أو درجات الحرارة، وإلى مرحلة مختلفةق من النمو (مرحلة الأسي أو ثابتة) قبل اكتشاف. بقعة 10 ميكرولتر من ثقافة بكثافات مختلفة على الخلية وسائل الإعلام المناسبة، واحتضان في درجة الحرارة المرغوبة حتى morphologies مستعمرة تصبح واضحة.
- لفحص نقطة النهاية ينطوي على تقدير من تشكيل مستعمرة التجاعيد في نقطة زمنية محددة مسبقا بعد ان شاهد (أي 48 ساعة). هذا التقييم مفيد لسلالات أن المعرض (أو المقترح يحمل) وجود عيوب خطيرة في تشكيل بيوفيلم.
- الفحص بالطبع وقت يقيم التجاعيد تشكيل مستعمرة على مدى فترة من الزمن (أي كل ساعة) بعد ان شاهد. هذا الاختبار يسمح بتقييم نصف الكمية من تشكيل بيوفيلم عن طريق السماح لتحديد بداية تشكيل مستعمرة التجاعيد وتطوير نمط خلال فترة من الزمن. وينبغي تحديد مدة التجربة وجمع عدد من النقاط لدورة زمنية معينة في التجارب الأولية.
- إلى بسهولة تتبع في ذلك الوقت بعد ان شاهد، وضعت فيIMER لحساب تصل.
2. المجهرية تقييم الصرف مستعمرة تجعد في V. fischeri
- تطعيم V. خلايا fischeri إلى 5 مل من الملح LB (LBS) متوسط 13 (1٪ [ث / V] تريبتون، 0.5٪ [ث / V] خلاصة الخميرة، 2٪ [ث / V] كلوريد الصوديوم، 50 مم تريس، حمض الهيدروكلوريك [ 7.5 درجة الحموضة]) التي تحتوي على أي المضادات الحيوية اللازمة واحتضان، مع اهتزاز، بين عشية وضحاها حتى 28 درجة مئوية. في الصباح، وثقافة فرعية الخلايا مع تخفيف 1:100 إلى 5 مل من المتوسط LBS الطازجة واحتضان في ظل نفس الظروف حتى الخلايا قد وصلت إلى التطوير التنظيمي المطلوب 600 (على سبيل المثال، OD 600 = 0.2 أو 0.5).
- ماصة 1 مل من ثقافة في أنبوب microfuge وأجهزة الطرد المركزي في مجموعة microfuge في أقصى سرعة لدقيقة واحدة. إزالة طاف بواسطة طموح. غسل الخلايا لإزالة وسائل الاعلام المتبقية والمكونات خارج الخلية بواسطة resuspending لبيليه في 1 مل من مياه البحر المعقمة اصطناعية 70٪ (ASW) (35 مم MgSO 4-7H 2 O، 7 ملم CaCl2-2H 2 O، 210 مم كلوريد الصوديوم، 7 ملم بوكل) وتكرار الطرد المركزي Resuspend وبيليه غسلها في 1 مل من ASW 70٪.
- تأكد من أن كل نموذج يحتوي على نفس العدد من الخلايا، حسب تقديرات التطوير التنظيمي في 600 نانومتر. إجراء أي تعديلات ضرورية تمييع عينات أكثر تركيزا مع إضافية مضادة للغواصات 70٪. في التجارب الأولية، والثقافات بقعة في مختلف القيم OD الأولية من أجل تحديد OD الأمثل انطلاق لمجموعة معينة من سلالات أو شروط. ويتم الحصول على أفضل النتائج لV. fischeri عندما يتم إنشاء نقاط من الثقافات مع OD ما يقرب من 0.2.
- اكتشاف 10 ميكرولتر من خلايا غسلها على لوحات LBS التي تحتوي على أي المضادات الحيوية اللازمة. عندما اكتشاف ثقافة على طبق من ذهب، للتأكد من ماصة للثابت (بإصبعك) فقط فوق سطح أجار. بقعة عموديا، وليس في زاوية، وإخراج السائل ببطء لتوزيع موحد للبقعة. وعادة ما يتم رصد كل سلالة مرة واحدة في لوحة (ما يصل الى 6 نقاط لكل لوحة)، وخفة دملوحات متعددة ح (2-3) في التجربة.
- للتأكد من أن الثقافة لا يزال رصدت موزعة بالتساوي، والسماح للبقعة لتجف قبل أن ينتقل إلى لوحة الحاضنة. عكس لوحات واحتضان لهم عند 28 درجة مئوية.
- مراقبة الصرف من بداية بقعة المتزايد في كل ساعة 12-15 ساعة بعد الحقن. نستخدم نطاق تشريح (زايس stemi 2000-C) مع مرفق كاميرا (بروخرس C10 PLUS) وCapturePro بروخرس وبرامج الحاسب الآلي يماغيج لمراقبة وتوثيق مورفولوجيا مستعمرة وتقييم البداية وتقدم من تشكيل مستعمرة التجاعيد.
- من أجل الإعداد المحددة المدرجة في الخطوة 2.5، تضاء بقع من تحت من خلال مرحلة الزجاج الشفاف مع مصدر ضوء CL EC 1500 الباردة، في حين يتم التقاط الصور من فوق. هذا الإعداد هو الأمثل لتطوير التصوير مستعمرة التجاعيد بسبب V. fischeri المستعمرات (بقع) هي شفافة.
- في حالة عدم وجود معدات خاصة مدرجة في الحاديEP 2.5، شاشة مورفولوجيا مستعمرة التجاعيد باستخدام أي مجهر تشريح الذي يسمح للعرض مستعمرة كاملة ويحتوي على مصدر الضوء وقابل للتعديل، من الناحية المثالية، وكاميرا مثبتة. إذا لزم الأمر، ويمكن أيضا كاميرا رقمية يمكن استخدامها في حال عدم وجود كاميرا مثبتة، ولكن هذا ليس الأمثل.
- لتصور أفضل التجاعيد تنمية مستعمرة، فمن الضروري ضبط كل من شدة الإضاءة، وزاوية الانعكاس تحت المستعمرات البكتيرية بحيث مورفولوجيا ثلاثي الأبعاد من الأغشية الحيوية النامية يمكن أن يستشف. تحديد الشروط المثلى التي توفر إضاءة أقوى التناقض بين مستعمرة رصدت والخلفية أجار المحيطة بها، مثل أن العمارة (التجاعيد) من مستعمرة تكون مميزة بوضوح.
- في بعض الحالات، لا بد أيضا من لون مستعمرة المرقطة أن تؤخذ في الاعتبار، وإحداث تغييرات في لون مستعمرة يمكن أن تحدث أثناء تشكيل بيوفيلم. ضبط شدة وزاوية مصدر الإضاءة لتكشف عنهذه التغييرات الطفيفة في تلوين. مرة واحدة يتم تحقيق الإعدادات المناسبة، والحفاظ عليها طوال مدة التجربة.
- لاحظ كم من الوقت ينقضي من وقت التلقيح إلى الوقت الذي يبدأ التجاعيد تشكيل مستعمرة لكل سلالة أو شرط. تحديد بداية تشكيل مستعمرة التجاعيد كنقطة الوقت الذي تشكيل الزخرفة وهياكل 3D (أي التصدعات في تشكيل الطرف الخارجي أو "التموجات" التي تحدث في الوسط) هو واضح الأولى. قد يحمل انخفضت خلايا متحولة أو زيادة الوقت لبدء تشكيل مستعمرة التجاعيد (على سبيل المثال، الشكل 2).
- توثيق بداية والتنمية لتشكيل مستعمرة التجاعيد من خلال التقاط الصور الرقمية المناسبة. من المهم أن استخدام التكبير نفسه عندما جمع الصور في كافة مراحل التجربة. تبديل وجهة النظر من العدسة من المجهر على شاشة الكمبيوتر باستخدام رافعة الموجود على الجزء الخلفي من الكاميرا. عند التبديل بين العدسةوالكمبيوتر الشخصي الشاشة، وضبط وجهة النظر والتركيز وفقا لذلك.
- قبل الثقافات المرقطة والتصوير، وعادة ما يتم إزالة غطاء لوحة بيتري لتقديم صورة أوضح. ومع ذلك، هذه خطوة اختيارية، كما ولا يمكن تصوير الثقافات رصدت من خلال الغطاء باستخدام الإعداد المذكورة في خطوات 2.5 و 2.6.
- في كل نقطة زمنية بعد بدء تشكيل مستعمرة التجاعيد، لاحظ نمط التنمية مستعمرة التجاعيد. يجوز للتطوير الهندسة المعمارية من الداخل الى الخارج، أو من الخارج. هذا التقييم يوفر آلية للتمييز بين الأغشية الحيوية التي شكلتها سلالات مختلفة أو في ظل ظروف مختلفة.
- قياس القطر من مستعمرة النامية في كل نقطة زمنية. ويمكن القيام بذلك يدويا، أو باستخدام برنامج رقميا البرامج المرتبطة بها. اذا به رقميا، استخدام البرنامج CapturePro بروخرس برنامج ومعايرة لأول مرة شريط مقياس للتضخم المحددة المستخدمة في التجربة. وتشمل شريط النطاق في كل الصورة التي تم التقاطها.
- لحساب قطر مستعمرة باستخدام برنامج حاسوبي يماغيج، فتح كل ملف الصورة. توحيد شريط النطاق على النحو التالي: حدد "الخيار خط مستقيم" من شريط الأدوات. تراكب شريط النطاق مع جزءا لا يتجزأ من خط مستقيم من نفس الطول والعرض. حدد "جدول تعيين" من علامة التبويب المسمى "تحليل". في "معروفة بعد" مربع، تضاف طول المقابلة (كما هو محدد من شريط النطاق الأصلي، أي 2 ملم) وحدد "موافق".
- استخدام "خط مستقيم" الخيار لإدراج خط أفقي في جميع أنحاء المكان. تحت علامة التبويب تحليل، حدد "القياس". في إطار نتائج جديدة، سوف تقدم على طول محسوب. الحصول على قياس 2 بإضافة خط عمودي في جميع أنحاء المكان. إعادة حساب قطر. يسجل متوسط القياسات اثنين. رسم بياني القطر المتوسط لكل بقعة في كل نقطة مرة باستخدام برنامج حاسوبي مثل Excel.
- في نهاية التجربة يحدث إما عند نقطة زمنية محددة أو عندما لا يكون هناك مزيد منتطوير بيوفيلم. مرة واحدة يتم الوصول إلى نهاية، وتوطيد هذه الصور الى الرقم (ق) لتصور تطوير نمط بمرور الوقت باستخدام أحد البرامج مثل باور بوينت.
3. ممثل النتائج
في هذه التجارب كنا V. fischeri كما كائن نموذج لدراسة تشكيل بيوفيلم من خلال تقييم وضع المستعمرات التجاعيد على سطح صلب أجار. بيوفيلم المنتجة للسلالات V. شكل مستعمرات fischeri مع الهندسة المعمارية 3D واسعة النطاق في غضون 40 ساعة (الشكل 1) 8،9،14. عندما فحص أكثر من دورة الزمن، يصبح من الواضح أن التجاعيد تشكيل مستعمرة من قبل سلالة تحكم يبدأ في وقت مبكر حوالي 12 ساعة بعد التطعيم (وفقا لشروط محددة) (الشكل 2) 9. في المقابل، يتم تأخير تشكيل بيوفيلم بواسطة متحولة ممثل من قبل ما يقرب من 4 ساعات، وليس الشروع حتى ما يقرب من 16 ساعة بعد التطعيم 9. Repeaواقترح TS من هذه التجارب أن توقيت يتفق نسبيا، مما يجعل هذا التقييم نصف الكمية 9. ثانيا شبه كمي قدر من تشكيل بيوفيلم يستفيد من التغيير في القطر من مستعمرة النامية مع مرور الوقت. كما هو مبين في الشكل. 3A، وممثل بيوفيلم-المختصة سلالة المستعمرات تشكل هذه الزيادة في تعقيد وقطر نسبة إلى سلالة ممثل أن لا تشكل الأغشية الحيوية. كشفت قياسات دقيق مع مرور الوقت من أقطار من المستعمرات التي تشكلها هذه سلالتين أن حجم المستعمرات بيوفيلم-المختصة زادت بمعدل أكبر من المستعمرات بيوفيلم سلبية، وعند نهاية الوقت نقطة وهما اختلف بنسبة 2 تقريبا - أمثال (الشكل 3B). وهكذا، على الرغم من الصور من مرة في وقت متأخر ممثل أو "نقطة النهاية" مورفولوجيا مستعمرة كثيرا ما ترد في الأدبيات، ويمكن جمعها إضافية، وشبه البيانات الكمية التي من شأنها أن تسمح لفهم أفضل للخلل بيوفيلم.
الشكل 1. نقطة النهاية مقايسة. هذا الرقم هو مثال على فحص نقطة النهاية باستخدام ممثل غير بيوفيلم المكونة (يسار) وتشكيل بيوفيلم-(يمين) سلالات V. fischeri. وقد تم جمع هذه الصور في 40 ساعة بعد ان شاهد. وقد ولدت هذه الصور مع من النوع البري V. fischeri تحتوي على مكافحة ناقلات الأمراض (غير لتشكيل بيوفيلم) أو جزءا overexpressing rscS البلازميد (بيوفيلم المكونة)، وكان من مجموعة البيانات التي تم جمعها لموريس وآخرون، 2011.
الشكل 2. الوقت لفحص بالطبع. لوحة تحتوي على صور أعلى ممثل تشكيل بيوفيلم عن سلالة تحكم بيوفيلم-المختصة V. fischeri خلال دورة الوقت المحدد. الشروع في تشكيل بيوفيلم هو واضح في 12 ساعة. اللوحة السفلى يحتوي أنا ممثلالسحراء من سلالة طافرة من ف. fischeri التي يسلك تأخير (4 ح) في بداية تشكيل مستعمرة التجاعيد بمرور الوقت، مع الشروع في تشكيل بيوفيلم في 16 ساعة بعد التطعيم. لاحظ أن في 40 ساعة سلالات مشابهة في كثافة والزخرفة من تشكيل بيوفيلم، في حين لوحظ فقط الفروق الدقيقة بين هذه السلالات في نقاط وقت سابق. وقد ولدت هذه الصور مع overexpressing rscS البرية من نوع ومتحولة sypE V. تعيين الخلايا fischeri وكانت جزءا من البيانات المجمعة لموريس وآخرون، 2011.
قطر الرقم مستعمرة 3. وتحليل شبه كمي لتشكيل بيوفيلم. (A) دوام من تشكيل بيوفيلم من قبل ممثل سلالات (اللوحة السفلى) لتشكيل بيوفيلم (اللوحة العليا) وعدم تشكيل بيوفيلم، من خامسا fischeri. علما بأن سلالة بيوفيلم المكونة يسلك زيادة أكبرفي قطر على مر الزمن بالنسبة للسلالة غير بيوفيلم تشكيل. وقد ولدت هذه الصور مع من النوع البري V. ضبط fischeri التي تحتوي على جزء overexpressing rscS البلازميد (بيوفيلم المكونة لل) أو لمكافحة ناقلات الأمراض (غير لتشكيل بيوفيلم) وكانت من البيانات المجمعة لموريس وآخرون، 2011. (ب) تمثيل رسومي من الزيادة في القطر مستعمرة أكثر من مرة من قبل سلالتين في ألف لوحة ولدت هذه البيانات باستخدام برنامج يماغيج وإكسل على النحو المبين في البروتوكول.
Discussion
في هذا العمل، ونحن وصفا لطريقة شبه كمي لتقييم تشكيل بيوفيلم باستخدام V. fischeri بوصفه الكائن نموذج. على وجه التحديد، ونحن الاستفادة من مجهر تشريح مع المرفقات كاميرا لمراقبة تشكيل بيوفيلم والتنمية وتشكيل مستعمرة التجاعيد مع مرور الوقت على سطح صلب أجار. في هذا البروتوكول، ونحن الخطوط العريضة 2 أنواع محددة من الطرق التي نستخدمها عادة لتقييم التجاعيد تشكيل مستعمرة. الأول هو فحص نقطة النهاية، والذي يتيح لنا مراقبة، شامل نهائي الهندسة المعمارية 3D، والزخرفة، وقطر لثقافة رصدت في "النهائي" المحدد نقطة مرة. هذا النهج هو أكثر فائدة لتقييم سلالات متحولة أو الظروف التي تؤدي إلى تشوهات كبيرة في تشكيل بيوفيلم. ومع ذلك، فإن هذا النهج لا يميز بين الاختلافات أكثر دهاء وقعت في نقطة زمنية قبل نقطة النهاية المحددة. على نحو أوثق مراقبة التجاعيد تشكيل مستعمرة، نستخدم فحص مسار الزمن، والتي تتيح لنا التعرف بداية ثrinkled تشكيل مستعمرة ومراقبة تطورها على مر الزمن. نتيجة لهذا النهج، يمكن تحديد الاختلافات أكثر دهاء في توقيت تشكيل مستعمرة التجاعيد، والهندسة المعمارية 3D، والزخرفة. استخدمنا هذا الفحص بالطبع وقت لتوليد المؤسستين شبه كمي المقايسات من تشكيل بيوفيلم. أولا، يمكن مقارنة الوقت الذي سلالة يبدأ في تطوير الهندسة المعمارية 3D إلى أن سلالات السيطرة. لقد وجدنا أن التأخير في تشكيل بيوفيلم من متحولة خاصة في ظل نفس الظروف ويتسق إلى حد ما 9. على سبيل المثال، في البيانات التي تظهر في الشكل. 2، ومتحولة برهنوا دائما عن تأخير ح 4 في الشروع في تشكيل بيوفيلم. ثانيا شبه كمي قدر من تشكيل بيوفيلم هو التغير في حجم القطر من مستعمرة التجاعيد (سبوت). لقد وجدنا أن قطر المستعمرات التجاعيد تختلف تدريجيا من أن من غير بيوفيلم المستعمرات، ليبلغ نحو فرقا 2-أضعاف في نهاية الوقت نقطة (الشكل 3 V. الكوليرا أن بعض التجاعيد في المستعمرات نتيجة زيادة كبيرة في القطر مستعمرة في حين أن البعض الآخر لا 15. ومع ذلك، يمكن تقييم التغيير في قطر مع مرور الوقت مساعدة في توصيف المسوخ بيوفيلم المحتملة و / أو توفير تدبير إضافي الكمية من المسوخ مع التأخير في عملية التنمية. من التدابير اثنين من تشكيل بيوفيلم (الوقت وقطر)، وتحديد بداية تشكيل مستعمرة التجاعيد أكثر حساسية، ولكن أيضا أكثر ذاتية، من تحديد القطر من بقعة. وحتى مع ذلك، على حد سواء التدابير تقديم تقييم نصف الكمية من النمط الظاهري يمكن أن يكون مفيدا للغاية للباحثين بيوفيلم لكن غير قابلة بسهولة إلى quantificatioن.
عند إجراء فحوصات مثقف رصدت، من المهم للنظر في الظروف البيئية التي يتم استزراع سلالات رصدت. ويتأثر في كثير من الأحيان التجاعيد تشكيل مستعمرة من قبل الظروف البيئية المختلفة، بما في ذلك توفر المواد الغذائية، ودرجة الحرارة والرطوبة. للحد من التباين بين التجارب، فإنه من المفيد لتوحيد هذه الظروف قدر المستطاع (أي توحيد لوحات أجار إلى وحدة تخزين مجموعة وزراعة سلالات رصدت في درجة الحرارة التي تسيطر عليها). لمزيد من السيطرة على التباين بين التجارب اكتشاف، من المهم أن تشمل سلالات المراقبة المناسبة داخل كل مجموعة من التجارب. أخيرا، عند تفسير البيانات من هذه المقايسات، فمن الضروري إجراء أية تجربة 1 عدة مرات (3 +)، وخصوصا عندما تقييم الفروق الدقيقة في تشكيل مستعمرة التجاعيد (على سبيل المثال، في تأخير تشكيل بيوفيلم أو الاختلافات الزخرفة). بعض القيود المفروضة على هذا البروتوكول هي: 1) determinقد جي ما إذا كانت الخلايا لديها خلل في النمو يكون من الصعب: نمو الخلايا في ثقافة السائل قد لا تعكس بدقة معدلات النمو في وسائل الاعلام الصلبة، وتحديد دقيق لنمو الخلايا المكونة للبيوفيلم، والتي قد تلتصق ببعضها البعض، قد لا يكون ممكنا؛ 2) سوف سلالات مع عيوب نمو أن يكون مشكلة لتحليل، 3) أنه قد لا يكون من الممكن التمييز بين الاختلافات بين سلالات قطر مع الظواهر بيوفيلم خفية، 4) عن السلالات التي لا تنمو في حلقة مركزية من أنه قد لا يكون من الممكن قياس بدقة تغييرات في قطر، 5) في حين يمكن ملاحظة الزخرفة خلال تشكيل بيوفيلم، لا توجد وسيلة لقياس الزخرفة للبيوفيلم الناتجة عن ذلك؛ و 6) لا توجد وسيلة لقياس Z-البعد عن بيوفيلم مع هذه التجربة انشاء . على الرغم من هذه القيود، يتيح هذا البروتوكول مع ذلك وسيلة للحصول على البيانات الرقمية للمساعدة في تقييم التجاعيد تشكيل مستعمرة.
في هذا البروتوكول، ونحن الاستفادة من التصوير محددنظام (أي مجهر زايس تشريح وبروخرس CapturePro برامج التصوير) لمراقبة وتقييم التجاعيد تشكيل مستعمرة. نظام التصوير وصفها هنا هي قوية: القدرة على الكشف عن بدء تشكيل مستعمرة التجاعيد، وبالتالي تقييم تطور مع الوقت نهج بطبيعة الحال، تتعزز بشكل كبير من خلال استخدام مجهر تشريح. ومع ذلك، إذا كانت هذه التكنولوجيا غير متوفرة، ويمكن تكييفها لبروتوكول للاستخدام مع غيرها من المعدات، بما في ذلك كاميرا رقمية بسيطة، مع التركيز التكبير. في حين أن هذا البروتوكول يركز على تقييم تنمية مستعمرة التجاعيد، يمكن أيضا أن يكون تعديل لتقييم تكوين غشاء رقيق، وهو شكل من بيوفيلم أن يتطور عندما الخلايا تنمو بشكل ثابت في ثقافة السائل. قد يكون هذا البروتوكول يثبت أيضا مفيدة في تقييم المؤشرات الأخرى من تشكيل بيوفيلم، بما في ذلك إدراج الأصباغ محددة في المستعمرات رصدت خلال تطوير بيوفيلم. وتشمل هذه، ولكنها لا تقتصر على والأصباغ مثل الأحمر والكونغو calcofluأو التي يمكن أن تربط إلى السليلوز، وهو عنصر مشترك من الأغشية الحيوية البكتيرية 16. بالإضافة إلى ذلك، هذا البروتوكول، على الرغم من أن وضعت للاستخدام مع خامسا على سبيل المثال لا fischeri، لهذا الكائن الحي ولكن يمكن تعميمها على دراسة تشكيل بيوفيلم في الكائنات عديدة مختلفة، مثل العصوية الرقيقة 4، الضمة الكوليرية 5، الضمة نظيرة الحالة للدم 6، والزائفة الزنجارية 7، والتي تشكل كل معرض مستعمرة التجاعيد. وأخيرا، فإنه يمكن أيضا أن تتكيف مع دراسة morphologies مستعمرة الأخرى التي لها نمط النمو، مثل، ربما، والزخرفة التي تحدث أثناء نمو زانثس Myxococcus 17 و جوي تطوير هيكل في الزائفة الزنجارية 18. هذا البروتوكول هو بالتالي من استخدام العام للباحثين علم الأحياء المجهرية وبيوفيلم.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل NHI R01 منحة GM59690 منحت لKLV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zeiss stemi 2000-C Dissecting Microscope | Carl Zeiss, Inc. | 45505300000000000 | (obtained through Lukas Microscope) |
| ProgRes C10PLUS | JENOPTIK Optical Systems GmbH | 017953-602-26 | Camera attachment (obtained through Lukas Microscope) |
| CL 1500 EC Cold Light Source | Carl Zeiss, Inc. | 4355400000000000 | (obtained through Lukas Microscope) |
| ProgRes CapturePro | JENOPTIK Optical Systems GmbH | Free software with registered camera | Computer program for image capture |
| Image J | National Institutes of Health | Free software from: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html | Computer program for diameter measurements |
References
- Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin. Microbiol. Rev. 15, 167-167 (2002).
- Stoodley, P., Sauer, K., Davies, D. G., Costerton, J. W. Biofilms as complex differentiated communities. Annu. Rev. Microbiol. 56, 187 (2002).
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R.
- Branda, S. S. Fruiting body formation by Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11621 (2001).
- Beyhan, S. Regulation of rugosity and biofilm formation in Vibrio cholerae: comparison of VpsT and VpsR regulons and epistasis analysis of vpsT, vpsR, and hapR. J. Bacteriol. 189, 388 (2007).
- Enos-Berlage, J. L., Guvener, Z. T., Keenan, C. E., McCarter, L. L. Genetic determinants of biofilm development of opaque and translucent Vibrio parahaemolyticus. Mol. Microbiol. 55, 1160 (2005).
- Merritt, J. H., Brothers, K. M., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. SadC reciprocally influences biofilm formation and swarming motility via modulation of exopolysaccharide production and flagellar function. J. Bacteriol. 189, 8154-8154 (2007).
- Yip, E. S., Geszvain, K., DeLoney-Marino, C. R., Visick, K. L. The symbiosis regulator rscS controls the syp gene locus, biofilm formation and symbiotic aggregation by Vibrio fischeri. Mol. Microbiol. 62, 1586-1586 (2006).
- Morris, A. R., Darnell, C. L., Visick, K. L. Inactivation of a novel response regulator is necessary for biofilm formation and host colonization by Vibrio fischeri. Mol. Microbiol. 82, 114 (2011).
- Nyholm, S. V. Roles of Vibrio fischeri and nonsymbiotic bacteria in the dynamics of mucus secretion during symbiont colonization of the Euprymna scolopes light organ. Appl. Environ. Microbiol. 68, 5113 (2002).
- Yip, E. S., Grublesky, B. T., Hussa, E. A., Visick, K. L. A novel, conserved cluster of genes promotes symbiotic colonization and σ54-dependent biofilm formation by Vibrio fischeri. Mol. Microbiol. 57, 1485 (2005).
- Mandel, M. J. A single regulatory gene is sufficient to alter bacterial host range. Nature. 458, 215 (2009).
- Graf, J., Dunlap, P. V., Ruby, E. G. Effect of transposon-induced motility mutations on colonization of the host light organ by Vibrio fischeri. J. Bacteriol. 176, 6986 (1994).
- Geszvain, K., Visick, K. L. The hybrid sensor kinase RscS integrates positive and negative signals to modulate biofilm formation in Vibrio fischeri. J. Bacteriol. 190, 4437 (2008).
- Krasteva, P. V. Vibrio cholerae VpsT regulates matrix production and motility by directly sensing cyclic di-GMP. Science. 327, 866 (2010).
- Romling, U. Characterization of the rdar morphotype, a multicellular behaviour in Enterobacteriaceae. Cell Mol. Life. Sci. 62, 1234 (2005).
- Berleman, J. E., Chumley, T., Cheung, P., Kirby, J. R. Rippling is a predatory behavior in Myxococcus xanthus. J. Bacteriol. 188, 5888 (2006).
- Lee, K., Veeranagouda, Y. Ultramicrocells form by reductive division in macroscopic Pseudomonas aerial structures. Environ. Microbiol. 11, 1117 (2009).
