Summary
Questo video mostra una procedura di dissezione per l'elaborazione di pancreas umano in diversi formati di memorizzazione. Orientamento anatomico viene mantenuta in tutte le regioni del pancreas per consentire la definizione della composizione delle isole regionale e la densità.
Abstract
La dissezione e procedura di campionamento è stato sviluppato per la Rete per i donatori di organi del pancreas con diabete (nPOD) programma di standardizzare la preparazione del pancreas recuperati da donatori di organi da cadavere. Il pancreas è diviso in 3 regioni principali (testa, corpo, coda) seguiti da sezioni trasversali seriali in tutto il mediale all'asse laterale. Sezioni alternate sono utilizzati per paraffina fisso e blocchi congelati freschi e campioni rimanenti vengono macinate per moschettoni preparati campioni congelati, con o senza RNasi inibitori, per DNA, RNA, o isolamento delle proteine. L'obiettivo generale della procedura di dissezione pancreas è quello di campionare l'intero pancreas, pur mantenendo l'orientamento anatomico.
Eterogeneità delle cellule endocrine in termini di composizione delle isole, le dimensioni e il numero è riportato per isole umane rispetto alle isole roditori 1. La maggior parte delle isole pancreatiche dalla testa pancreas, regioni di body e di coda sono costituiti da insulino-containing cellule beta seguita da minori proporzioni di glucagone contenenti a-cellule e somatostatina-contenenti delta-cellule. Polipeptide pancreatico contenenti cellule PP e grelina contenenti cellule epsilon sono presenti, ma in piccole quantità. Al contrario, la regione uncinato contiene isolotti che sono principalmente composti di polipeptide pancreatico cellule contenenti PP 2. Queste variazioni isole regionali derivano dalle differenze di sviluppo. Il pancreas sviluppa dai germogli pancreatiche ventrale e dorsale del foregut e dopo la rotazione dello stomaco e del duodeno, si muove lobo ventrale e si fondono con la dorsale 3. Il lobo ventrale costituisce la parte posteriore della testa compreso il processo uncinato mentre il lobo dorsale dà luogo al resto dell'organo. Variazione del pancreas regionale è riportato anche con la regione della coda avente una densità isolotto superiore rispetto ad altre regioni e le dorsali del lobo componenti derivati dalla fase di atrofia selettiva nel diabete tipo 1 Altri organi e tessuti sono spesso recuperato dai donatori di organi e includono i linfonodi, della milza e pancreas non-pancreatiche linfonodi. Questi campioni sono recuperati con formati analoghi a quelli per il pancreas con l'aggiunta di isolamento di cellule crioconservate. Quando il duodeno prossimale è incluso con il pancreas, mucosa duodenale possono essere raccolti per i blocchi di paraffina e congelati e preparati a scatto tritati surgelati.
Protocol
1. Set-up
- Cassette etichette per i blocchi di paraffina manualmente con una matita, o automaticamente con una stampante cassette. Includere l'identificatore donatore (CaseID), tipo di campione, il numero di aliquote, e qualsiasi ulteriore identificazione univoco (foglio di lavoro Case, appendice 1 ).
- Label stampi PTOM come per cassette con un pennarello indelebile. Ritagliare rettangoli di cm 5-10 di fogli di alluminio.
- Stampa o manualmente un'etichetta con pennarello indelebile tutti i flaconi e tubi. Includere fiale sufficienti per i campioni congelati a scatto tritati e tubi con i media RPMI per spedizioni freschi. Per le fiale a scatto congelati con RNAlater, aggiungere 1 mL RNAlater ad ogni esageratamente.
- Set-up schede dissezione in materia di biosicurezza cappa e piani di lavoro con strumenti di dissezione sterilizzati (pinze, bisturi, lame, compresse di garza (4x4)) così come cassette e muffe PTOM disposti in ordine di utilizzo.
- Preparare un bagno di congelamento mettendoghiaccio secco in un mezzo scatola dimensioni polistirolo (10x10 cm) ad una profondità di almeno 3 cm e aggiungere isopentano finché il ghiaccio secco è completamente coperto.
- Opzionale: Riempire un piccolo contenitore Dewar con azoto liquido.
- Se il pancreas è necessario per la microscopia elettronica (EM), preparazione fissativo TAAB con l'aggiunta di 1,25 mL di paraformaldeide 16%, 1,25 mL glutaraldeide 8%, e 7,5 mL 0,1 M PBS. Preparare fissativo Lowicryl con l'aggiunta di 2,5 mL di paraformaldeide 16% a 7,5 mL 0,1 M PBS.
- Preparare soluzioni impiegate per isolare cellule. Per flacone da 500 ml del DMEF (con glutammina), seguite tecniche asettiche, mentre aggiungendo quanto segue:
- Siero fetale bovino (FBS): aggiungere 50 ml, 10% finale.
- Penicillina / Streptomicina (Pen / Strep, 10.000 U / mL / 10.000 ug / mL stock) - aggiungere 5 ml Pen / Strep stock RPMI per la concentrazione finale di 100 U / mL / 100ug/mL. Anche aggiungere 5 ml in un flacone da 500 ml di DPBS quando viene utilizzato per lo svolgimento di linfonodi o campioni milza.
2. Personale
3. Pancreas Dissection
- Rimuovere il duodeno e la milza e pulire il pancreas di grassi estranei, vasi e nervi con dissezione smussa e taglienti
- Posizionare il pancreas pulito su una tavola di dissezione coperta con carta da cucina. Immergere un bastoncino di cotone con punta applicatore in inchiostro blu e la diffusione sulla superficie anteriore del pancreas. Asciugare l'eccesso.
- Optional: Immergere un nuovo applicatore in inchiostro nero e la diffusione sulla superficie posteriore del pancreas. Torna pancreas all'orientamento normale con superficie anteriore rivolta verso prosector.
- Tagliare il pancreas in 3 regioni: testa, corpo e coda (Figura 1). Tagliare la giunzione tra HEAd corpo e poi dividere la parte restante in ~ parti uguali per il corpo e coda.
- Pesare ogni regione di pesi pancreas e registrare (Causa foglio workup ( appendice 1 )).
- Sezione (circa 0,5 cm) ogni regione del pancreas in una trasversale "pagnotta" modo (Figura 1).
- Utilizzare le sezioni di entrambe le giunzioni tra le regioni per i campioni tritate. A seconda delle dimensioni pancreas, un campione dal corpo-coda regione di giunzione può essere difficile da ottenere in tal caso il numero di blocchi di paraffina può essere diminuita per ottenere campioni macinati o campioni solo la regione pancreas testa corpo può essere ottenuta. Cryovials un'etichetta in base a testa o il corpo per indicare regione prossimale a livello della giunzione.
- Tritate pezzi e si dividono equamente tra cryovials (≥ 1 grammo per flacone). Rapidamente congelare fiale senza RNAlater in azoto liquido o ghiaccio secco - slurry isopentano poi il trasferimento toa -80 ° C freezer.
- Tenere flaconcini con RNAlater a temperatura ambiente per 30 minuti per consentire equilibrio, remix e rapidamente congelare in azoto liquido o in ghiaccio secco-isopentano impasto poi trasferire in un congelatore a -80 ° C.
- Rimuovere le sezioni alterne e blocchi di paraffina OCT che iniziano con paraffina (Figura 1).
- Appoggiare tutte le sezioni trasversali a destra.
- Luogo ~ 1,5 x 1,5 x 0,5 cm sezioni nelle cassette. Se le sezioni trasversali sono troppo grandi, tagliata a metà (Figura 2b). Cassette di etichette per il blu metà anteriore come "A" e la metà posteriore, "B".
- Se i pezzi sono ancora troppo grandi, tagliare ciascuna sezione perpendicolare al precedente taglio (figura 2c). Cassette Label AD in senso orario. Tagliare pezzi ulteriormente necessarie per adattarsi all'interno di cassette.
- Serie di numeri in sequenza all'interno della regione, a partire dalla parte più mediale.
- Per i blocchi di paraffina, la posizione cassettes così l'etichetta è a sinistra e posto tessuto nel cassetto, mantenendo il suo orientamento. Chiudere il coperchio cassetta e trasferimento in un contenitore con 500 ml ~ 10% formalina tamponata neutra (NBF). Avviare la fissazione tempi quando la cassetta ultimo posto in fissativo.
- Per i blocchi PTOM, versare uno strato sottile di ottobre i media nello stampo prelabeled poi stendere il tessuto nello stampo facendo attenzione a mantenere l'orientamento e coprire con il tessuto ottobre Rapidamente immergere gli stampi in un PTOM ghiaccio secco - slurry isopentano per ~ 1 minuto. Togliere dal liquame e il luogo in ghiaccio secco per lo stoccaggio temporaneo o in freezer -80 ° C per una conservazione a lungo termine.
- Ottenere ~ 0.5 x 0.5 cm fette dalla testa-corpo di giunzione per la microscopia elettronica (EM). Mettere una fetta nel fissativo TAAB e l'altra fetta del fissativo Lowicryl. Conservare entrambi i tipi di fissativo con i campioni a 4 ° C per almeno 48 ore e / o a tempo indeterminato fino al procedimento successivo per EM.
4. Milza, dissezione linfonodalezioni e dissezioni Mucosa duodenale
- Isolare linfonodi pancreatici (PLN) da grassi e tagliare tutto il tessuto connettivo alla capsula nodo. Mettere in un piatto sterile coltura cellulare contenente DMEF. A seconda del numero totale isolati, dividere PLN in aliquote per le spedizioni fresche, isolamenti cellulari crioconservati, paraffina e / o blocchi PTOM, e fiale. Tritare i nodi di grandi dimensioni in pezzi non più grandi di 0,5 cm.
- Tritare non-pancreatiche linfonodi e nella milza in piccoli (circa 0,5 cm) cubi. Luogo in fissativo, ottobre media, e per le spedizioni o DMEM campioni freschi o crioconservati isolamenti cellulari in base alle quantità di materie prime.
- Aprire il duodeno e pulire delicatamente la superficie della mucosa pulita di muco con un tampone di garza inumidito. Tagliare sezioni della mucosa di paraffina e / o blocchi congelati PTOM e campioni macinate per flaconi, con e senza RNAlater. Congelare come per altri campioni.
5. Wrap blocchi PTOM in pre-etichettati foglio di alluminio e di collocare i blocchi PTOM e fiale in scatole per la conservazione a lungo termine a -80 ° C.
6. Inviare i campioni fissati per l'elaborazione di paraffina
- Fissare i tessuti per 16 ore (range 20 ± 4 ore) con un elaboratore automatico di paraffina o con cronometraggio manuale. Processo per i blocchi di paraffina usando un elaboratore automatico ( Appendice 2 ).
- Incorporare sezioni nell'orientamento esatto immesso dal prosector con l'etichetta cassetta a sinistra. Incorporare la mucosa duodenale con la superficie di taglio verso il basso per consentire l'esame della mucosa perpendicolare alla sottomucosa.
7. Pulire e disinfettare le zone di dissezione. Lavare gli strumenti di dissezione e ri-sterilizzare. Posizionare i tessuti rimanenti umani in fissativo formalina per lo stoccaggio di rifiuti biomedico. Smaltire i rifiuti biomedica conformità alla normativa vigente entro un mese.
8. Aggiornare il sistema di inventario del campione
ve_title "> 9. rappresentativi RisultatiQuesta procedura consente di elaborare un pancreas umano con intatta campione rappresentativo per tutta l'organo tra cui delimitazione delle tre regioni principali, vale a dire, testa, corpo e coda entro 2 ore. La regione uncinato, che si trova nella regione posteriore della testa, è inclusa nella dissezione testa. Il peso medio del pancreas in donatori di organi senza diabete era 82.4 grammi (52,7 - 139,0 grammi). Pesi pancreas regionali sono approssimativamente uguali (figura 3).
Questa procedura può anche permettere per la ricostruzione del pancreas intero utilizzando vetrini colorati da paraffina sequenziale e blocchi PTOM. Più formati sono possibili consentendo il massimo utilizzo per le tecnologie attuali e future. Il foglio di lavoro corrente nPOD caso è previsto ( appendice 1 ) che viene utilizzato per documentare i campioni recuperati e proc successivaessing aliquote per tipo e quantità.
Figura 1. Schema generale della procedura. L'intero pancreas viene elaborato, pur mantenendo orientamenti anatomiche. La regione testa è più lunga nella direzione superiore-inferiore a causa della presenza del lobo ventrale pancreatico nella regione posteriore che comprende la regione uncinato. Zona tratteggiata in corrispondenza dei nodi indicano regioni utilizzate per i campioni in cryovials tritate. P, paraffina, O, ottobre
Figura 2. Schema di Lettering per le sezioni del pancreas. Fette trasversali pancreas può essere ulteriormente divisa in due metà o quarti e lettere in senso orario.
Figura 3. Pesi pancreas di donatori di organi senza diabete. Ipancreas intatta da donatori adulti (> 17 anni) è stato pesato poi diviso in regioni e pesi regionali ottenuti. I dati sono medie ± SEM (n = 15).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L'obiettivo di questa procedura è quello di definire uno standard di trattamento del pancreas che può essere armonizzato in tutta siti di raccolta multiple e consentire in tal modo il confronto dei risultati ottenuti con diversi gruppi. Il metodo di dissezione è basata su standard, pratiche di Patologia Chirurgica, con ulteriori passaggi per l'annotazione delle regioni più importanti del pancreas seguita da intra-regionali suddivisioni. Standardizzazione dei metodi di trasformazione biospecimen è necessario per facilitare la raccolta di campioni di alta qualità esemplificate dalla pubblicazione delle migliori pratiche per la raccolta biospecimen dalle organizzazioni nazionali di biobanche come il National Cancer Institute 6. La biobanca di campioni di pancreas umano da parte dei donatori che rappresentano varie fasi del diabete e delle popolazioni di controllo adeguati è stata riportata 7-9. Tuttavia, i dettagli esatti per i campioni raccolti dalla regione della testa del pancreas sono mancati. Considerevole eterogeneità inter-individuale isolotto è ben noto with fino a 5 volte variazioni nella distribuzione di dimensione delle isole modo che annotazione della regione pancreatica è necessaria quando si analizza eterogeneità inerente 10. Elaborazione campioni pancreatici in formati standard aiuterà con risoluzione di fattori individuali del paziente in modo che gli altri fattori chiave alla base della malattia possono essere meglio risolti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano le famiglie dei donatori e le Organizzazioni Organ Procurement coinvolti in questa ricerca e di Maria Martino e Irina Kusmartseva per la loro assistenza di un esperto. Questo lavoro è stato finanziato dalla Juvenile Diabetes Research Foundation (MC-T., MA) a sostegno della rete per i donatori di organi del pancreas con diabete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection instruments including scalpels with 22 blades | Various | Various | |
| Centrifuge tubes (15 and 50 ml) | Fisher Scientific | 05-539-5, 430828 | Sterile |
| Cryotubes(1.8 ml) | VWR North America | 89004-300 | Sterile, bar codes optional |
| RNAlater | Ambion | AM7021 | |
| Surgical Pathology Ink | |||
| Cassettes | Mercedes Medical | CAS ECO109 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher Scientific | 23-245-685 | |
| OCT Freezing Media | TissueTek | 4583 | |
| Molds | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 58952 | Various sizes |
| Isopentane | Fisher Scientific | O3551-4 | OCT chilling bath |
| Dry ice | OCT chilling bath | ||
| Liquid nitrogen in Dewar flask | Snap freezing cryovials | ||
| Cell culture dish (100mm) | Corning | 430167 | Sterile |
| Hyclone DMEF | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30023.01 | Sterile, store refrigerated, glutamine included |
| Fetal Bovine Serum | Cellgro | 35-010-CV | Sterile, store frozen aliquots |
| Penicillin/Streptomycin/Antifungal | GIBCO, by Life Technologies | 15240-062 | Sterile, store frozen aliquots |
| Type 9 Paraffin | Richard-Allan Scientific | 8337 | |
| 1X D-PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | Sterile |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Make fresh, store refrigerated |
| 8% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16019 | Make fresh, store refrigerated |
| Biosafety Level 2 hood | Various | ||
| Ultra-low freezer | Various | ||
| Sakura Cassette Printer | Sakura Finetek | ||
| Sakura VIP300 | Sakura Finetek | Automatic paraffin processor | |
| Paraffin Embedding Station | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| Table 1. Specific reagents and equipment. | |||
References
- Brissova, M. Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy. J. Histochem. Cytochem. 53, 1087-1097 (2005).
- Rahier, J. The pancreatic polypeptide cells in the human pancreas: the effects of age and diabetes. J. Clin. Endocrinol. Metab. 56, 441-444 (1983).
- Uchida, T., Takada, T., Ammori, B. J., Suda, K., Takahashi, T. Three-dimensional reconstruction of the ventral and dorsal pancreas: a new insight into anatomy and embryonic development. J. Hepatobiliary Pancreat. Surg. 6, 176-180 (1999).
- Wittingen, J., Frey, C. F. Islet concentration in the head, body, tail and uncinate process of the pancreas. Ann. Surg. 179, 412-414 (1974).
- Rahier, J., Goebbels, R., Henquin, J. Cellular composition of the human diabetic pancreas. Diabetologia. 24, 366-371 (1983).
- Vaught, J. An NCI perspective on creating sustainable biospecimen resources. J. Natl. Cancer Inst. Monogr. 42, 1-7 (2011).
- Gianani, R. Initial results of screening of nondiabetic organ donors for expression of islet autoantibodies. J. Clin. Endocrinol. Metab. 91, 1855-1861 (2006).
- Tauriainen, S., Salmela, K., Rantala, I., Knip, M., Hyöty, H. Collecting high-quality pancreatic tissue for experimental study from organ donors with signs of β-cell autoimmunity. Diabetes Metab. Res. Rev. 26, 585-592 (2010).
- In't Veld, P. Screening for insulitis in adult autoantibody-positive organ donors. Diabetes. 56, 2400-2404 (2007).
- Töns, H. A., Terpstra, O. T., Bouwman, E. Heterogeneity of human pancreata in perspective of the isolation of the islets of langerhans. Transplant Proc. 40, 367-369 (2008).
